一种微滴数字PCR分析抗除草剂转基因大豆J12拷贝数的方法与流程

一种微滴数字pcr分析抗除草剂转基因大豆j12拷贝数的方法
技术领域
[0001]
本发明属于农业转基因生物安全评价技术领域，特别是涉及一种基于微滴数字pcr技术分析抗除草剂基因大豆新品种拷贝数的方法构建及其应用。


背景技术：

[0002]
伴随转基因技术的发展，转基因作物及其衍生食品的安全问题受到世界各个国家、组织和地区的强烈关注，对转基因作物的上市和推广规定了明确的政策和法规，对其开展严格的生物安全评价。表达载体、目的基因整合情况、外源插入序列表达情况等分子特征是转基因生物安全评价的重要内容，其中转基因作物中插入外源基因的拷贝数鉴定是关键参数。外源基因整合进入受体基因组的位置和拷贝数会影响目的基因的表达以及遗传稳定性，而插入基因的拷贝数相对其插入位点而言影响更为重要。当外源基因以低拷贝数（1-2个）整合到受体基因组时，通常能够稳定高效转录表达，多拷贝数的整合则会造成基因不稳定表达，甚至沉默。因此，鉴定转基因产品的外源基因插入拷贝数非常重要。
[0003]
目前，southern blot和实时荧光定量pcr是常用的两种外源基因拷贝数分析技术, 已广泛用于外源基因拷贝数分析。但这两种方法也存在一定缺陷，southern blot方法分析时工作量大、周期长、操作要求高、特别是对于多拷贝基因的分析，结果容易偏小；q rt-pcr方法在分析中需要构建标准曲线，利用标准曲线进行定量本身就是一种并不十分精确的相对定量方法，且标准曲线的质量易受到dna纯度、引物和探针的浓度、反应抑制因子等诸多因素影响，因此q rt-pcr不是理想的外源基因拷贝数分析方法。近年来，微滴式数字pcr（droplet-based digital pcr，dd pcr）是最新兴起的一项核酸检测技术。该技术不依赖任何校准物，无需构建标准曲线，以形成大量油包水微滴的形式对核酸进行成千上万倍稀释，然后以每个小微滴为独立的反应单元进行pcr反应，最后利用泊松分布原理，实现对核酸检测的绝对定量。相比其他方法，工作量小、周期短、操作要求低、准确性高、重复性好，已成为检测外源基因拷贝数的首选方法。
[0004]
抗除草剂转基因大豆j12是由中国农业科学院作物科学研究所研发的转g2-epsps基因和gat基因抗除草剂大豆新品系。研发人采用农杆菌介导转化法，将转g2-epsps和gat的两个基因的表达载体dna导入大豆受体中，通过多代筛选获得对草甘膦具有抗性的j12转化体，针对我国大豆生产草荒普遍严重，创制转基因大豆自主知识产权新材料，为提高我国转基因大豆产业竞争力提供科技支撑，在我国具有重要产业化应用前景。本研究以j12的g2-epsps和gat外源插入目的基因序列、3
’
端转化体特异性序列为靶标，以lectin为内标准基因，通过引物探针筛选、特异性测试等建立了微滴式数字pcr拷贝数分析方法，旨在为该转化体的安全评价、行政监管和知识产权保护提供重要的技术支撑。


技术实现要素：

[0005]
本发明克服了southern blot和实时荧光定量pcr两种常用的外源基因拷贝数分析技术工作量大、周期长、操作要求高等缺陷，提供了一种快速、简便、精准分析转基因大豆
新品系j12的外源目的基因在基因组插入拷贝数的方法。本发明的目的是建立转基因大豆新品系j12微滴数字pcr拷贝数分析方法，该方法较其他方法具有工作量小、周期短、操作要求低、准确性高、重复性好等优势。
[0006]
本发明的技术内容如下：一种用于分析抗除草剂转基因大豆j12拷贝数的引物及探针，其特征在于包括g2-epsps外源插入目的基因序列：正向引物序列：5
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tcgagattgatggtggtttgtc-3
’
反向引物序列：5
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tcagcgccacttcaatcg-3
’
探针序列：fam-gggcaaactgatttccatagctt-bhq1；gat外源插入目的基因序列：正向引物序列：5
’-
gggcaaactgatttccatagctt-3
’
反向引物序列：5
’-
cctcggagctggtactgtttct-3
’
探针序列：fam-attccaccaggccgagcactcaga-bhq1；3
’
端转化体特异性序列：正向引物序列：5
’-
gcagcttgagcttggatcaga-3
’
反向引物序列：5
’-
tcatagcgtggtgtttgacataaa-3
’
探针序列：fam-tgtcgtttcccgccttcagtttaaacc-bhq1；内源基因lectin基因序列：正向引物序列：5
’-
gccctctactccaccccca-3
’
反向引物序列：5
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gcccatctgcaagccttttt-3
’
探针序列：fam-agcttcgccgcttccttcaacttcac-bhq1；本发明进一步公开了用于分析抗除草剂转基因大豆j12拷贝数的方法，其特征在于如下步骤：（1）g2-epsps外源插入目的基因序列：正向引物序列：5
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tcgagattgatggtggtttgtc-3
’
反向引物序列：5
’-
tcagcgccacttcaatcg-3
’
探针序列：fam-gggcaaactgatttccatagctt-bhq1；gat外源插入目的基因序列：正向引物序列：5
’-
gggcaaactgatttccatagctt-3
’
反向引物序列：5
’-
cctcggagctggtactgtttct-3
’
探针序列：fam-attccaccaggccgagcactcaga-bhq1；3
’
端转化体特异性序列：正向引物序列：5
’-
gcagcttgagcttggatcaga-3
’
反向引物序列：5
’-
tcatagcgtggtgtttgacataaa-3
’
探针序列：fam-tgtcgtttcccgccttcagtttaaacc-bhq1；内源基因lectin基因序列：正向引物序列：5
’-
gccctctactccaccccca-3
’
反向引物序列：5
’-
gcccatctgcaagccttttt-3
’
探针序列：fam-agcttcgccgcttccttcaacttcac-bhq1；
（2）pcr反应体系：总体积为20 μl，包括bio-rad ddpcr supermix for probes 10 μl，10
ꢀµ
mol/l上游引物1 μl，10
ꢀµ
mol/l下游引物1 μl，10
ꢀµ
mol/l探针1 μl，25 ng/μl dna模板1 μl，最终用无菌水补充至20 μl；（3）微滴生成：将20 μl反应体系小心转移至微卡发生器，避免产生气泡，同时与微卡发生器相应位置加入微滴生成油70 μl，盖上垫片，放入微滴生成器中生成微滴，微滴生成后用移液器倾斜30-45度吸取40 μl反应产物，小心转移至数字96孔反应板中，170℃热封膜；（4）pcr反应程序：94 ℃预变性热激活10 min，1个循环；94 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，40个循环；98℃酶失活10 min，1个循环；（5）结果分析：微滴数字pcr仪自动计算每个反应的拷贝数浓度、总微滴数和阳性微滴数，总微滴数大于10000以上视为有效结果，按照公式a=b/c，计算出试样中抗除草剂转基因大豆j12的外源目的基因在基因组插入的拷贝数；公式中a为抗除草剂转基因大豆j12的外源目的基因在基因组插入的拷贝数，b为抗除草剂转基因大豆j12外源基因序列的拷贝数浓度，c为内参基因lectin基因的拷贝数浓度。
[0007]
本发明更进一步公开了用于分析转基因大豆j12拷贝数的特异性引物及探针在用于微滴数字pcr技术快速高效分析转基因大豆j12拷贝数方面的应用。实验结果显示该方法大大提高了工作效率，具有快速、灵活、高效、所需样本量少等优点，可快捷简便高效的用于对转基因大豆j12品系拷贝数分析，并可为其他转基因大豆品系及其他转基因作物的微滴式数字pcr拷贝数分析方法建立提供参考。
[0008]
本发明主要考察了微滴数字pcr技术分析转基因大豆j12拷贝数的引物探针的特异性和微滴的扩增效果，同时利用3
’
端转化体特异性序列的拷贝数验证转基因大豆j12新品系的纯合性，重点是解决微滴数字pcr技术分析转基因大豆j12拷贝数方法的建立，本发明的创新点在于首次建立了微滴数字pcr方法分析转基因大豆新品系j12的外源目的基因在基因组插入拷贝数的方法，为转基因大豆新品系分子特征检测提供了可靠的技术手段。
[0009]
本发明试验效果如下：（1）以转基因玉米混合样、转基因大豆混合样、转基因油菜混合样、转基因水稻混合样、转基因棉花混合样和非转基因大豆的基因组dna为模板，对g2-epsps和gat外源插入目的基因引物、3
’
端转化体特异性引物，进行微滴数字pcr扩增。结果见图1-3，只有以抗除草剂转基因大豆j12基因组dna为模板时生成有阳性微滴，而以其他转基因作物和非转基因大豆基因组dna为模板时，没有检测到阳性微滴生成，表明本检测方法的特异性良好。
[0010]
（2）以抗除草剂转基因大豆j12的基因组dna为模板，以大豆内标准基因lectin为参照基因，应用构建的微滴数字pcr检测体系，对进行微滴数字pcr分析，测定每个基因的拷贝数浓度。结果见图4-6，大豆内标准lectin基因和g2-epsps外源插入目的基因的拷贝数浓度分别为2780 copies/μl和2620 copies/μl，大豆内标准lectin基因和gat外源插入目的基因的拷贝数浓度分别为1370 copies/μl和1340 copies/μl，大豆内标准lectin基因和3
’
端转化体特异性序列的拷贝数浓度分别为955 copies/μl和909 copies/μl。
[0011]
（3）计算试样中抗除草剂转基因大豆j12拷贝数将抗除草剂转基因大豆j12目的基因和转化体特异性序列的拷贝数浓度和内源基因lectin的拷贝数浓度带入公式，计算出试样中抗除草剂转基因大豆j12的外源目的基因在基因组插入的拷贝数。计算试样中抗除草剂转基因大豆j12拷贝数的公式：
式中：a—试样中抗除草剂转基因大豆j12的外源目的基因在基因组插入的拷贝数；b—抗除草剂转基因大豆j12的外源目的基因拷贝数浓度；c—lectin内源基因拷贝数浓度；试验结论：本研究建立了微滴式数字pcr分析转基因大豆j12拷贝数的方法。该方法以抗除草剂转基因大豆j12新品系的g2-epsps和gat外源插入目的基因序列、3
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端转化体特异性序列为靶序列，设计了pcr扩增引物和taqman探针，并对引物探针特异性进行了鉴定，同时以大豆内标准lectin基因为参照，建立了微滴式数字pcr拷贝数检测体系。特异性实验结果显示，只有以抗除草剂转基因大豆j12基因组dna为模板才有扩增信号；用单株转基因大豆j12基因组dna，进行外源目的基因g2-epsps和gat、3
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端转化体特异性序列的微滴数字pcr扩增，转基因大豆j12的外源目的基因g2-epsps和gat在基因组上的插入拷贝数分别为0.94、0.98，同时3
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端转化体特异性序列的拷贝数为0.95，验证单株转基因大豆j12为纯合子，因此鉴定该单株转基因大豆j12为单拷贝插入。结果表明本研究建立的转基因大豆j12拷贝数分析方法工作量小、周期短、操作要求低、准确性高、重复性好，可快捷简便高效的用于对转基因大豆j12新品系的拷贝数分析，同时验证转基因大豆材料的纯合性，并可为其他转基因大豆品系及其他转基因作物的微滴式数字pcr拷贝数分析方法建立提供参考。
附图说明
[0012]
图1：外源目的基因g2-epsps微滴数字pcr特异性检测结果；如图标注：1-2，空白对照；3-4，转基因耐除草剂大豆j12；5-6，非转基因大豆样品；7-8，转基因玉米混样；9-10，其它转基因大豆混样；11-12，转基因油菜混样；13-14，转基因水稻混样；15-16，转基因棉花混样；图2：外源目的基因gat微滴数字pcr特异性检测结果；如图标注：1-2，空白对照；3-4，转基因耐除草剂大豆j12；5-6，非转基因大豆样品；7-8，转基因玉米混样；9-10，其它转基因大豆混样；11-12，转基因油菜混样；13-14，转基因水稻混样；15-16，转基因棉花混样；图3：3
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端转化体特异性序列微滴数字pcr特异性检测结果；如图标注：1-2，空白对照；3-4，转基因耐除草剂大豆j12；5-6，非转基因大豆样品；7-8，转基因玉米混样；9-10，其它转基因大豆混样；11-12，转基因油菜混样；13-14，转基因水稻混样；15-16，转基因棉花混样；图4：微滴数字pcr外源目的基因g2-epsps和内源lectin基因扩增结果；如图标注：1-2，内源lectin基因拷贝数浓度；3-4，外源目的基因g2-epsps拷贝数浓度；（上图为微滴扩增，下图为拷贝数浓度）；图5：微滴数字pcr外源目的基因gat和内源lectin基因扩增结果；如图标注：1-2，内源lectin基因拷贝数浓度；3-4，外源目的基因gat拷贝数浓度（上图为微滴扩增，下图为拷贝数浓度）；图6：微滴数字pcr 3
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端转化体特异性序列和内源lectin基因扩增结果；如图标注：1-2，内源lectin基因拷贝数浓度；3-4，3
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端转化体特异性序列拷贝数浓度（上图为微滴扩增，下图为拷贝数浓度）。
具体实施方式
[0013]
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售，抗除草剂转基因大豆j12由中国农业科学院作物科学研究所研发，可对外免费提供用于科研的研究使用。
[0014]
实施例1（1）样品1：转基因抗除草剂大豆j12随机单株样品。
[0015]
（2）试剂：bio-rad ddpcr supermix for probes预混液；上海生工合成的大豆内源lectin基因、外源目的基因和转化体特异性序列扩增引物和探针。
[0016]
g2-epsps外源插入目的基因序列：正向引物序列：5
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tcgagattgatggtggtttgtc-3
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反向引物序列：5
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tcagcgccacttcaatcg-3
’
探针序列：fam-gggcaaactgatttccatagctt-bhq1；gat外源插入目的基因序列：正向引物序列：5
’-
gggcaaactgatttccatagctt-3
’
反向引物序列：5
’-
cctcggagctggtactgtttct-3
’
探针序列：fam-attccaccaggccgagcactcaga-bhq1；3
’
端转化体特异性序列：正向引物序列：5
’-
gcagcttgagcttggatcaga-3
’
反向引物序列：5
’-
tcatagcgtggtgtttgacataaa-3
’
探针序列：fam-tgtcgtttcccgccttcagtttaaacc-bhq1；内源基因lectin基因序列：正向引物序列：5
’-
gccctctactccaccccca-3
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反向引物序列：5
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gcccatctgcaagccttttt-3
’
探针序列：fam-agcttcgccgcttccttcaacttcac-bhq1；（3）pcr反应体系：总体积为20 μl，包括bio-rad ddpcr supermix for probes 10 μl，上游引物（10
ꢀµ
mol/l）1 μl，下游引物（10
ꢀµ
mol/l）1 μl，探针（10
ꢀµ
mol/l）1 μl，dna模板（25 ng/μl）1 μl，最终用无菌水补充至20 μl。
[0017]
（4）微滴生成：将20 μl反应体系小心转移至微卡发生器，避免产生气泡，同时与微卡发生器相应位置加入微滴生成油70 μl，盖上垫片，放入微滴生成器中生成微滴，微滴生成后用移液器倾斜30-45度吸取40 μl反应产物，小心转移至数字96孔反应板中，170℃热封膜；（5）pcr反应程序：94 ℃预变性热激活10 min，1个循环；94 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，40个循环；98℃酶失活10 min，1个循环。
[0018]
（6）微滴数字pcr仪自动计算每个反应的拷贝数浓度、总微滴数和阳性微滴数，总微滴数大于10000以上视为有效结果。按照公式a=b/c，计算出试样中抗除草剂转基因大豆j12的外源目的基因在基因组上插入的拷贝数。将抗除草剂转基因大豆j12外源基因序列的
拷贝数浓度和内源基因lectin的拷贝数浓度带入公式。
[0019]
结果见表1，计算出试样中抗除草剂转基因大豆j12的外源目的基因在基因组上插入的拷贝数分别为0.94、0.98，鉴定为单拷贝插入，且通过转化体特异性序列的拷贝数鉴定单株大豆为纯合子。
[0020]
式中：a—试样中抗除草剂转基因大豆j12的外源目的基因在基因组插入的拷贝数；b—抗除草剂转基因大豆j12外源基因序列的拷贝数浓度；c—lectin内源基因的拷贝数浓度；表1 随机单株样品测试结果试验结论：应用本研究建立的微滴式数字pcr分析转基因大豆j12拷贝数的方法，用单株转基因大豆j12基因组dna，进行外源目的基因g2-epsps和gat、3
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端转化体特异性序列的微滴数字pcr扩增，转基因大豆j12的外源目的基因g2-epsps和gat在基因组上的插入拷贝数分别为0.94、0.98，同时3
’
端转化体特异性序列的拷贝数为0.95，验证单株转基因大豆j12为纯合子，因此鉴定该单株转基因大豆j12为单拷贝插入。结果表明本研究建立的转基因大豆j12拷贝数分析方法工作量小、周期短、操作要求低、准确性高、重复性好，可快捷简便高效的用于对转基因大豆j12新品系的拷贝数分析，同时验证转基因大豆材料的纯合性，并可为其他转基因大豆品系及其他转基因作物的微滴式数字pcr拷贝数分析方法建立提供参考。
[0021]
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。

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