一种猪血浆中蛋白质的提取纯化方法与流程

[0001]
本发明涉及蛋白质提取技术领域，具体涉及一种猪血浆中蛋白质的提取纯化方法。


背景技术：

[0002]
猪血通常是屠宰场的废料被废弃或者作为普通猪血食品进入农贸市场消费。猪血由有形的血细胞组分和无形的血浆成分组成。为提高猪血的综合利用价值，有大量研究报道用猪血提取各类血红素蛋白。cn10443b一种猪血的综合利用方法，主要是提取猪血液的红色血细胞成分。然而提取纯化猪血浆蛋白质成分的报道较少。
[0003]
猪血浆中含有多种具有营养价值以及特殊生物活性的蛋白质和酶，包括白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原等。其中白蛋白具有扩张血容量、增强机体营养的作用，猪免疫球蛋白具有免疫活性、提高生命体免疫性的功效，猪纤维蛋白原具有生物亲和粘附性、能促进伤口愈合，可用于外科手术的伤口缝合、美容整形的无疤痕手术等；因此，从猪血浆中分离纯化各种活性蛋白质，能提高猪血浆的综合利用水平、提供人类医疗用品，对于创造社会经济价值、促进人类健康具有十分重要的现实意义。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于提供一种猪血浆中蛋白质的提取纯化方法，该方法能够分别提取猪血浆中各蛋白质组分，而且各蛋白质组分的提取率、纯度较高。
[0005]
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0006]
本发明第一方面提供一种猪血浆中蛋白质的提取纯化方法，所述提取纯化方法包括如下步骤：
[0007]
(a)将猪血浆稀释至蛋白含量为2％～5％并调节ph至6.0～8.5、离子强度至0.03～0.16，得到猪血浆溶液；
[0008]
(b)在2～18℃下，向猪血浆溶液中添加乙醇至乙醇浓度为10％～12％、静置、固液分离，分别得到猪血浆白蛋白和第一上清液；
[0009]
(c)在2～18℃下，在第一上清液中继续添加乙醇至乙醇浓度为15％～18％、静置、固液分离，分别得到猪血浆免疫球蛋白和第二上清液；
[0010]
(d)在2～18℃下，在第二上清液中继续添加乙醇至乙醇浓度为20％～25％、静置、固液分离，分别得到猪血浆凝血酶和第三上清液；
[0011]
(e)将第三上清液进行层析柱分离纯化得到纤维蛋白原溶液。
[0012]
本发明上述提取纯化方法通过对猪血浆中蛋白含量、ph、离子强度以及乙醇终浓度的限定，能够实现对猪血浆中白蛋白、免疫球蛋白、凝血酶以及纤维蛋白原的提取，而且该提取方法提取效率较高，且提取得到的蛋白质具有优异的纯度。
[0013]
在本发明中对猪血浆的来源不作严格限制，例如，可以通过本领域的常规方法制得；优选地，猪血浆通过如下方法制得：
[0014]
将健康新鲜猪血加柠檬酸钠或edta钠盐作为抗凝剂，低温2-8度，离心分离去除血细胞，得到猪血浆，其中，抗凝剂为3％～8％的钠盐溶液，抗凝剂加量为猪血体积的5％～15％。
[0015]
优选地，所述步骤(a)中，稀释采用的稀释液为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。
[0016]
优选地，所述固液分离温度控制在3～5℃。
[0017]
优选地，所述步骤(e)中，层析柱分离纯化包括：
[0018]
将deaf-sepharose fast flow凝胶室温放置达到温度平衡后装柱，并采用缓冲液进行洗脱平衡，然后，将第三上清液上样于平衡好的层析柱，再采用缓冲液进行洗脱，收集纤维蛋白原溶液；更优选地，所述洗脱流速控制在每小时4倍柱体积，温度控制在2～8℃，洗柱8～10倍柱体积。
[0019]
优选地，所述缓冲液为ph6.0～6.5的12mm的磷酸盐缓冲液、35mm的醋酸盐缓冲液或22mm的柠檬酸盐缓冲液。通过上述层析柱分离纯化的具体限定，能够更好提高第三上清液中纤维素蛋白原的提取率以及提高纤维素蛋白原的纯度。
[0020]
优选地，所述步骤(e)中，还包括：
[0021]
将纤维蛋白原溶液进行超滤浓缩、巴士消毒、除菌、冷冻干燥，得到纤维蛋白原冻干粉。
[0022]
优选地，所述纤维蛋白原冻干粉中含水量不高于3％。
[0023]
优选地，所述巴士消毒包括：
[0024]
将超滤浓缩后的溶液稀释到蛋白含量为1.5％～2.5％并调节ph值至6.4～6.8，然后，加入甘氨酸和麦芽糖，随后在60
±
0.5℃下保温10h。更优选地，所述甘氨酸的终浓度为45～55mm，麦芽糖的终浓度为25％～35％。通过蛋白含量的限定以及甘氨酸和麦芽糖的添加，能够对蛋白质进行保护，提高蛋白质的稳定性。
[0025]
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
[0026]
本发明提取纯化方法通过对猪血浆中蛋白含量、ph、离子强度以及乙醇终浓度的限定，能够实现对猪血浆中白蛋白、免疫球蛋白、凝血酶以及纤维蛋白原的提取，而且该提取方法提取效率较高，且提取得到的蛋白质具有优异的纯度。
具体实施方式
[0027]
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0028]
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
[0029]
以下各实施例中采用的原料如下：
[0030]
猪血浆，由如下方法制得：
[0031]
将健康新鲜猪血加柠檬酸钠作为抗凝剂，低温4度，离心分离去除血细胞，得到猪血浆，其中，抗凝剂为6％的钠盐溶液，抗凝剂加量为猪血体积的10％。
[0032]
实施例1
[0033]
本实施例为一种猪血浆中蛋白质的提取纯化方法，该提取纯化方法包括如下步
骤：
[0034]
(a)采用磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液将猪血浆稀释至蛋白含量为2％并调节ph至8.5、离子强度至0.03，得到猪血浆溶液；
[0035]
(b)在2℃下，向猪血浆溶液中添加乙醇至乙醇浓度为10％、静置6h、在4℃下进行固液分离，分别得到猪血浆白蛋白和第一上清液；
[0036]
(c)在2℃下，在第一上清液中继续添加乙醇至乙醇浓度为15％、静置6h、固液分离，分别得到猪血浆免疫球蛋白和第二上清液；
[0037]
(d)在2℃下，在第二上清液中继续添加乙醇至乙醇浓度为20％、静置6h、固液分离，分别得到猪血浆凝血酶和第三上清液；
[0038]
(e)将deaf-sepharose fast flow凝胶室温放置达到温度平衡后装柱，并采用ph6.5的22mm的柠檬酸盐缓冲液进行洗脱平衡，然后，将第三上清液上样于平衡好的层析柱，再采用ph6.5的22mm的柠檬酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱流速控制在每小时4倍柱体积，温度控制在4℃，洗柱9倍柱体积，于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性收集纤维蛋白原溶液；
[0039]
将纤维蛋白原溶液泵入超滤机，用无热原注射用水超滤脱醇脱盐并超滤浓缩，再将超滤浓缩后的溶液稀释到蛋白含量为2.5％并调节ph值至6.4，然后，加入甘氨酸和麦芽糖，甘氨酸的终浓度为55mm，麦芽糖的终浓度为25％，随后在60
±
0.5℃下保温10h灭活浓缩液中的病毒，随后，过0.22μm微孔滤膜进行除菌，再转入冻干机真空冻干，含水量为2.3％，得到纤维蛋白原冻干粉。
[0040]
实施例2
[0041]
本实施例为一种猪血浆中蛋白质的提取纯化方法，该提取纯化方法包括如下步骤：
[0042]
(a)采用磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液将猪血浆稀释至蛋白含量为5％并调节ph至6.0、离子强度至0.16，得到猪血浆溶液；
[0043]
(b)在18℃下，向猪血浆溶液中添加乙醇至乙醇浓度为12％、静置6h、在4℃下进行固液分离，分别得到猪血浆白蛋白和第一上清液；
[0044]
(c)在18℃下，在第一上清液中继续添加乙醇至乙醇浓度为18％、静置6h、固液分离，分别得到猪血浆免疫球蛋白和第二上清液；
[0045]
(d)在18℃下，在第二上清液中继续添加乙醇至乙醇浓度为25％、静置6h、固液分离，分别得到猪血浆凝血酶和第三上清液；
[0046]
(e)将deaf-sepharose fast flow凝胶室温放置达到温度平衡后装柱，并采用ph6.0的35mm的醋酸盐缓冲液进行洗脱平衡，然后，将第三上清液上样于平衡好的层析柱，再采用ph6.0的35mm的醋酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱流速控制在每小时4倍柱体积，温度控制在4℃，洗柱9倍柱体积，于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性收集纤维蛋白原溶液；
[0047]
将纤维蛋白原溶液泵入超滤机，用无热原注射用水超滤脱醇脱盐并超滤浓缩，再将超滤浓缩后的溶液稀释到蛋白含量为1.5％并调节ph值至6.8，然后，加入甘氨酸和麦芽糖，甘氨酸的终浓度为45mm，麦芽糖的终浓度为35％，随后在60
±
0.5℃下保温10h灭活浓缩液中的病毒，随后，过0.22μm微孔滤膜进行除菌，再转入冻干机真空冻干，含水量为1.8％，
得到纤维蛋白原冻干粉。
[0048]
实施例3
[0049]
本实施例为一种猪血浆中蛋白质的提取纯化方法，该提取纯化方法包括如下步骤：
[0050]
(a)采用磷酸盐缓冲液将猪血浆稀释至蛋白含量为3％并调节ph至7.1、离子强度至0.09，得到猪血浆溶液；
[0051]
(b)在6℃下，向猪血浆溶液中添加乙醇至乙醇浓度为11％、静置6h、在4℃下进行固液分离，分别得到猪血浆白蛋白和第一上清液；
[0052]
(c)在6℃下，在第一上清液中继续添加乙醇至乙醇浓度为16％、静置6h、固液分离，分别得到猪血浆免疫球蛋白和第二上清液；
[0053]
(d)在6℃下，在第二上清液中继续添加乙醇至乙醇浓度为22％、静置6h、固液分离，分别得到猪血浆凝血酶和第三上清液；
[0054]
(e)将deaf-sepharose fast flow凝胶室温放置达到温度平衡后装柱，并采用ph6.3的12mm的磷酸盐缓冲液进行洗脱平衡，然后，将第三上清液上样于平衡好的层析柱，再采用ph6.3的12mm的磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱流速控制在每小时4倍柱体积，温度控制在4℃，洗柱9倍柱体积，于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性收集纤维蛋白原溶液；
[0055]
将纤维蛋白原溶液泵入超滤机，用无热原注射用水超滤脱醇脱盐并超滤浓缩，再将超滤浓缩后的溶液稀释到蛋白含量为2％并调节ph值至6.6，然后，加入甘氨酸和麦芽糖，甘氨酸的终浓度为50mm，麦芽糖的终浓度为30％，随后在60
±
0.5℃下保温10h灭活浓缩液中的病毒，随后，过0.22μm微孔滤膜进行除菌，再转入冻干机真空冻干，含水量为2.3％，得到纤维蛋白原冻干粉。
[0056]
对照例1
[0057]
本对照例2为一种猪血浆中蛋白质的提取纯化方法，该方法与实施例3中的方法基本相同，区别仅在于实施例3的步骤(a)中调节离子强度至0.9修改为调节离子强度值2.0。
[0058]
对照例2
[0059]
本对照例2为一种猪血浆中蛋白质的提取纯化方法，该方法与实施例3中的方法基本相同，区别仅在于实施例3的步骤(b)中添加乙醇终浓度为11％修改为添加乙醇终浓度为15％。
[0060]
对照例3
[0061]
本对照例2为一种猪血浆中蛋白质的提取纯化方法，该方法与实施例3中的方法基本相同，区别仅在于实施例3的步骤(c)中添加乙醇终浓度为16％修改为添加乙醇终浓度为20％。
[0062]
对照例4
[0063]
本对照例2为一种猪血浆中蛋白质的提取纯化方法，该方法与实施例3中的方法基本相同，区别仅在于实施例3的步骤(d)中添加乙醇终浓度为22％修改为添加乙醇终浓度为28％。
[0064]
实验例
[0065]
采用双缩脲法以及高效液相法分别测定实施例1～3以及对照例1～4中提取得到
的白蛋白、免疫球蛋白、凝血酶以及纤维蛋白原的提取率以及纯度，测定结果如表1所示：
[0066]
表1
[0067][0068][0069]
由表1可知：
[0070]
通过表1实验数据可知，本申请实施例中的制备方法能够更好的提取猪血浆中的各蛋白质成分，而且提取率和产品纯度都显著优于对照例中的提取方法。
[0071]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

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