一种脂肪酶催化制备甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的方法与流程

2021-02-02 10:02:05|

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[0001]
本发明涉及甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的合成方法，具体是一种脂肪酶催化制备甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的方法，属于材料科学领域。

背景技术：

[0002]
人工聚肽是以天然氨基酸为单体进行聚合反应，通过酰胺键而形成的聚氨基化合物，性质与天然肽、聚氨基酸和蛋白质类似。由人工聚肽形成的材料具有良好的生物亲和性和可降解性。聚肽或其改性低聚物表现出自组装、液晶行为等独特结构性质，具有较强可塑性，在生物、医药和天然高分子材料领域具有很大的应用潜力。聚乙二醇化可以改善肽在体内给药的水溶性和稳定性，并降低免疫原性。聚乙二醇化的肽能够自组装形成各种超结构，如纳米管，胶束，原纤维和有机凝胶。
[0003]
氨基酸聚合法有固相法、nca法和酶催化法。肽的聚乙二醇化的方法有：n端修饰法、羧基修饰法和巯基修饰法。与化学反应方法相比，酶催化法具有反应条件温和、环境更友好、副反应少等优点，而且避免了繁琐的保护和去保护步骤。
[0004]
因此，寻找一种合适的酶催化合成甘氨酸寡肽及其接枝聚乙二醇的方法具有积极的意义。

技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于针对化学法合成甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物中存在的不足之处，提供一种反应条件温和、环境更友好的酶法制备甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的方法。
[0006]
本发明的第一个目的是提供一种脂肪酶催化制备甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的方法，所述方法包括如下步骤：
[0007]
(1)蛋白酶催化合成甘氨酸寡肽；
[0008]
(2)脂肪酶催化甘氨酸寡肽接枝聚乙二醇制备甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物。
[0009]
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述蛋白酶催化合成甘氨酸寡肽的方法包括：在磷酸缓冲液中加入l-甘氨酸甲酯盐酸盐、二甲亚砜和蛋白酶，在30～70℃下反应5～10小时；反应结束后，离心取沉淀，洗涤，冷冻干燥后得到甘氨酸寡肽。
[0010]
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述蛋白酶包括菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的任一种，所述蛋白酶的添加量为1～10u/g l-甘氨酸甲酯盐酸盐。
[0011]
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述磷酸缓冲液为0.1～0.2m的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，磷酸缓冲液的ph值为5.5～8.0。
[0012]
在本发明的一种实施方式中，所述l-甘氨酸甲酯盐酸盐和磷酸缓冲液的质量g体积ml比为1:1～6。
[0013]
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述二甲亚砜的体积为2.5～25％的磷酸缓冲液。
[0014]
在本发明的一种实施方式中，反应混合物在恒温振荡器中(600rpm)中进行反应。
[0015]
在本发明的一种实施方式中，所述离心是反应混合物在5000～10000rpm下离心2～6min。
[0016]
在本发明的一种实施方式中，所述洗涤是用水和冰乙醇各洗2～4次。
[0017]
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述脂肪酶催化甘氨酸寡肽接枝聚乙二醇制备甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的方法包括如下步骤：
[0018]
在无水三氯乙烷中加入步骤(1)制备得到的甘氨酸寡肽、聚乙二醇单甲醚和脂肪酶，于绝对压力0～101.325kpa和30～50℃下反应10～24h；反应结束后，将反应混合物在-4～0℃静置8～20h，减压抽滤，将滤液干燥，再加入预热后的丙酮搅拌直至全部溶解，将所得溶液在-4～0℃静置8～20h，减压抽滤，所得沉淀即为甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物。
[0019]
在本发明的一种实施方式中，所述甘氨酸寡肽和聚乙二醇单甲醚与无水三氯乙烷的质量g体积ml为1:1.2～3，其中，甘丙氨酸寡肽、聚乙二醇单甲醚的重量比为1:1.2～1:5。
[0020]
在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇单甲醚的平均分子量为200、400或1000da。
[0021]
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶的添加量为1～10u/g底物，所述底物为甘氨酸寡肽和聚乙二醇单甲醚。
[0022]
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶为爪哇毛霉菌脂肪酶m、黑曲霉脂肪酶a、米曲霉脂肪酶、疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶中的任一种。
[0023]
在本发明的一种实施方式中，所述反应在搅拌下进行，搅拌速度为100～500rpm。
[0024]
在本发明的一种实施方式中，所述干燥优选真空干燥，操作参数为：在30～60℃下真空干燥4～12小时。
[0025]
在本发明的一种实施方式中，所述甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的产率为45～75％。
[0026]
在本发明的一种实施方式中，通过
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h nmr手段检测甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的取代度，为1.01～1.1。
[0027]
在本发明的一种实施方式中，
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hnmr的检测方法如下：使用avance-hd-400mhz核磁共振谱仪，以cf
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cood为溶剂，四甲基硅烷(tms)为内标，在室温下测定共聚物的
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h nmr谱图。
[0028]
本发明的第二个目的是提供上述制备方法在生物、医药和天然高分子材料领域的应用。
[0029]
本发明与现有技术相比，主要具有以下优点：
[0030]
本发明的甘氨酸寡肽由酶催化方法合成，条件温和、无污染，产率高达50～70％。且本发明的甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物通过脂肪酶催化合成，与化学方法相比，条件温和、环境更友好、副反应少，而且避免了繁琐的保护和去保护步骤，产率可达45～75％。
具体实施方式
[0031]
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0032]
实施例1
[0033]
(1)蛋白酶催化合成甘氨酸寡肽
[0034]
在2.0ml、0.1m、ph5.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)中加入0.5g的l-甘氨酸甲酯盐酸盐(国药集团化学试剂有限公司)、二甲亚砜(国药集团化学试剂有限公司)和2u胰蛋白酶(上海沃凯生物技术有限公司)。二甲亚砜的体积分数为2.5％磷酸缓冲液。将反应混合物置于恒温振荡器中(600rpm)在30℃下反应10小时。反应结束后，将反应混合物在10000rpm下离心3分钟，沉淀用去离子水和冰乙醇各洗两次，冷冻干燥后得到产物甘氨酸寡肽。
[0035]
(2)甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的制备
[0036]
在15ml无水三氯乙烷(国药集团化学试剂有限公司)中加入5g的甘氨酸寡肽、聚乙二醇单甲醚200(国药集团化学试剂有限公司)和10u的爪哇毛霉菌脂肪酶m(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。甘丙氨酸寡肽、聚乙二醇单甲醚的重量比为1:1.2。反应混合物于绝对压力10.1kpa和50℃下搅拌(200rpm)反应10h。反应结束后，将反应混合物在0℃静置过夜，减压抽滤。将滤液在30℃下真空干燥6小时后，加入预热到40℃的丙酮，搅拌直至全部溶解。将所得溶液在0℃静置过夜，减压抽滤，所得沉淀为甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物，产率为45％。通过
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h nmr手段检测甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的取代度，为1.01。
[0037]
实施例2
[0038]
(1)蛋白酶催化合成酪氨酸寡肽
[0039]
在2.5ml、0.15m、ph7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)中加入1g的l-甘氨酸甲酯盐酸盐(国药集团化学试剂有限公司)、二甲亚砜(国药集团化学试剂有限公司)和3.5u木瓜蛋白酶(上海沃凯生物技术有限公司)。二甲亚砜的体积分数为15％磷酸缓冲液。将反应混合物置于恒温振荡器中(600rpm)在30℃下反应8小时。反应结束后，将反应混合物在10000rpm下离心3分钟，沉淀用去离子水和冰乙醇各洗两次，冷冻干燥后得到产物甘氨酸寡肽。
[0040]
(2)甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的制备
[0041]
在12ml无水三氯乙烷(国药集团化学试剂有限公司)中加入8g的甘氨酸寡肽、聚乙二醇单甲醚400(国药集团化学试剂有限公司)和20u的米曲霉脂肪酶(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。甘丙氨酸寡肽、聚乙二醇单甲醚的重量比为1:1.5。反应混合物于绝对压力101.325kpa和40℃下搅拌(200rpm)反应14h。反应结束后，将反应混合物在0℃静置10小时，减压抽滤。将滤液在30℃下真空干燥6小时后，加入预热到40℃的丙酮，搅拌直至全部溶解。将所得溶液在-1℃静置12小时，减压抽滤，所得沉淀为甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物，产率为65％。通过
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h nmr手段检测甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的取代度，为1.0。
[0042]
实施例3
[0043]
(1)蛋白酶催化合成酪氨酸寡肽
[0044]
在2.5ml、0.2m、ph 8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)中加入1g的l-甘氨酸甲酯盐酸盐(国药集团化学试剂有限公司)、二甲亚砜(国药集团化学试剂有限公司)和3.5u碱性蛋白酶(上海沃凯生物技术有限公司)。二甲亚砜的体积分数为25％磷酸缓冲液。将反应混合物置于恒温振荡器中(600rpm)在70℃下反应5小时。反应结束后，将反应混合物在10000rpm下离心3分钟，沉淀用去离子水和冰乙醇各洗两次，冷冻干燥后得到产物甘氨酸寡肽。
[0045]
(2)甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的制备
[0046]
在14ml无水三氯乙烷(国药集团化学试剂有限公司)中加入10g的甘氨酸寡肽、聚乙二醇单甲醚1000(国药集团化学试剂有限公司)和50u的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。甘丙氨酸寡肽、聚乙二醇单甲醚的重量比为1:1.2。反应混合物于绝对压力50.5kpa和50℃下搅拌(200rpm)反应24h。反应结束后，将反应混合物在-4℃静置20小时，减压抽滤。将滤液在30℃下真空干燥6小时后，加入预热到40℃的丙酮，搅拌直至全部溶解。将所得溶液在0℃静置8小时，减压抽滤，所得沉淀为甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物，产率为75％。通过
1
h nmr手段检测甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的取代度，为1.0。
[0047]
实施例4
[0048]
(1)蛋白酶催化合成酪氨酸寡肽
[0049]
在5ml、0.1m、ph 7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)中加入2g的l-甘氨酸甲酯盐酸盐(国药集团化学试剂有限公司)、二甲亚砜(国药集团化学试剂有限公司)和5u碱性蛋白酶(上海沃凯生物技术有限公司)。二甲亚砜的体积分数为15％磷酸缓冲液。将反应混合物置于恒温振荡器中(600rpm)在50℃下反应5小时。反应结束后，将反应混合物在10000rpm下离心3分钟，沉淀用去离子水和冰乙醇各洗两次，冷冻干燥后得到产物甘氨酸寡肽。
[0050]
(2)甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的制备
[0051]
在10ml无水三氯乙烷(国药集团化学试剂有限公司)中加入8g的甘氨酸寡肽、聚乙二醇单甲醚1000(国药集团化学试剂有限公司)和30u的黑曲霉脂肪酶a(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。甘丙氨酸寡肽、聚乙二醇单甲醚的重量比为1:1.15。反应混合物于绝对压力50.5kpa和40℃下搅拌(200rpm)反应20h。反应结束后，将反应混合物在0℃静置8小时，减压抽滤。将滤液在30℃下真空干燥10小时后，加入预热到40℃的丙酮，搅拌直至全部溶解。将所得溶液在0℃静置20小时，减压抽滤，所得沉淀为甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物，产率为65％。通过
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h nmr手段检测甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的取代度，为1.05。
[0052]
对比例1
[0053]
当实施例1的步骤(2)采用其他常见的脂肪酶，如南极假丝酵母的脂肪酶b时，其他操作步骤和参数和实施例1相同。反应结束后，产物的产率仅为12％。通过
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h nmr手段检测甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物的取代度，为1。
[0054]
对比例2
[0055]
当实施例1的步骤(2)中的溶剂为无水乙醇(非三氯乙烷)时，其余操作步骤和参数和实施例1相同，反应结束后，将反应混合物在0℃静置20小时，减压抽滤。将滤液在30℃下真空干燥6小时后，检测未发现产物甘氨酸寡肽-聚乙二醇共聚物。
[0056]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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