一种具有排铅功能的毛木耳糖肽及其制备方法与应用与流程

[0001]
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种具有排铅功能的毛木耳糖肽及其制备方法与应用。


背景技术：

[0002]
铅是一种有毒重金属，具有高使用率、低回收率及难降解的特点，对人体危害极大。除了自然原因环境中释放的铅，人类活动如原矿开采、冶炼和生产含铅制品会产生大量的污染，加上人们环保意识薄弱、环保机制的不完善等原因，铅污染形势十分严峻。铅污染主要存在于大气、土壤和食品中，环境中的铅可通过生物富集作用或直接接触最终进入人体。
[0003]
人体内的铅代谢相当缓慢，在血液和软组织中半衰期超过一个月，铅多与红细胞结合，或分布于各组织，肝、肾中含量最高，铅对各系统和器官均有毒性作用，主要影响神经系统、生殖系统、心血管系统、泌尿系统及血液等。铅对中枢和外周神经系统有直接的毒害作用，可导致忧郁或多动等性格改变，智力下降，感觉功能如视觉、听觉、嗅觉障碍以及肌肉损害。目前治疗铅中毒的药物主要有螯合剂类药物、金属硫蛋白、抗氧化剂及中药，不同的治疗方法在排铅的同时也会引发其他的问题，螯合剂类药物在排出铅毒的同时，会排出人体所必需的微量元素，有的药物会引发恶心、头晕、乏力的现象，甚至是肾损伤，天然提取物排铅疗效确切，毒副作用小在研究发展中有巨大的潜力。


技术实现要素：

[0004]
本发明所要解决的技术问题是如何降低人或动物体中的重金属铅含量或如何有效地排除人或动物体内的铅毒或如何降低重金属铅对人或动物的损害。
[0005]
为了解决以上技术问题，本发明提供了糖肽在制备治疗铅中毒的药物中的应用。
[0006]
本发明所提供的糖肽在制备治疗铅中毒的药物中的应用中，所述糖肽的名称为apl，来源于毛木耳；所述apl的n末端序列如序列表中序列1所示。
[0007]
上述应用中，所述糖肽可来自于毛木耳子实体。
[0008]
上述应用中，所述apl含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸及半乳糖醛酸。
[0009]
上述应用中，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的摩尔比为27.8：8：19.3：22.7：8.7：30：9。
[0010]
上述应用中，所述apl的分子量为34000道尔顿。
[0011]
上述应用中，所述糖肽是从毛木耳子实体水提液中提取出的，所述毛木耳子实体水提液是用水从毛木耳子实体中提取出来的水溶性物质。
[0012]
上述应用中，所述糖肽可按照下述方法制备：
[0013]
糖肽的制备方法，包括：
[0014]
b-1)制备名称为去除蛋白的毛木耳粗糖肽，所述去除蛋白的毛木耳粗糖肽的制备
方法包括用乙醇沉淀毛木耳子实体水提液，收集沉淀，去除所述沉淀中的蛋白后得到所述去除蛋白的毛木耳粗糖肽；所述毛木耳子实体水提液是用水从毛木耳子实体中提取出来的水溶性物质；
[0015]
b-2)从所述去除蛋白的毛木耳粗糖肽中分离纯化糖肽，得到名称为apl的糖肽。
[0016]
上述制备方法的b-2)步骤中，从所述去除蛋白的毛木耳粗糖肽中分离纯化糖肽包括：
[0017]
b-2-1)对所述去除蛋白的毛木耳粗糖肽进行阴离子交换柱层析，所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是deae，所采用的洗脱程序为两步洗脱，第一步洗脱用水洗脱，第二步洗脱用ph7.0的如下溶液洗脱：溶质是0.8m nacl、溶剂是水(即0.8m nacl水溶液)，收集第二步洗脱得到的洗脱峰，将该洗脱峰命名为洗脱峰d2；
[0018]
b-2-2)将所述洗脱峰d2进行凝胶过滤层析，得到分子量为34000道尔顿的糖肽该糖肽即为apl糖肽。
[0019]
上述糖肽的制备方法中，所述水可为去离子水。
[0020]
上述糖肽的制备方法中，所述凝胶过滤层析的层析介质可为superdex 200，洗脱缓冲液可为ph 8.5的0.2m nh
4
hco
3
水溶液。所述ph 8.5的0.2m nh
4
hco
3
水溶液是溶质为0.2m nh
4
hco
3
，溶剂是水的溶液。所述水可为超纯水。
[0021]
上述糖肽也属于本发明的保护范围。
[0022]
为了解决以上技术问题，本发明还提供了一种治疗铅中毒的药物。
[0023]
本发明所提供的治疗铅中毒的药物，含有上述糖肽。
[0024]
上述治疗铅中毒的药物的活性成分可为上述糖肽，上述治疗铅中毒的药物的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述治疗铅中毒的药物的其它活性成分本领域技术人员可根据铅去除的效果确定。
[0025]
上述治疗铅中毒的药物可含有药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可为稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；药学上可接受的载体可为湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；药学上可接受的载体可为崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
[0026]
本文中，治疗铅中毒可体现为下述至少一种：
[0027]
a1)抑制处于铅暴露环境下的动物血铅升高；
[0028]
a2)减少铅在动物体内的沉积；
[0029]
a3)降低铅中毒动物的血铅含量；
[0030]
a4)促进动物体内铅的排出；
[0031]
a5)提高动物肝的铅清除率；
[0032]
a6)降低铅对动物身体各系统和/或器官的损伤。
[0033]
本文中所述动物可为哺乳动物。
[0034]
实验结果表明，含有本发明所提取的糖肽apl各剂量组与模型组相比，均可以有效地清除肝中的铅，尤其是apl高剂量组，肝铅清除率达17.96％，效果优于阳性药物肝铅清除
率16.01％(表4)。说明本发明的糖肽apl能用于治疗铅中毒。
附图说明
[0035]
图1为deae-cellulose洗脱曲线。
[0036]
图2为fplc-superdex 200洗脱曲线。
[0037]
图3为糖肽apl红外光谱分析图。纵坐标为吸光度，横坐标为波数(cm-1
)。
[0038]
图4为糖肽apl的单糖及糖醛酸分析的hplc图谱。纵坐标为丰度(mau)，横坐标为时间(min)。
具体实施方式
[0039]
下述实施例中的糖肽appi按照2018年11月02日公开的公开号为cn108727474a的中国发明专利申请的实施例1中的方法制备。
[0040]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0041]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0042]
实施例1毛木耳糖肽的制备及其在排铅中的应用
[0043]
一、毛木耳糖肽的制备
[0044]
1供试材料
[0045]
毛木耳(auricularia polytricha(mont.)sacc.)3号(赵爽等.毛木耳菌丝体产多糖发酵条件的优化.食品科技.2012年第37卷第4期)，以下简称毛木耳。
[0046]
2毛木耳糖肽的分离与纯化
[0047]
2.1水提醇沉法提取粗糖肽
[0048]
将冷冻干燥的毛木耳子实体放入高速万能破碎机，反复破碎4次，每次20s，制成质地均一的干粉。破碎处理好的干粉，称取定量，按1:25的比例加入去离子水，在4℃的冰箱放置过夜，得到毛木耳混合溶液。毛木耳混合溶液在水浴前摇匀、封口，用水浴摇床控制温度和转速对其进行4h、90℃的高温水浴，水浴后混合物6000r/min离心30min，收集上清液(水溶性物质)，测定上清液体积，按照1:4的比例加入无水乙醇使多糖析出，搅拌均匀后盖上锡箔纸，静置12小时待固液分离，6000g离心20分钟收集沉淀，将沉淀放至60℃的烘箱中烘干直至质量恒定，研磨成粉末状,该粉末即为毛木耳粗糖肽。
[0049]
2.2毛木耳粗糖肽的分离与纯化
[0050]
用seveage法去除步骤1.2.1中的毛木耳粗糖肽中的蛋白质得到去除蛋白的毛木耳粗糖肽，具体方法如下：将步骤1.2.1中的毛木耳粗糖肽溶于去离子水中，得到毛木耳粗糖肽溶液。将是毛木耳粗糖肽溶液1/3体积的sevag试剂(由三氯甲烷和正丁醇按照4:1的体积比混合而成)加入毛木耳粗糖肽溶液中，涡旋震荡5min，以4500g离心15min，吸取上清液，去除游离蛋白产生的凝胶状沉淀。向上清液中加入是上清液体积1/3的sevag试剂涡旋震荡5min，以4500g离心15min，吸取上清液，如此重复多次直至获得无蛋白质层出现的上清液。
保留每次除蛋白后的上清液，合并上清液后加入无水乙醇获得糖肽沉淀，60℃烘干再用去离子水溶解，得到去除蛋白的毛木耳粗糖肽溶液。
[0051]
2.3去除蛋白的毛木耳粗糖肽溶液的阴离子交换柱层析分离纯化
[0052]
使用阴离子交换柱层析deae-cellulose进行纯化，所采用的阴离子交换基团是deae，deae-cellulose洗脱条件如下：去离子水平衡deae-cellulose层析柱(层析柱规格为1cm(内径)
×
30cm(柱长))，上样，样品为去除蛋白的毛木耳粗糖肽溶液，进行两步洗脱，流速均为1.5ml/min，从洗脱程序开始不间断收集洗脱出的液体，每管收集6ml，用硫酸-苯酚法测定每管收集的洗脱液的多糖浓度。第一步洗脱用去离子水洗脱，收集第一步洗脱得到的洗脱峰，将该洗脱峰定义为洗脱峰d1(即洗脱体积为7-18ml的洗脱液)；第二步洗脱用ph7.0的如下溶液洗脱：溶质是0.8m nacl、溶剂是去离子水，收集第二步洗脱得到的洗脱峰，将该洗脱峰定义为洗脱峰d2(即洗脱体积为37ml-48ml的洗脱液)(图1)。
[0053]
将洗脱峰d1和洗脱峰d2分别在蒸馏水中透析10-12小时后，加入4倍体积无水乙醇静置12小时后，离心收集沉淀，将该沉淀60℃烘干，研磨成粉末状，分别得到d1组分(来自洗脱峰d1)和d2组分(来自洗脱峰d2)。
[0054]
经体外铅吸附检测，确定d2组分具有排铅功能。
[0055]
150μl的样品中加入150μl 10ppm铅单元素标准溶液，室温混匀后置于振荡器160rpm/min充分震荡3h，反应结束后迅速加入四倍体积的无水乙醇并混匀，室温下静置1h，9000rpm/min转速下离心10min，吸取上清液，用5％的稀硝酸将取得的上清液定容至5ml，混匀。样品送至农业部饲料效价与安全监督检验测试中心利用z-2000原子吸收分光光度计-石墨炉法检测铅含量，以去离子水代替样品作为对照。
[0056]
糖肽对铅的吸附率：
[0057][0058]
2.4分子筛层析纯化d2组分
[0059]
d2组分经fplc-superdex 200凝胶过滤层析(fplc为ge公司的快速蛋白液相色谱仪，型号atkaexplorer；superdex 200为ge公司的层析介质)，洗脱缓冲液为ph 8.5的0.2m nh
4
hco
3
溶液(溶质为0.2m nh
4
hco
3
，溶剂是超纯水的溶液)，层析柱规格30cm(柱长)
×
1cm(内径)，流速为0.4ml/min。部分收集器收集洗脱液，从洗脱程序开始不间断收集洗脱出的液体，每管收集3ml，用硫酸-苯酚法测定每管收集的洗脱液的多糖浓度。收集多糖集中的洗脱峰(洗脱体积为13ml-18ml的洗脱液)，将该洗脱峰定义为apl洗脱峰(图2)。
[0060]
2.5超滤浓缩得到糖肽apl
[0061]
将apl洗脱峰在蒸馏水中透析10-12小时，在4℃进行截留分子量为5000道尔顿的超滤浓缩后，于-80℃条件下至完全冰冻，将冰冻样品冻干成粉备用，该干粉即为名称为apl的糖肽(简称糖肽apl)。
[0062]
3糖肽apl的分子特性分析
[0063]
3.1糖肽apl的红外光谱(ir)分析
[0064]
分别取1-2mg的糖肽apl，利用kbr压片法进行制片，采用傅里叶变换红外光谱仪nicolet is5进行检测分析。
[0065]
红外分析结果显示糖肽apl具有-oh，羟基的伸缩振动吸收峰，c＝o，c-h吸收峰等
明显的糖特征基团的结构，说明糖肽apl具有多糖结构(图3)。
[0066]
3.2糖肽apl的单糖及糖醛酸分析
[0067]
3.2.1、试剂
[0068]
三氟乙酸，乙腈(色谱纯)，磷酸盐缓冲溶液(ph＝6.8)，单糖及糖醛酸标准品(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖和半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)。
[0069]
3.2.2、样品分析方法
[0070]
3.2.2.1、完全酸水解：
[0071]
称取冻干的糖肽apl适量，加入2mol/l三氟乙酸溶液0.5ml，在120℃条件下水解120min。氮吹仪吹干。
[0072]
标准品处理：首先配制10mg/ml标准品溶液，放置于-20℃。用时取出融化，在可以密封的玻璃管中加入上述标准品各5μl，混匀。然后加入2mol/l tfa溶液0.5ml，与样品同时在120℃条件下水解120min。空气泵吹干。
[0073]
3.2.2.2、pmp衍生化：
[0074]
向水解干燥后得到的样品中加入溶于无水甲醇的0.5mol/l的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)试剂和0.3mol/l的naoh溶液各0.5ml，充分混匀后，水浴70℃反应30min。冷却至室温，加入0.3mol/l hcl 0.5ml，充分混匀。加入0.5ml氯仿，充分震荡萃取，离心(5000rpm，5min)去除氯仿层，共萃取三次。水层(不低于0.4ml)用0.22μm滤膜过滤后，待上机。
[0075]
3.2.2.3、仪器条件：
[0076]
色谱柱：shiseido c18柱(4.6
×
250mm,5μm)，
[0077]
流动相为0.1mol/l ph 6.8磷酸盐缓冲液(pb):乙腈为82:18(v/v)；
[0078]
流速为每分钟1.0ml/min；
[0079]
柱温为25℃；
[0080]
进样量10μl
[0081]
波长为245nm。
[0082]
仪器：agilent 1200高效液相色谱仪
[0083]
测定结果如下(图4)，结果表明糖肽apl含有单糖和糖醛酸，其中单糖有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖；糖醛酸有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸(表1)。甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的摩尔比为27.8：8：19.3：22.7：8.7：30：9。
[0084]
表1.糖肽apl的单糖及糖醛酸含量
[0085][0086]
1.3.3糖肽apl的n-端氨基酸序列测定
[0087]
采用自动化edman降解法对糖肽apl的n-端部分氨基酸序列进行测定，用hewlett packard 1000a配有hplc系统的蛋白序列测定仪测定n-端部分序列。结果显示apl n-端氨基酸序列为hddmgmsamm(序列表中序列1)，说明糖肽apl具有多肽结构。
[0088]
1.3.4糖肽apl的分子量
[0089]
凝胶过滤层析法测定糖肽apl的分子量，结果表明糖肽apl的分子量为34000道尔顿。
[0090]
二、毛木耳糖肽在排铅中的应用
[0091]
将步骤一中2.5制备的糖肽apl溶于生理盐水中，得到糖肽apl溶液。将公开号为cn108727474a的中国发明专利申请的实施例1步骤6制备的糖肽appi溶于生理盐水中，得到糖肽appi溶液。其中，糖肽appi的表征如公开号为cn108727474a的中国发明专利申请的第0081-0093段。将乙二胺四乙酸二钠钙盐(edta-2naca)溶于生理盐水中，得到edta-2naca溶液。
[0092]
实验设置三次重复，每次重复40只雄性sd大鼠(8周龄，体重150-180g)连续7d每天给予大剂量铅毒，具体为每天腹腔注射一次pb(ac)
2
溶液(溶质是pb(ac)
2
，溶剂是生理盐水)0.5ml，pb(ac)
2
的给药剂量为20mg/kg体重。停止注射pb(ac)
2
溶液恢复3d，随机分为8组，每组5只，分别为模型组(阴性对照组)、阳性对照组(注射阳性药物edta-2naca)、apl处理组(apl低剂量组、apl中剂量组、apl高剂量组)、appi处理组(appi低剂量组、appi中剂量组和appi高剂量组)。按照如下方式给药：
[0093]
apl低剂量组：每只小鼠连续30天每天1次腹腔注射pb(ac)
2
溶液0.5ml并灌胃给药糖肽apl溶液1.0ml，每次pb(ac)
2
的给药剂量为5mg/kg体重(给予小剂量铅毒)，每次糖肽apl的给药剂量为40mg/kg体重/d。
[0094]
apl中剂量组：每只小鼠连续30天每天1次腹腔注射pb(ac)
2
溶液0.5ml并灌胃给药糖肽apl溶液1.0ml，每次pb(ac)
2
的给药剂量为5mg/kg体重(给予小剂量铅毒)，每次糖肽apl的给药剂量为80mg/kg体重/d。
[0095]
apl高剂量组：每只小鼠连续30天每天1次腹腔注射pb(ac)
2
溶液0.5ml并灌胃给药糖肽apl溶液1.0ml，每次pb(ac)
2
的给药剂量为5mg/kg体重(给予小剂量铅毒)，每次糖肽apl的给药剂量为160mg/kg体重/d。
[0096]
appi低剂量组：每只小鼠连续30天每天1次腹腔注射pb(ac)
2
溶液0.5ml并灌胃给药糖肽appi溶液1.0ml，每次pb(ac)
2
的给药剂量为5mg/kg体重(给予小剂量铅毒)，每次糖肽appi的给药剂量为40mg/kg体重/d。
[0097]
appi中剂量组：每只小鼠连续30天每天1次腹腔注射pb(ac)
2
溶液0.5ml并灌胃给药糖肽appi溶液1.0ml，每次pb(ac)
2
的给药剂量为5mg/kg体重(给予小剂量铅毒)，每次糖肽appi的给药剂量为80mg/kg体重/d。
[0098]
appi高剂量组：每只小鼠连续30天每天1次腹腔注射pb(ac)
2
溶液0.5ml并灌胃给药糖肽appi溶液1.0ml，每次pb(ac)
2
的给药剂量为5mg/kg体重(给予小剂量铅毒)，每次糖肽appi的给药剂量为160mg/kg体重/d。
[0099]
阳性对照组：每只小鼠连续30天每天1次腹腔注射pb(ac)
2
溶液0.5ml并灌胃给药edta-2naca溶液1.0ml，每次pb(ac)
2
的给药剂量为5mg/kg体重(给予小剂量铅毒)，每次edta-2naca的给药剂量为300mg/kg体重/d。
[0100]
模型组：每只小鼠连续30天每天1次腹腔注射pb(ac)
2
溶液0.5ml并灌胃给药1.0ml的生理盐水，每次pb(ac)
2
的给药剂量为5mg/kg体重(给予小剂量铅毒)(表2)。
[0101]
从给药开始计，每6天眼眶取血，血液样品于-20℃冰箱保存，实验终点时麻醉大鼠，摘取大鼠的肝脏，真空冷冻干燥后研磨至粉状，-20℃冰箱保存实验结束期将血样与肝
脏样品酸解消化后送至农业部饲料效价与安全监督检验测试中心利用z-2000原子吸收分光光度计-石墨炉法检测铅含量，以铅标准溶液(北京北纳创联生物技术研究院)为标准品，采用标准曲线法(外标法)进行定量分析铅含量。
[0102]
肝铅去除率公式为:
[0103]
铅去除率(％)＝(模型组均值-实验组均值)/模型组均值
×
100％。
[0104]
试验所有数据采用spss12.0(spss inc.，usa)统计软件的独立样本t检验处理统计。
[0105]
表2.大鼠组别及对应给药处理
[0106][0107]
表3.体内实验各组大鼠血铅含量(μg/l)
[0108][0109][0110]
注：“*”显示与模型组具有显著性差异(p<0.05)，“#”显示与模型组具有极其显著性差异(p<0.01)n＝5。
[0111]
表4.体内实验各组大鼠肝铅的去除率
[0112] 肝铅去除率(％)模型组0
阳性对照组16.01apl低剂量组9.92apl中剂量组14.95apl高剂量组17.96appi低剂量组3.09appi中剂量组2.56appi高剂量组2.33
[0113]
铅进入人体后，首先以离子形态进入血液循环系统，研究发现含有本发明所提取的糖肽apl各剂量组与模型组相比，在给药处理12天以后，均可以有效地抑制处于铅暴露条件下的大鼠血铅升高，差异极显著(表3)，并且随着剂量的升高排铅效果越明显，但是appi组与模型组相比即使高剂量给药的条件下，也未表现出明显的血铅下降的趋势。铅进入人体后，随着血液循环会进入器官积蓄在机体组织中，对机体的免疫系统、泌尿系统等造成损伤。肝是体内最重要的排毒代谢腺体器官，检测肝铅可以反映出体内铅的沉积情况，实验结果表明，含有本发明所提取的糖肽apl各剂量组与模型组相比，均可以有效地清除肝中的铅，尤其是apl高剂量组，肝铅清除率达17.96％，效果优于阳性药物肝铅清除率16.01％(表4)。综上实验结果，本发明所提取的糖肽apl可以在铅进入大鼠体内后可以有效地清除大鼠肝中的铅。本发明的糖肽apl可以用于/或治疗铅中毒。

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