一种高效型2的制作方法

一种高效型2
×
sybr qpcr mix试剂及应用
技术领域
[0001]
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种高效型2
×
sybr qpcr mix试剂及应用。


背景技术：

[0002]
荧光定量pcr是1996年美国roche公司推出荧光定量pcr检测试剂，用于临床疾病的诊断，实时荧光定量pcr是一种通过荧光染料或者探针在pcr反应过程中和dna双链结合时产生荧光信号，通过对荧光信号的实时检测监控pcr反应过程，由于在pcr扩增的指数时期，模板的ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
[0003]
探针法因需要对探针进行设计和优化，所以实验成本较高，因而推广使用较少，而染料法因无需设计引物，成本较低，且操作简单，和常规pcr操作基本相同。但是染料法由于染料与dsdna的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性，除了与特异性的靶序列扩增产物结合外还能与在pcr扩增过程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，从而造成扩增效率的降低、结果的不准确。


技术实现要素：

[0004]
基于上述背景技术，本发明的目的是提供一种高效型2
×
sybr qpcr mix试剂，可以有效提高dna聚合效率，显著降低引物二聚体含量，减少非特异性扩增产物的形成，提高扩增率。
[0005]
本发明的另一目的是提供一种高效型2
×
sybr qpcr mix试剂的应用。
[0006]
本发明采用以下的技术方案：
[0007]
一种高效型2
×
sybr qpcr mix试剂，包括：tris、mgcl
2
、taq dna聚合酶、dutp、dntp、2
×
sybr green-、甘油和甘露醇与蔗糖的混合液。
[0008]
上述的高效型2
×
sybr qpcr mix试剂，进一步地，所述甘油在体系中的质量百分数为0.0002％。
[0009]
上述技术方案中，甘油可以提高taq聚合酶酶活，提高qpcr聚合反应效率。优选地，甘油在体系中的质量百分数为0.0002％。
[0010]
上述的高效型2
×
sybr qpcr mix试剂，进一步地，试剂体系中，所述mgcl
2
的浓度为10mm。
[0011]
上述的高效型2
×
sybr qpcr mix试剂，进一步地，试剂体系中，所述tris为50mm，taq dna聚合酶为0.15u/ml，dutp为0.4mm，dntp为0.2mm，甘露醇和蔗糖的混合液在体系中的质量百分数为20％。
[0012]
上述技术方案中，tris和mgcl
2
为通过高度优化得到，可以有效激活taq聚合酶，减少引物二聚体的产生。
[0013]
上述的高效型2
×
sybr qpcr mix试剂，进一步地，所述tag dna聚合酶为高度热稳
定性聚合酶，来源于嗜热菌thermus aquaticus的pola基因，且进行了多个关键位点的基因进化，经大肠杆菌表达，多种介质纯化而得到。
[0014]
上述的高效型2
×
sybr qpcr mix试剂，进一步地，所述tag dna聚合酶的分子量为94kda；具有5'-3'聚合酶活性和5'-3'核酸外切酶活性。
[0015]
e taq dna polymerase具有5'-3'聚合酶活性和5'-3'核酸外切酶活性。
[0016]
上述的高效型2
×
sybr qpcr mix试剂，进一步地，所述2
×
sybr green-为根据发光量优化的预混液。
[0017]
上述的高效型2
×
sybr qpcr mix试剂，进一步地，所述甘露醇与蔗糖的混合液中，甘露醇和蔗糖的质量比为4:1。
[0018]
一种高效型2
×
sybr qpcr mix试剂的应用，包括以下步骤：
[0019]
(3)将2
×
sybr qpcr mix试剂12.5ul，模板dna 100ng，primer f和primer r分别添加1ul，用ddh
2
o补充反应体系至25ul；
[0020]
(4)采用三步法进行qpcr扩增检测：
[0021][0022]
即可完成2
×
sybr qpcr mix试剂的应用。
[0023]
上述技术方案中，步骤(2)中95℃5min可以更好地将taq dna聚合酶启动利于pcr反应。
[0024]
本发明的有益效果：
[0025]
可以有效提高dna聚合效率，减少pcr扩增过程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，显著提高扩增率。
附图说明
[0026]
图1为实施案例1中不同2
×
sybr qpcr mix试剂的pcr扩增效率；
[0027]
图2为体系中不同mgcl
2
浓度对taq酶活性影响；
[0028]
图3为体系中不同甘油浓度对taq酶活性影响。
具体实施方式
[0029]
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。
[0030]
实验案例一：
[0031]
对比例1：市售常规2
×
sybr qpcr mix试剂。
[0032]
实施例1：tris、mgcl
2
、taq dna聚合酶、dutp、dntp、2
×
sybr green-、甘油和甘露醇与蔗糖的混合液。按照上述配方配成高效型2
×
sybr qpcr mix试剂。试剂中：tris50mm，mgcl2 10mm，taq dna聚合酶0.15u/ml，dutp 0.4mm，dntp 0.2mm,2
×
sybr green-，在体系中的质量百分数为0.0002％的甘油及在体系中的质量百分数为20％甘露醇和蔗糖的混合液(甘露醇/蔗糖质量比＝4:1)。
[0033]
将对比例1和实施例1中的2
×
sybr qpcr mix试剂按照表1配方分别混合均匀：
[0034]
表1
[0035]
components对比例1实施例12
×
sybr qpcr mix12.5ul12.5ultemplate dna2ul2ulprimer f(20um)0.5ul0.5ulprimer r(20um)0.5u0.5uddh2oadd to 25uladd to 25ul
[0036]
将按照表1混合好的实施例1和对比例1混合液按照三步法进行qpcr扩增检测：
[0037][0038]
实验结果见图1所示，结果显示，相比于市售常规2
×
sybr qpcr mix试剂，实施例1中2
×
sybr qpcr mix试剂可以显著提高pcr扩增率。
[0039]
实验案例二：(mg
2+
和甘油对taq酶活性影响)
[0040]
1单位(u)turbo e taq dna polymerase活性定义为：在74℃，30分钟内，以大马哈鱼精子dna作为模板引物，将10nmol dntp掺入到酸不溶物质所需的酶量。
[0041]
实施例2：tris-hcl(ph9.3)25mm；β-巯基乙醇1mm；活化鲑鱼dna 0.75ml；dctp、datp、dgtp和dttp各200um。
[0042]
在反应体系中分别添加：
[0043]
mgcl
2 2mm、mgcl
2 5mm、mgcl
2 8mm、mgcl
2 10mm、mgcl
2 12mm、mgcl
2 15mm和mgcl
2 20mm；
[0044]
再加入10ul预先测定酶活为5u/ulturbo e taq dna polymerase，74℃反应30min测定turbo e taq dna polymerase酶活性。
[0045]
实施例3：tris-hcl(ph9.3)25mm；mgcl
2 10mm；β-巯基乙醇1mm；活化鲑鱼dna0.75ml；dctp、datp、dgtp和dttp各200um。
[0046]
在反应体系中分别添加：
[0047]
0.0005
‰
甘油、0.001
‰
甘油、0.0015
‰
甘油、0.002
‰
甘油、0.0025
‰
甘油、0.003
‰
甘油、0.004
‰
甘油和0.005
‰
甘油；
[0048]
再加入10ul预先测定酶活为5u/ulturbo e taq dna polymerase，74℃反应30min测定turbo e taq dna polymerase酶活性。
[0049]
实验结果见图2和图3所示，结果显示，10mm的mgcl
2
和0.002
‰
甘油可以有效的提高turbo e taq dna polymerase酶活，从而提高pcr反应中的扩增率。
[0050]
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

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