一种抗沙门氏菌噬菌体表达的内溶酶和穿孔素组合物及其制备方法和应用与流程

[0001]
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗沙门氏菌噬菌体表达的内溶酶和穿孔素组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002]
沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，被认为是胃肠道疾病的主要原因，容易导致沙门氏菌病，具有很高的人畜共患可能性，在动物和人类中造成严重和可能致命的感染。大多数人类沙门氏菌感染通常与从包括猪肉、牛肉、羊肉和家禽在内的动物源性污染食品中摄入细菌有关。由于抗生素的不恰当使用，耐药沙门氏菌感染的发病率不断增加。耐药沙门氏菌被列入世界卫生组织(who)的优先致病菌名单。在全球范围内，耐药沙门氏菌已从不同动物源性食品中分离出来(世卫组织，2014年)，包括可能通过食物链传播给人类的猪源性产品，这已成为一个重大公共卫生问题。耐药沙门氏菌的广泛感染对包括中国在内的许多国家的公众健康构成持续威胁。研究新型抑菌剂被提上日程。
[0003]
近几年，噬菌体作为一种新型的抑菌剂开始得到大量的研究。但噬菌体作为活体病毒，不易保存且不容易被人们接受。而具有抑菌作用的内溶酶和穿孔素能很好的解决这些问题。穿孔素和内溶酶在噬菌体裂解细菌中发挥着重要的作用，“穿孔素-内溶酶”裂解体系是dsdna噬菌体的经典的裂解系统。内溶酶是一种有dsdna噬菌体编码的肽聚糖水解酶，降解细菌的肽聚糖，导致细菌死亡。内溶酶具有高效，裂解谱宽，不易产生耐药性等优点，已经应用于医疗，食品安全，病原菌检测等各个方面。穿孔素是一种含有跨膜结构的疏水蛋白。在噬菌体裂解细菌过程中，通过在细胞膜上形成孔径，协助内溶酶与肽聚糖接触。但现有噬菌体内溶酶和穿孔素的种类很少。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗沙门氏菌噬菌体表达的内溶酶和穿孔素组合物及其制备方法和应用。
[0005]
经研究，本发明采用以下技术方案：
[0006]
1、一种抗沙门氏菌噬菌体表达的内溶酶和穿孔素组合物，所述内溶酶的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述穿孔素的氨基酸序列如seq id no:2所示，所述内溶酶的结构域由酰胺酶催化结构域和肽聚糖结合结构域组成。
[0007]
优选的，所述穿孔素具有一个跨膜结构和一个单独的结构域。
[0008]
优选的，编码所述内溶酶的的核苷酸序列如seq id no:3所示，编码所述穿孔素的的核苷酸序列如seq id no:4所示。
[0009]
优选的，表达所述内溶酶和穿孔素组合物的细胞为原核细胞或真核细胞。
[0010]
优选的，所述噬菌体为抗沙门氏菌噬菌体。
[0011]
更优选的，所述沙门氏菌为salmonella spp.。其中，将抗沙门氏菌噬菌体，抗沙门
氏菌噬菌体表达的内溶酶和穿孔素分别命名为sm-p 2，lys 2和hol 2。
[0012]
2、一种表达载体，所述表达载体包含如seq id no:3所示和seq id no:4所示的核苷酸序列。
[0013]
3、上述抗沙门氏菌噬菌体表达的内溶酶和穿孔素组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0014]
1)向污水中加入沙门氏菌，培养后收集上清液，将上清液点斑于双层琼脂平板上，纯化后得到单一斑块，向单一斑块中加入缓冲液，搅拌后静置，收集液体，离心后加入沙门氏菌菌液中，培养，离心取上清液，富集得到噬菌体；
[0015]
2)用试剂盒提取噬菌体dna，以噬菌体dna为模板，以内溶酶引物或穿孔素引物进行pcr扩增，95℃变性，55℃退火，72℃延伸，30个循环，72℃终延伸，得到内溶酶或穿孔素的基因片段；
[0016]
3)将得到的内溶酶或穿孔素基因片段连接至peasy-blunt e1载体进行平端克隆；通过蓝白筛选、菌液pcr扩增和测序，获得peasy-内溶酶或peasy-穿孔素重组载体；将重组载体转化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素的tsa平板上，37℃下培养；将阳性克隆菌株接种至氨苄青霉素的lb培养基中，于37℃，震荡培养过夜；将过夜培养的阳性克隆菌株以1:100的稀释比例接种到lb培养基中，37℃，震荡培养；内溶酶或穿孔素重组表达采用异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)进行诱导，在37℃孵育后离心，通过tris-nacl缓冲液重悬沉淀后，在冰浴条件下超声破菌；将超声产物离心，上清液过滤，将蛋白纯化，得到内溶酶表达的融合蛋白，其氨基酸序列如seq id no:1所示，得到穿孔素表达的融合蛋白，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
[0017]
优选的，所述制得的内溶酶lys 2的分子量为28.66kda，穿孔素hol 2的分子量为24.51kda。
[0018]
优选的，所述内溶酶引物的核苷酸序列包括如seq id no:5所示和seq id no:6所示。
[0019]
优选的，所述穿孔素引物的核苷酸序列包括如seq id no:7所示和seq id no:8所示。
[0020]
优选的，包括用试剂盒提取噬菌体dna，以噬菌体dna为模板，以十聚体寡核苷酸引物进行pcr扩增，94℃变性，34℃复性，72℃延伸，45个循环，72℃延伸，以pcr产物条带少且亮的引物再次扩增，pcr产物进行胶回收，胶回收产物进行ta克隆，测序，用ncbi进行相似性比对，得到所述内溶酶引物和所述穿孔素引物的核苷酸序列。
[0021]
优选的，所述十聚体寡核苷酸引物的核苷酸序列表为如seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15和seq id no:16所示的任一种。
[0022]
4、上述抗沙门氏菌噬菌体表达的内溶酶和穿孔素组合物在制备用于预防、抑制或治疗细胞感染的药物中的应用。
[0023]
本发明的有益效果在于：
[0024]
1)本发明的抗沙门氏菌噬菌体表达的内溶酶lys 2和穿孔素hol 2组合物，具有广谱的杀菌活性，对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌都具有较好的抑菌效果，对沙门氏菌具有明显的杀伤作用，且内溶酶lys 2具有两个保守的结构域，其中一个为n端酶活结构域，属
于muraidase家族，能裂解β-1,4-糖苷键，是n-乙酰胞壁酸酶，另一个为肽聚糖结合域，属于pg_binding_1家族，穿孔素hol 2具有一个保守的结构域，属于bacteriophage t holin家族，能破坏细胞，并传递信息来控制细胞的裂解时间，内溶酶lys 2和穿孔素hol 2组合之后，其杀菌能力明显增强；
[0025]
2)本发明的抗沙门氏菌噬菌体表达的内溶酶lys 2和穿孔素hol 2组合物的制备方法，操作简单，成本低，且制得的内溶酶lys 2和穿孔素hol 2组合物可用于制备预防、抑制或治疗细胞感染的药物中，在医疗和食品安全领域具有推广应用价值。
附图说明
[0026]
图1为噬菌体sm-p 2的透射电镜图；
[0027]
图2为内溶酶lys 2和穿孔素hol 2基因的凝胶电泳图；
[0028]
图3为内溶酶lys 2(a)和穿孔素hol 2(b)的结构域分析结果图；
[0029]
图4为内溶酶lys 2(a)和穿孔素hol 2(b)的跨膜结构分析结果图；
[0030]
图5为内溶酶lys 2蛋白表达的sds-page分析结果图；其中，m为marker，1为菌体，2为超声破菌后的上清液，3为超声破菌后的沉淀，4为上清的穿过峰，5为缓冲液洗脱峰，6-9分别为浓度为20，50，200，500mmol/l的咪唑洗脱的洗脱液；
[0031]
图6为穿孔素hol 2蛋白表达的sds-page分析结果图；其中：m为marker，1为上清液，2为穿过峰，3为洗脱液，4-6分别为浓度为20，50，200mmol/l的咪唑洗脱的洗脱液；
[0032]
图7为内溶酶lys 2和穿孔素hol 2表达对bl21的毒害作用分析结果图；
[0033]
图8为内溶酶lys 2和穿孔素hol 2的杀菌能力分析结果图。
具体实施方式
[0034]
下面结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0035]
实施例1
[0036]
沙门氏菌噬菌体的制备和分离纯化
[0037]
污水样本取自重庆市的河里，将水样离心后加入终浓度为1.25mmol/l的cacl
2
，取上清液用滤纸过滤后，用0.22μm滤膜过滤到无菌容器中，加入2
×
lb和沙门氏菌；
[0038]
在37℃条件下振荡培养过夜，将过夜后的液体离心，上清液用无滤膜过滤后，与沙门氏菌菌液和含0.7％的琼脂的tsb混合后倒入tsa板，37℃培养，进行噬菌体分离；
[0039]
纯化噬菌体斑块，直至平板上呈现单一的斑块形态；向平板中加入3ml sm缓冲液(100mm nacl，8mm mgso
4
·
7h
2
o，50mm tris-hcl，ph＝7.5)，收集液体和顶层琼脂，9000
×
g离心15min；
[0040]
向上清液加入处于对数期的沙门氏菌菌液，于37℃，120rpm培养至液体完全澄清，利用peg-8000过夜富集噬菌体颗粒，20000g氯化铯密度梯度离心1h，得到纯化的噬菌体sm-p2，纯化后的噬菌体sm-p 2在4℃下保存于sm缓冲液中。
[0041]
将实施例1中纯化后的噬菌体进行透射电镜分析，结果如图1所示。
[0042]
从图1中分析可知，噬菌体sm-p2为肌尾科噬菌体，头部79.41nm，尾部148.72nm。
[0043]
实施例2
[0044]
噬菌体sm-p 2的鉴定，内溶酶lys 2和穿孔素hol 2基因片段的获取
[0045]
用试剂盒提取噬菌体dna，以噬菌体dna为模板，用十聚体寡核苷酸序列seq id no:5～seq id no:12所示的随机引物(10-mer rapd)进行pcr扩增，94℃预变性4min；94℃变性1min，34℃复性1min，72℃延伸2min，45个循环，72℃延伸10min；
[0046]
依据扩增结果，选择pcr产物条带少且亮的引物再次扩增，pcr产物进行胶回收，胶回收产物进行ta克隆，测序；
[0047]
用ncbi进行相似性比对，来确定噬菌体的种类；
[0048]
根据相识度最高的噬菌体来确定内溶酶和穿孔素引物；
[0049]
以噬菌体sm-p 2的dna为模板，内溶酶核苷酸序列seq id no:5所示为正向引物和内溶酶核苷酸序列seq id no:6所示为反向引物或者穿孔素核苷酸序列seq id no:7所示为正向引物和穿孔素核苷酸序列seq id no:8所示为反向引物进行pcr扩增，95℃预变性10min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃终延伸10min，得到内溶酶或穿孔素的基因片段。利用核酸电泳检测pcr产物。将pcr产物送往生工测序。
[0050]
本实施例中所用引物的序列表如表1所示；
[0051]
表1引物序列表
[0052][0053]
采用blast对预测基因与已知的基因和蛋白序列进行比较；分别利用expasy protparamtool、sopma和tmhmm server v.2.0对内溶素和穿孔素的理化特征、二级结构和跨膜结构进行测定。
[0054]
结果显示，噬菌体sm-p 2的核苷酸还原酶与salmonella phage sepoy基因相识度最高为72.12％。根据salmonella phage sepoy内溶酶和穿孔素的核苷酸序列得到内溶酶lys 2和穿孔素hol 2引物，从而获得，噬菌体sm-p2的内溶酶lys 2的核苷酸序列seq id no:3和穿孔素hol 2的核苷酸序列seq id no:4。
[0055]
将内溶酶lys 2和穿孔素hol 2进行凝胶电泳分析，结果如图2所示。
[0056]
图2中，1对应内溶酶lys 2核苷酸序列的长度，2对应穿孔素hol 2的核苷酸序列的长度。从图2中分析可知，内溶酶lys 2核苷酸序列的长度为784bp左右，穿孔素hol 2的核苷酸序列的长度为652bp左右，内溶酶lys 2核苷酸和穿孔素的hol 2核苷酸的分子量大小分别为28.66kda和24.51kda。
[0057]
将内溶酶lys 2和穿孔素hol 2的结构域进行分析，结果如图3所示。
[0058]
图3中，a表示内溶酶lys 2，b表示穿孔素hol 2。从图3中分析可知，内溶酶lys 2具有两个保守的结构域，其中一个为n端酶活结构域，属于muraidase家族，能裂解β-1,4-糖苷键，是n-乙酰胞壁酸酶；另一个为肽聚糖结合域，属于pg_binding_1家族；穿孔素hol 2含有一个保守的结构域，属于bacteriophage t holin家族，能破坏细胞，并传递信息来控制细胞的裂解时间。
[0059]
将内溶酶lys 2和穿孔素hol 2的跨膜结构进行分析，结果如图4所示。
[0060]
图4中，a表示内溶酶lys 2，b表示穿孔素hol 2。
[0061]
从图4中分析可知，内溶酶lys 2没有跨膜结构，穿孔素hol 2在21-38位氨基酸形成一个跨膜结构。在150-200之间可能出现跨膜结构，但由于螺旋程度较低最终并未形成跨膜结构。
[0062]
实施例3
[0063]
内溶酶lys 2的克隆、表达和纯化
[0064]
将实施例2得到的内溶酶lys 2基因片段连接至peasy-blunt e1载体进行平端克隆；通过蓝白筛选、菌液pcr扩增和测序，获得peasy-lys 2重组载体；将获得的重组载体转化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)感受态细胞中，并涂布于含有100ng\ml氨苄青霉素的tsa平板上，37℃下培养16小时；将阳性克隆菌株接种至含有100ng\ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm震荡培养过夜；将过夜培养的阳性克隆菌株以1:100的稀释比例接种到500ml的lb液体培养基中(100ng\ml氨苄青霉素)，37℃，200rpm震荡培养至od
600
达到0.6；
[0065]
内溶酶lys 2表达对大肠杆菌bl21(de3)的毒害作用，加入终浓度为1mmol/l的iptg，在37℃，200rmp的条件下震荡培养，在诱导过程中每隔(20min)取菌液样品，用分光光度计测定菌液在600nm波长处的吸光值，共测定2h，结果如图7所示；
[0066]
内溶酶lys 2重组表达采用1mm的异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)进行诱导，在37℃孵育5h后离心(8000
×
g，10min，4℃)，通100ml tris-nacl缓冲液(50mm tris-hcl，500mm nacl，ph＝7.5)重悬沉淀后，在冰浴条件下超声破菌；
[0067]
将超声产物在4℃、13000rmp的条件下离心1h，上清液用0.45μm的滤膜过滤，随后采用镍离子柱进行蛋白纯化，用tris-nacl缓冲液平衡后，分别用20mm、50mm的咪唑洗脱杂蛋白，用200mm、500mm的咪唑洗脱，得到内溶酶lys 2表达的融合蛋白，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
[0068]
将纯化后的内溶酶lys 2表达的融合蛋白进行sds-page分析，结果如图5所示。
[0069]
从图5中分析可知，纯化后内溶酶lys 2表达的融合蛋白在sds-page上，在35kda和25kda中间以单条带形式迁移。
[0070]
实施例4
[0071]
穿孔素hol 2的克隆、表达和纯化
[0072]
将实施例2得到的穿孔素hol 2基因片段连接至peasy-blunt e1载体进行平端克隆；通过蓝白筛选、菌液pcr扩增和测序，获得peasy-hol 2重组载体；将获得的重组载体转化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)感受态细胞中，并涂布于含有100ng\ml氨苄青霉素的tsa平板上，37℃下培养16小时；将阳性克隆菌株接种至含有100ng\ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm震荡培养过夜；将过夜培养的阳性克隆菌株以1:100的稀释比例接种到500ml的lb液体培养基中(100ng\ml氨苄青霉素)，37℃，200rpm震荡培养至od
600
达到0.6；
[0073]
穿孔素hol 2表达对大肠杆菌bl21(de3)的毒害作用，加入终浓度为1mmol/l的iptg，在37℃，200rmp的条件下震荡培养，在诱导过程中每隔(20min)取菌液样品，用分光光度计测定菌液在600nm波长处的吸光值，共测定2h，结果如图7所示；
[0074]
穿孔素hol 2表达采用1mm iptg进行诱导，在37℃孵育20min后离心(8000
×
g，10min，4℃)，用100ml tris-nacl缓冲液(50mm tris-hcl，500mm nacl，ph＝7.5)重悬沉淀后，在冰浴条件下超声破菌；
[0075]
将超声产物在4℃、13000rmp的条件下离心1h，上清液用0.45μm的滤膜过滤，随后采用镍离子柱进行蛋白纯化，用tris-nacl缓冲液平衡后，分别用20mm、50mm的咪唑洗脱杂蛋白，用200mm、500mm的咪唑洗脱，得到穿孔素hol 2表达的融合蛋白，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
[0076]
将纯化后的穿孔素hol 2表达的融合蛋白进行sds-page分析，结果如图6所示。
[0077]
从图6中分析可知，纯化后的穿孔素hol 2表达的融合蛋白在sds-page上，在24kda和35kda中间，以单条带形式迁移。
[0078]
内溶酶lys 2和穿孔素hol 2表达对大肠杆菌bl21(de3)的毒害作用，如图7所示。从图7中分析可知，peasy-lys 2的表达没有抑制bl21(de3)的生长，而peasy-hol 2的表达抑制了bl21(de3)的生长，但并不能降低菌液浓度。
[0079]
实施例5
[0080]
内溶酶lys 2和穿孔素hol 2融合蛋白的抑菌谱和mic值的测定
[0081]
以大肠杆菌，沙门氏菌和单增李斯特菌为指示菌，采用平板裂解实验检测内溶酶lys 2和穿孔素hol 2融合蛋白的抑菌谱；
[0082]
指示菌在37℃，120rmp过夜培养后，稀释到10
8
cfu/ml，取200μl菌液与含0.7％的琼脂的tsb混合，倒入tsa板上，自然晾干，分别滴加10μl适当浓度的内溶酶lys 2和穿孔素hol 2融合蛋白，在37℃培养，形成半透明的斑点则表示有裂解性；
[0083]
将过夜培养后的菌液稀释到10
6
cfu/ml，取4.5ml菌与0.5ml梯度稀释内溶酶lys 2和穿孔素hol 2融合蛋白分别混匀，在37℃，120rmp过夜培养。内溶酶lys 2和穿孔素hol2融合蛋白的抑菌活性如表2所示。
[0084]
表2内溶酶lys 2和穿孔素hol 2融合蛋白的抑菌活性
[0085][0086]
注：+：裂解性；-：不裂解。
[0087]
由表2中的抑菌结果分析可知，重组内溶酶lys 2和和穿孔素hol 2均具有广谱的杀菌活性，对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌都具有较好的抑菌效果，其中对革兰氏阳性细菌的抑菌效果比革兰氏阴性细菌的抑菌效果好。
[0088]
实施例6
[0089]
内溶酶lys 2和和穿孔素hol 2的杀菌能力
[0090]
选择沙门氏菌为底物，对重组内溶酶lys 2、穿孔素hol 2及其组合物的杀菌能力进行检测分析。将过夜培养的沙门氏菌用tris-nacl缓冲液洗涤重悬，并调节od
600
至到0.8-1.0左右；取450μl菌液分别加入50μl终浓度为2mic的内溶酶lys 2或穿孔素hol 2，在37℃培养1h后测定菌落数；取450μl菌液加入50μl内溶酶lys 2和穿孔素hol 2的组合物(终浓度为mic，即分别为1.2mg/ml和1.0mg/ml)，在37℃培养1h后测定菌落数。结果如图8所示。
[0091]
从图8中分析可知，在1h后，单独使用内溶酶lys 2或穿孔素hol 2处理的沙门氏菌菌液的菌落数显著下降；且内溶酶lys 2和穿孔素hol 2的组合物对沙门氏菌的杀灭作用显著高于单独使用的内溶酶lys 2或穿孔素hol 2。
[0092]
当然，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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