一株地衣芽孢杆菌Scu-01及其应用的制作方法

一株地衣芽孢杆菌scu-01及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及微生物食品加工技术领域，更具体的说是涉及一株地衣芽孢杆菌scu-01及其应用。


背景技术：

[0002]
四甲基吡嗪是白酒发酵产物中重要的风味物质，具有烘烤、榛子、花生和可可香气，乙偶姻和2,3-丁二醇是构成名优白酒进口喷香、醇甜、回味绵长的重要成分。经研究证实这些组分的生成与芽孢杆菌存在密切联系。目前已报道的发酵白酒的芽孢杆菌菌株通常只涉及产四甲基吡嗪单一组分的提高，未充分考虑到白酒风味的协调性，存在菌株功能单一、综合性能不足等缺点，菌种传代不具有稳定性，导致白酒品质下降。
[0003]
因此，提供一株地衣芽孢杆菌scu-01及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明提供了一株地衣芽孢杆菌scu-01及其应用。
[0005]
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006]
一株地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)scu-01，保藏编号为cctcc no：m2018220，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2018年04月19日，分类命名为芽孢杆菌scu-01，bacillus sp.scu-01。
[0007]
进一步，地衣芽孢杆菌scu-01在发酵酿酒中的应用。
[0008]
进一步，地衣芽孢杆菌scu-01在制作小曲中的应用。
[0009]
进一步，地衣芽孢杆菌scu-01在制作小曲中的应用，具体操作如下：将od
600
＝2.4～3.0的地衣芽孢杆菌scu-01菌悬液以6％-8％(v/v)的接种量接种到麦料上。
[0010]
进一步，地衣芽孢杆菌scu-01在高产四甲基吡嗪、2,3-丁二醇和乙偶姻中的应用。
[0011]
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株地衣芽孢杆菌scu-01及其应用，地衣芽孢杆菌scu-01能够显著提高小曲挥发性物质四甲基吡嗪、乙偶姻、2,3-丁二醇含量，且遗传性能稳定，具有良好的开发应用前景。
附图说明
[0012]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0013]
图1附图为本发明地衣芽孢杆菌scu-01在营养肉汤固体培养基培养的菌落形态；
[0014]
图2附图为本发明地衣芽孢杆菌scu-01的电镜扫描图；
[0015]
图3附图为本发明地衣芽孢杆菌scu-01的系统进化树；
[0016]
图4附图为本发明地衣芽孢杆菌scu-01和标准菌株比较的优势组分；
[0017]
图5附图为本发明地衣芽孢杆菌scu-01发酵产物(酸类、醇类等)的传代稳定性；
[0018]
图6附图为本发明地衣芽孢杆菌scu-01发酵产物(乙偶姻、2,3-丁二醇、四甲基吡嗪)的传代稳定性。
具体实施方式
[0019]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0020]
实施例1菌株的分离筛选
[0021]
以茅台镇酱香大曲为原料，选择营养肉汤固体培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，去离子水1000ml，琼脂20g)，分别取酱香大曲各部分的曲粉2g于装有无菌玻璃珠及45ml生理盐水的150ml三角瓶中打散，经80℃水浴处理30min后获得芽孢悬液，将芽孢悬液按系列稀释涂布到平板上，37℃恒温培养，再挑取菌落进行平板划线得到单菌落，共得到120种单菌落，接种到麦料(麦料购买于成都雄健粉业有限公司)上测定挥发性成分，筛选出一株能显著增加小曲挥发性物质的种类、改善主要挥发性物质的含量的菌株，将其命名为地衣芽孢杆菌scu-01(bacillus licheniformis scu-01)，下述简称scu-01。
[0022]
实施例2菌株鉴定
[0023]
(1)菌株的形态特征：地衣芽孢杆菌scu-01为革兰氏阳性菌，在营养肉汤固体培养基形状不规则、白色不透明、中凸、干燥有折皱、有缘毛、牢固附着在培养基上不易挑起，scu-01菌株稀释涂布得到多个单菌落，见图1。对菌株进行扫描电镜观察，结果见图2，在电镜下菌体都呈杆状，尺寸均为0.40-0.68μm
×
1.12-2.50μm，单个或成对排列。
[0024]
(2)菌株的理化性质：氧需求、接触酶活性、氧化酶活性、明胶水解活性，淀粉水解活性和纤维素水解活性，主要参照《伯杰氏细菌鉴定手册》。结果表明，地衣芽孢杆菌scu-01：葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、肌醇发酵呈阳性，鼠李糖、乳糖、山梨醇、甘露醇发酵呈阴性，环糊精、糊精、熊果苷发酵不定，v-p试验、过氧化氢酶反应呈阳性，氧化酶反应呈阴性。最高耐盐度可达12％，ph范围5.0-9.0。
[0025]
(3)16s rrna基因测序及进化树构建
[0026]
提取scu-01菌株dna：将scu-01菌株37℃、180r/min培养24h后，按照uniq-10柱式细菌基因组dna抽提试剂盒操作手册提取裂解液总dna，dna提取后放入-20℃保存备用。
[0027]
pcr引物：细菌通用引物27f和1492r。
[0028]
27f：5
’-
agagtttgatcmtggctcag-3
’
；seq id no.1；
[0029]
1492r：5
’-
tacggytaccttgttacgactt-3
’
；seq id no.2；
[0030]
pcr反应条件：94℃预变性3min，95℃变性30s，52℃退火30s；72℃延伸1min 45s，循环35次，最后再72℃保温10min。反应结束后取适量pcr样品与染料混匀，经1％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0031]
16s rrna序列获得：pcr产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序。测序结束后，将scu-01的16s rrna序列(seq id no.3)提交至ncbi进行在线比对服务检索相似性序
列，并通过软件mega构建系统发育树，结果见图3。
[0032]
scu-01的16s rrna序列：
[0033]
tgcaagtcgagcggaccgacgggagcttgctcccttaggtcagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatgcttgattgaaccgcatggttcaatcataaaaggtggcttttagctaccacttgcagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcgaacaggattagatacccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagcaaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattggaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttctgacaaccctagagatagggcttccccttggggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagaacaaagggcagcgaagccgcgaggctaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttggagccagccgccgaa；seq id no.3。
[0034]
实施例3scu-01菌株的应用
[0035]
将菌种scu-01活化培养即接种到营养肉汤液体培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，去离子水1000ml)，150r/min 37℃摇床培养24h，再将浓度为od
600
＝2.4的菌悬液以6％(v/v)的接种量接种到麦料(麦料购买于成都雄健粉业有限公司)上，37℃恒温培养14d，采用气相色谱质谱联用技术测定麦料所含的挥发性成分。
[0036]
同时使用两株标准株(bacillus licheniformis atcc 14580
t
购买自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心，以下简称为atcc 14580t；bacillus paralicheniformis kacc 18426t，由korean agricultural culture collection(kacc)提供，以下简称为kacc 18426t)进行相同的操作，比较优势组分含量的差异。
[0037]
所用气质联用仪：trace gc ultra-dsq ii气相色谱-单冲四级杆质谱仪，美国thermo fisher electron公司。采用乙醇浸提小曲麦料，液体手动进样量1μl，色谱条件：柱型为hp-innowax(30m
×
250nm
×
0.25um film,j&w,usa)。以40℃为起始温度，维持5min，以6℃/min升温到120℃，最后以8℃/min升温到230℃，维持20min。进样口温度250℃，高纯氦气为载气(流速1ml/min)，分流比10:1。
[0038]
质谱条件：电离方式ei，电子强度70ev，离子源温度230℃，转换线温度250℃，色谱扫描范围m/z 40-400amu。
[0039]
scu-01和标准菌株以相同的起始浓度在同样条件下进行发酵，结果见图4；在小曲麦料上培养结束时，乙偶姻、2,3-丁二醇、2,3,5,6-四甲基吡嗪、1,4-二甲基哌啶的含量分
别为52.08mg/kg、48.51mg/kg、16.07mg/kg、37.63mg/kg。结果表明，scu-01生成乙偶姻，2,3-丁二醇，1,4-二甲基哌啶，2,3,5,6-四甲基吡嗪含量高于两株标准菌株，说明scu-01生成白酒发酵中优质组分的能力强于实验中的两株标准菌株，具有良好的应用前景。
[0040]
scu-01分离株通过逐月传代至第九代，检测目标代谢产物的含量，结果见图5-6；结果表明，乙偶姻、2,3-丁二醇、2,3,5,6-四甲基吡嗪含量稳定，且酸类、吡嗪类、酮类等挥发性组分的含量也维持相对稳定；因此，scu-01遗传性能稳定。
[0041]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

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