一种低病毒用量的CAR-T制备方法与流程

一种低病毒用量的car-t制备方法
技术领域
[0001]
本发明涉及免疫学和分子生物学技术领域，尤其涉及一种低病毒用量的car-t制备方法。


背景技术：

[0002]
过继性免疫细胞治疗是当前生物医药领域新型的抗肿瘤治疗手段。该方法主要通过将患者自体细胞提取后，经体外进行活化，修饰，培养和扩增后，再回输至患者体内，从而到达治疗肿瘤的目的。car-t，即嵌合抗原受体修饰性t细胞是一种具有靶向性的过继性免疫细胞治疗方法。该技术通过利用基因修饰的方法改造t细胞基因组，使其表达可识别肿瘤特异性抗原的car受体，进而突破原始t细胞抗肿瘤的mhc限制性，使t细胞直接杀伤肿瘤。例如cd19特异性car-t细胞已经在急性b淋巴细胞白血病和b细胞淋巴瘤的治疗方面取得了突破性进展，并实现了临床应用。但是目前的病毒转染car-t技术依旧面临着诸多挑战，目前大部分病毒转染car-t技术依旧是病毒用量高且转染率比较低。


技术实现要素：

[0003]
本发明的目的在于解决现有技术中病毒转染car-t技术依旧是病毒用量高且转染率比较低的技术问题，提供一种低病毒用量的car-t制备方法。
[0004]
本发明提供的技术方案如下：
[0005]
一种低病毒用量的car-t制备方法，其特征在于，是将分选活化得到的cd3+t细胞进行慢病毒转染。
[0006]
优选的，所述cd3+t细胞来源于人外周血单核细胞。
[0007]
优选的，所述外周血单核细胞已进行冻存处理。
[0008]
一种低病毒用量的car-t制备方法，包括如下步骤：
[0009]
day 1，进行冻存外周血单核细胞的复苏；
[0010]
day 2，所述外周血单核细胞复苏一日后，进行cd3+t细胞的分选活化，磁珠与t细胞共孵育进行激活；
[0011]
day 3，取沉降的细胞团离心，重悬后通过添加转染剂进行慢病毒转染；
[0012]
day 4，转染过夜后，离心除去含转染试剂及病毒的培养基，添加新鲜培养基重悬并计数，调整细胞密度调整并继续培养；
[0013]
day 5，更换新鲜培养基，维持细胞密度，继续培养2天。
[0014]
day 7，各组细胞计数，更换培养基继续培养，取样检测。
[0015]
优选的，步骤day 2中所述磁珠用量为2e+07，细胞密度维持3.1e+06/ml。
[0016]
优选的，所述步骤day 3所述转染剂的为聚合阳离子转染试剂，用量为8ug/ml。
[0017]
优选的，所述聚合阳离子转染试剂为ploybrene转染试剂。
[0018]
优选的，所述聚合阳离子转染试剂为hitransg病毒转染试剂。
[0019]
优选的，所述步骤day4和day5中所述细胞密度为1.0e+06/ml。
[0020]
优选的，所述细胞数均为活细胞数。
[0021]
通过采用上述技术方案，达到的技术效果如下：
[0022]
本发明方法简单，利用较低量的慢病毒量进行转染且转染率较高，节省了病毒的用量且最终阳性率较高。
附图说明
[0023]
图1是实施例1的转染阳性率结果图；
[0024]
图2是实施例2的转染阳性率结果图；
[0025]
图3是对照例的转染阳性率结果图。
具体实施方式
[0026]
一种低病毒用量的car-t制备方法，其特征在于，是将分选活化得到的cd3+t细胞进行慢病毒转染。
[0027]
优选的，所述cd3+t细胞来源于人外周血单核细胞。
[0028]
优选的，所述外周血单核细胞已进行冻存处理。
[0029]
一种低病毒用量的car-t制备方法，包括如下步骤：
[0030]
day 1，进行冻存外周血单核细胞的复苏；
[0031]
day 2，所述外周血单核细胞复苏一日后，进行cd3+t细胞的分选活化，磁珠与t细胞共孵育进行激活；
[0032]
day 3，取沉降的细胞团离心，重悬后通过转染剂进行慢病毒转染；
[0033]
day 4，转染过夜后，离心除去含转染试剂及病毒的培养基，添加新鲜培养基重悬并计数，调整细胞密度调整并继续培养；
[0034]
day 5，更换新鲜培养基，维持细胞密度，继续培养2天。
[0035]
day 7，各组细胞计数，更换培养基继续培养，取样检测。
[0036]
优选的，步骤day 2中所述磁珠用量为2e+07，细胞密度维持3.1e+06/ml。
[0037]
优选的，所述步骤day 3所述转染剂的为聚合阳离子转染试剂，用量为8ug/ml。
[0038]
优选的，所述聚合阳离子转染试剂为ploybrene转染试剂。
[0039]
优选的，所述聚合阳离子转染试剂为hitransg病毒转染试剂。
[0040]
优选的，所述步骤day4和day5中所述细胞密度为1.0e+06/ml。
[0041]
优选的，所述细胞数均为活细胞数。
[0042]
为了更进一步理解本发明技术方案，现结合实例予以说明。
[0043]
实施例1
[0044]
day 1，进行冻存pbmc(人外周血单核细胞)细胞的复苏，1管，细胞计数活率为91％，细胞数为5.1e+07；
[0045]
day 2，复苏一日后，进行cd3+t细胞的分选活化，磁珠用量2e+07，获得的细胞活率为95％，收获细胞数为1.3e+07，磁珠与t细胞共孵育进行激活，细胞密度维持3.1e+06/ml；
[0046]
day 3，细胞收集至15ml离心管，大部分细胞团块因为附着磁珠，会迅速沉降，从而与上层较小团块以及未成团细胞分离，取沉降的细胞团离心，重悬后检测，细胞活率则为90％，获得细胞数8.5e+06。通过ploybrene转染剂进行慢病毒转染，ploybrene转染剂用量
为8ug/ml，转染细胞数为0.5e+07，病毒数为1.5e+07；
[0047]
day 4，转染过夜后，离心除去含转染试剂及病毒的培养基，添加新鲜培养基重悬并计数，细胞密度调整为1.0e+06/ml并继续培养；
[0048]
day 5，各组细胞更换新鲜培养基，维持细胞密度1.0e+06/ml，继续培养。
[0049]
day 7，各组细胞计数，更换培养基继续培养，取样进行流式细胞转染试剂检测。
[0050]
所述细胞数均为活细胞数。
[0051]
结果如图1所示。
[0052]
实施例2
[0053]
day 1，进行冻存pbmc(人外周血单核细胞)细胞的复苏，1管，细胞计数活率为92％，细胞数为5.1e+07；
[0054]
day 2，复苏一日后，进行cd3+t细胞的分选活化，磁珠用量2e+07，获得的细胞活率为96％，收获细胞数为1.3e+07，磁珠与t细胞共孵育进行激活，细胞密度维持3.1e+06/ml；
[0055]
day 3，细胞收集至15ml离心管，大部分细胞团块因为附着磁珠，会迅速沉降，从而与上层较小团块以及未成团细胞分离，取沉降的细胞团离心，重悬后检测，细胞活率则为92％，获得细胞数8.5e+06。通过hitransg病毒转染试剂进行慢病毒转染，hitransg病毒转染试剂用量为8ug/ml，转染细胞数为0.5e+07，病毒数为1.5e+07；
[0056]
day 4，转染过夜后，离心除去含转染试剂及病毒的培养基，添加新鲜培养基重悬并计数，细胞密度调整为1.0e+06/ml并继续培养；
[0057]
day 5，各组细胞更换新鲜培养基，维持细胞密度1.0e+06/ml，继续培养。
[0058]
day 7，各组细胞计数，更换培养基继续培养，取样进行流式细胞转染试剂检测。
[0059]
所述细胞数均为活细胞数。
[0060]
结果如图2所示。
[0061]
对照例
[0062]
对照例中不使用转染剂，其他与实施例1步骤相同。
[0063]
结果如图3所示。
[0064]
从图1图2可以看出，实施例1和实施例2转染率较好，分别为63.40％和65.07％，对照例中转染率只有49.30％。本发明实施例不仅转染率高，病毒用量少，病毒数仅为1.5e+07。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除