一种CRISPR/Cas9基因载体、其制备方法及应用与流程

一种crispr/cas9基因载体、其制备方法及应用
技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域，提供了一种crispr/cas9基因载体、其制备方法及应用。
技术背景
[0002]
人类许多重大疾病的发生均与基因缺陷有关，包括绝大部分遗传病、镰刀型细胞贫血症、糖尿病、肿瘤等。目前传统化疗或手术治疗仍然不能有效治愈这些重大疾病，基因治疗被认为是治疗这些重大疾病的有效手段。crispr/cas9基因编辑技术因高效靶向性、操作简便的优势，成为治疗基因疾病的研究热点。
[0003]
常用的基因载体有两类：病毒载体与非病毒载体。目前crispr/cas9系统的传递多采用慢病毒载体以提高基因的转染效率，从而确保crispr/cas9系统实现其基因编辑的目的。但是慢病毒载体倾向于插入宿主基因组的高表达区域，有较强的致癌、致突变性，目前已经停止临床应用。同时病毒载体的靶向性不强，制备过程复杂，成本较高等缺陷也限制了其临床应用。非病毒载体的生物安全性与靶向性较高，但是没有基因组整合能力，转染效率较低，表达时效短，无法满足crispr/cas9系统传递的需要。
[0004]
本发明制备一种新型非病毒基因载体，该载体能将crispr/cas9基因靶向传递至肿瘤细胞，再靶向传递至细胞核，并通过转座子将crispr/cas9基因整合至宿主基因组，实现对目的基因的高效敲除。首先，将crispr/cas9基因克隆至“睡美人”转座子中得到pt2spcas9重组质粒，然后设计靶向特定基因(如：nanog基因)的sgrna并插入pt2spcas9中得到pt2spcas9-nanog重组质粒。利用睡美人转座子的转座能力，提高将目的基因插入宿主基因组的整合效率，尤其是对于难以转染的祖细胞、干细胞、生殖细胞等，使转基因表达可以稳定的遗传到子代，提高crispr/cas9系统的基因编辑效率。为了将pt2spcas9基因靶向递送至细胞，本发明制备聚多巴胺(polydopamine，pda)纳米粒，在其表面修饰聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，pei)。将地塞米松(dexamethasone，dex)通过π-π共轭负载至pda表面，使载体具有细胞核靶向能力。最后通过静电吸附作用将透明质酸(hyaluronic acid，ha)修饰在pda表面，使载体具有肿瘤细胞靶向性，得到pda/dex-pei@ha(pdph)基因载体。该基因载体具有极低的细胞毒性和较高的转染效率，可以将pt2spcas9重组质粒靶向传递至肿瘤细胞，并靶向传递至细胞核，再将crispr/cas9基因插入细胞基因组中，对靶细胞进行高效的基因编辑。pdph的生物安全性和转染效率远高于其他传统基因载体，是优秀的crispr/cas9基因传递载体。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种能够高效传递crispr/cas9系统的基因载体、其制备方法及应用，该基因载体可以将crispr/cas9系统靶向传递至目的细胞，并传递至细胞核，再利用转座子将crispr/cas9系统插入宿主基因组，提高其基因编辑的效率。该基因载体传递效率高、毒性低，生物安全性好，并且制备方法简单，条件温和，拥有广阔的应用前景。
[0006]
第一方面，本发明提供了一种crispr/cas9基因载体，其是一种表面经修饰的聚多巴胺纳米粒，包括聚多巴胺、聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸，其中，聚多巴胺表面修饰有聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸，地塞米松通过π-π共轭负载至聚多巴胺表面，聚乙烯亚胺修饰于聚多巴胺表面，透明质酸通过静电吸附作用在聚多巴胺表面。其中，聚多巴胺、聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸的质量比为5：(2.5-3)：(6-7)：(5-10)。
[0007]
第二方面，本发明提供了一种如上所述的crispr/cas9基因载体的制备方法，其包括以下步骤：
[0008]
步骤1、将浓度28％的氨水，无水乙醇与去离子水混合均匀，三者的体积比为2:40:(90～180)，20℃～40℃搅拌20-30分钟；
[0009]
步骤2、将多巴胺盐酸盐溶解于去离子水中，并滴加至步骤1)中所得混合物溶液中，使得多巴胺盐酸盐的最终浓度为2～7mg/ml，20℃～40℃搅拌反应20-24小时；
[0010]
步骤3、将步骤2)所得产物在12000-13000rpm下离心40～60分钟，水洗3次，得到聚多巴胺纳米粒；
[0011]
步骤4、将步骤3)获得的聚多巴胺纳米粒3-6mg溶于10-20ml去离子水中并加入2.5-5mg的地塞米松粉末，搅拌24h得到聚多巴胺/地塞米松水溶液；
[0012]
步骤5、将步骤4)中所得聚多巴胺/地塞米松水溶液滴加至浓度为10mg/ml聚乙烯亚胺水溶液中，聚多巴胺/地塞米松水溶液与聚乙烯亚胺水溶液的质量比为1:(1～2)搅拌20-24h；可以选择地，聚乙烯亚胺为25k分子量的聚乙烯亚胺或者15k分子量的聚乙烯亚胺；
[0013]
步骤6、将步骤5)获得的反应混合物装入透析袋中(mwco＝14000)，在蒸馏水中透析，得到聚多巴胺/地塞米松-聚乙烯亚胺溶液。
[0014]
步骤7、将1mg/ml透明质酸的水溶液缓慢滴加到步骤6)中获得的聚多巴胺/地塞米松-聚乙烯亚胺溶液中，透明质酸的水溶液与聚多巴胺/地塞米松-聚乙烯亚胺溶液的质量比为1:(0.5～1)，搅拌反应4～6小时，得到目标产物，即上述的crispr/cas9基因载体，表面经修饰的聚多巴胺纳米粒。
[0015]
第三方面，本发明提供了一种基于上述的crispr/cas9基因载体的crispr/cas9系统转染复合物的构建方法，其包括以下步骤：
[0016]
步骤1、crispr/cas9基因载体的制备
[0017]
所述的crispr/cas9基因载体为上述的表面经修饰的聚多巴胺纳米粒，其通过上述的crispr/cas9基因载体的制备方法获得；
[0018]
步骤2、构建携带特异性sgrna的“睡美人”转座子crispr/cas9重组质粒
[0019]
2.1)采用限制性内切酶剪切得到px459质粒中的crispr/cas9系统基因序列；
[0020]
2.2)采用pcr方法扩增携带“睡美人”转座子的pt2bh质粒中的“睡美人”转座子基因序列；
[0021]
2.3)将crispr/cas9系统基因序列与“睡美人”转座子基因序列连接得到pt2spcas9重组质粒；
[0022]
2.4)将特异性sgrna退火后插入步骤2.3)中获得的pt2spcas9重组质粒中，得到携带特异性sgrna的pt2spcas9重组质粒。
[0023]
步骤3、crispr/cas9基因载体负载携带特异性sgrna的pt2spcas9重组质粒
[0024]
将步骤2)中获得的携带特异性sgrna的pt2spcas9重组质粒缓慢加入步骤1)中的
crispr/cas9基因载体的中，涡旋振荡，室温孵育20-30min即得crispr/cas9系统转染复合物。
[0025]
进一步地，步骤2.1)中所述的限制性内切酶为ecori和sacii。
[0026]
进一步地，步骤2.2)中所述的pcr方法扩增的具体步骤为：
①
92℃反应5min；
②
92℃反应30s；
③
56℃反应30s；
④
68℃反应1min；
⑤
将步骤
②
～
④
重复30个循环；
⑥
68℃反应15min。所使用的正向引物序列为5
’-
ccggaattccgggctaccaaatactaattg-3
’
；反向引物序列为5
’-
tccccgcggacagtcaactt-3
’
。
[0027]
进一步地，步骤2.1)中所获得的crispr/cas9系统基因序列如seq id no.10所示；步骤2.2)中所获得的“睡美人”转座子序列如seq id no.9所示。
[0028]
进一步地，步骤2.4)中所述的特异性sgrna退火的具体步骤为：
①
37℃反应30-35min；
②
以3-5℃/min速度从95℃降至25℃。
[0029]
进一步地，步骤2.4)中所述的特异性sgrna包括但不限于nanog基因的sgrna。
[0030]
进一步地，步骤3)中携带特异性sgrna的pt2spcas9重组质粒与crispr/cas9基因载体的质量比为1:(5～30)。
[0031]
本发明的有益效果为：载体中的ha，使pda/dex-pei@ha具有肿瘤细胞靶向性；载体中的dex使pda/dex-pei@ha具有细胞核靶向性；“睡美人”转座子具有强大的转座能力，能将crispr/cas9系统插入宿主基因组。因此pda/dex-pei@ha具有细胞靶向性，细胞核靶向性，基因转座能力，三者协同作用提高crispr/cas9的基因编辑效率，而pda/dex-pei@ha的细胞毒性低，生物安全性高，并且制备方法简单，条件温和，是优秀的crispr/cas9基因传递载体。
附图说明
[0032]
图1为用pcr方法扩增“睡美人”转座子pt2bh质粒中转座子基因的电泳鉴定图；
[0033]
图2为用限制性内切酶剪切得到px459质粒中的crispr/cas9系统的电泳鉴定图；
[0034]
图3(a)和图3(b)为pt2spcas9重组质粒的酶切电泳鉴定图，图3(a)ecori酶切，图3(b)sacii酶切；
[0035]
图4(a)和图4(b)为对pt2spcas9重组质粒进行pcr鉴定图，图4(a)用u6引物进行pcr，图4(b)用pt2bh引物对进行pcr；
[0036]
图5为pt2spcas9-nanog重组质粒的基因测序结果图；
[0037]
图6(a)至图6(e)为pdph基因载体的红外光谱图：图6(a)pda、图6(b)dex、图6(c)ha、图6(d)pdph
10k
、图6(e)pdph
25k
；
[0038]
图7(a)至图7(c)为pdph基因载体的透射电镜图：图7(a)pda、图7(b)pdph
25k
/dna、图7(c)pdph
10k
/dna；
[0039]
图8为pdph
10k
和pdph
25k
凝胶缓滞图；
[0040]
图9为pdph
25k
和pdph
10k
的转染效率对比图；
[0041]
图10为pph
25k
、pdp
25k
和pdph
25k
的转染效率对比图；
[0042]
图11为经过ha抑制后pdph
25k
的转染效率对比图；
[0043]
图12，其包a-d，为pdph
25k
和pdph
10k
的细胞内分布结果图：图12中的a和b为转染2h后、图12中的c和d为转染4h后；
[0044]
图13为pei
10k
、pei
25k
、dex、pdph
25k
和pdph
10k
的细胞毒性结果图；
[0045]
图14为pdph
25k
传递pt2spcas9-nanog后的细胞划痕结果图；
[0046]
图15为western blot检测基因转染后nanog蛋白的敲除结果图；
[0047]
图16为pcr法验证pt2spcas9-nanog插入宿主基因组的结果图。
具体实施方式
[0048]
以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049]
有关本发明的前述及其技术内容、特点与功效，在以下配合参考附图的实施例的详细说明中，将可清楚的呈现。
[0050]
除非另外说明，本文中的术语“聚多巴胺”指的是由多巴胺在碱性加热条件下自聚所得，在附图中以缩写“pda”表示。
[0051]
除非另外说明，本文中的术语“地塞米松”，在附图中以缩写“dex”表示。
[0052]
除非另外说明，本文中的术语“pda-pei-ha”指的是使用上述聚多巴胺为载体，修饰透明质酸和聚乙烯亚胺所形成的复合物，在附图中以缩写“pph”表示。
[0053]
除非另外说明，本文中的术语“pda/dex-pei”指的是使用上述聚多巴胺为载体，负载地塞米松和聚乙烯亚胺所形成的复合物，在附图中以缩写“pdp”表示。
[0054]
除非另外说明，本文中的术语“pda/dex-pei@ha”指的是使用上述聚多巴胺为载体，负载地塞米松并修饰透明质酸和聚乙烯亚胺所形成的复合物，在附图中以缩写“pdph”表示。
[0055]
除非另外说明，本文中的术语“pph
25k”指的是使用上述聚多巴胺为载体，修饰透明质酸和25k分子量的聚乙烯亚胺所形成的复合物。
[0056]
除非另外说明，本文中的术语“pdp
25k”指的是使用上述聚多巴胺为载体，负载地塞米松并用25k分子量的聚乙烯亚胺所形成的复合物。
[0057]
除非另外说明，本文中的术语“pdph
25k”指的是使用上述聚多巴胺为载体，负载地塞米松并用透明质酸和25k分子量的聚乙烯亚胺所形成的复合物。
[0058]
实施例1：“睡美人”转座子crispr/cas9重组质粒的构建
[0059]
1)对pt2bh(购自addgene：#26556)质粒中的“睡美人”转座子序列进行pcr扩增。pcr反应体系为：5ng/μl的pt2bh质粒6μl、5μl的10
×
beyofusion buffer(with mg
2+
)、10μl的dntps(每种均为2.5mm)、引物各2μl(每种均为10mm)、1μl的fusion聚合酶(2.5u/μl)以及24μl的灭菌水。
[0060]
pt2bh引物序列如下：
[0061]
pt2bh-f：5
’-
ccggaattccgggctaccaaatactaattg-3
’
(seq id no.1)
[0062]
pt2bh-r：5
’-
tccccgcggacagtcaactt-3
’
(seq id no.2)
[0063]
pcr反应程序为：
[0064]
①
92℃反应5min；
②
92℃反应30s；
③
56℃反应30s；
④
68℃反应1min；
⑤
将步骤
②
～
④
重复30个循环；
⑥
68℃反应15min。
[0065]
经过琼脂糖凝胶电泳鉴定，pcr扩增所得“睡美人”转座子序列长度为3.3kb，具体序列为除去345bp到531bp之间剩余的全部序列(seq id no.9)，结果如图1所示。
[0066]
2)对“睡美人”转座子的pcr扩增产物和px459质粒(购自addgene：#62988)进行双酶切。酶切反应体系为：px459质粒或者pcr扩增产物1μg，2μl的10
×
buffer(t)，ecori和sacii各1μl，2μl的0.1％bsa，9μl的灭菌水，在37℃水浴锅中反应2h。
[0067]
所得的双酶切产物用凝胶电泳鉴定，并切胶回收与纯化。结果如图2所示，px459质粒酶切得到crispr/cas9基因的长度为6.47kb(seq id no.10)，“睡美人”转座子基因长度为3.3kb。
[0068]
3)双酶切产物连接得到重组质粒。连接反应体系如下：“睡美人”转座子的pcr后的双酶切产物50ng，px459质粒的双酶切产物250ng，10
×
t4连接酶buffer 5μl，t4连接酶1μl，10μl的灭菌水。上述体系在4℃下反应12h，即得连接产物。将其转化至感受态细胞中，在37℃下培养过夜。取若干转化后的菌落加入10ml的含有氨苄青霉素的液体lb培养基中在250rpm，37℃条件下振荡培养过夜后提取质粒，即得pt2spcas9重组质粒，其长度为9.8kb。
[0069]
4)pt2spcas9重组质粒的鉴定。
[0070]
首先，用ecori或sacii对pt2spcas9进行酶切鉴定，酶切反应体系为：pt2spcas9 1μg，10
×
buffer(t)2μl，ecori或sacii 1μl，灭菌水9μl。将酶切反应体系在37℃水浴中反应2h，用凝胶电泳鉴定，以pt2bh、px459质粒作为对照。结果如图3(a)，图3(b)所示，由于pt2spcas9中ecori和sacii的酶切位点均只有一个，所得酶切产物为9.8kb，与pt2bh、px459质粒的酶切产物不同，因此可判断重组质粒制备成功。
[0071]
然后用pcr方法对重组质粒pt2spcas9中的crispr/cas9系统序列以及“睡美人”转座子序列进行验证，分别使用u6引物和pt2bh引物。pcr反应体系为：重组质粒10ng，5μl的10
×
beyo fusion buffer(with mg
2+
)，10μl的dntps((每种均为2.5mm))，引物对各2μl(每种均为10mm)，1μl的fusion聚合酶(2.5u/μl)，8μl灭菌水。
[0072]
u6引物的序列如下：
[0073]
u6-f：5
’-
cccaagcttagaattggcgcacgc-3
’
(seq id no.3)
[0074]
u6-r：5
’-
ggactagtgcgagggcctatttccc-3
’
(seq id no.4)
[0075]
用u6引物进行的pcr反应程序为：
①
94℃反应5min；
②
94℃反应30s；
③
57℃反应30s；
④
72℃反应90s；
⑤
将步骤
②
～
④
重复30个循环；
⑥
72℃反应15min。
[0076]
结果如图4(a)所示，扩增得到长度为414bp的基因片段，说明pt2spcas9中含有crispr/cas9系统的相关序列。
[0077]
pt2bh引物的序列如上所述。
[0078]
用pt2bh引物进行的pcr反应程序为：
[0079]
①
92℃反应5min；
②
92℃反应30s；
③
56℃反应30s；
④
68℃反应1min；
⑤
将步骤
②
～
④
重复30个循环；
⑥
68℃反应15min。
[0080]
结果如图4(b)所示，扩增出的序列长度为3.3kb，说明pt2spcas9含有“睡美人”转座子的相关序列，因此可判断重组载体制备成功。
[0081]
(2)pt2spcas9-nanog质粒的制备
[0082]
本发明以nanog基因为例，构建靶向nanog基因的pt2spcas9-nanog质粒，验证其基
因编辑效率。靶向nanog基因的sgrna序列为：
[0083]
nanog-sgrna-f：5
’-
caccggtagctgaggttcaggatgt-3
’
(seq id no.5)
[0084]
nanog-sgrna-r：5
’-
aaacacatcctgaacctcagctacc-3
’
(seq id no.6)
[0085]
将上述合成的sgrna进行退火及磷酸化，退火反应体系为：两条sgrna各1μl(100um)，t4 pnk酶1μl，10
×
buffer 1μl，灭菌水6μl。反应程序为：
①
37℃反应30min；
②
95℃
→
25℃(5℃/min)，得到nanog-sgrna。
[0086]
用bbsi内切酶对pt2spcas9质粒进行酶切，酶切反应体系为：pt2spcas9质粒1μg，10
×
buffer(g)2μl，bbsi限制性核酸内切酶1μl，灭菌水12μl。将反应体系在37℃水浴条件下反应2h，得到酶切产物。
[0087]
取上述酶切产物50ng，nanog-sgrna(1：200稀释)1μl，t4连接酶1μl，10
×
buffer 1μl，灭菌水3μl，在4℃下反应16h，得到pt2spcas9-nanog。
[0088]
对pt2spcas9-nanog进行基因测序鉴定，结果如图5所示，表明nanog-sgrna成功插入pt2spcas9，成功得到pt2spcas9-nanog质粒。
[0089]
实施例2：pda/dex-pei@ha(pdph)纳米粒的制备
[0090]
将氨水(浓度28％)，无水乙醇与去离子水混合均匀，三者的体积比为2:40:(90～180)，20℃～40℃搅拌30分钟。将多巴胺盐酸盐溶解于去离子水中，滴加至上述混合物溶液中(多巴胺盐酸盐的最终浓度为2～7mg/ml)，20℃～40℃搅拌反应24小时，将产物在13000rpm下离心40～60分钟，水洗3次，得到pda纳米粒。将上述获得的pda纳米粒(3-6mg)溶于10-20ml去离子水中并加入2.5-5mg的dex粉末，搅拌24h得到pda/dex。将所得pda/dex滴加至pei
25k
或pei
10k
的水溶液(浓度10mg/ml)中，pda/dex与pei的质量比为1:(1～2)，搅拌24h，将反应混合物装入透析袋中(mwco＝14000)，在蒸馏水中透析72小时，得到pda/dex-pei。将ha的水溶液(1mg/ml)缓慢滴加到pda/dex-pei中，ha与pda/dex-pei的质量比为1:(0.5～1)，搅拌反应4～6小时，得到目标产物pda/dex-pei@ha。
[0091]
在制备pdph时不加入dex即得到pph，pdp为制备pdph时未加入ha的产物，pp为制备pdph时未加入dex和ha的产物。以pph，pdp，pp作为pdph的对照。
[0092]
实施例3：pdph/pt2spcas9-nanog转染复合物的制备
[0093]
将pt2spcas9-nanog缓慢加入pda/dex-pei@ha中，两者的质量为1:(5～30)，涡旋振荡，室温孵育30min即得。
[0094]
图6(a)至图6(e)为本发明实施例2中制备所得pda/dex-pei@ha的红外光谱图，图6(a)为pda，图6(b)为dex，图6(c)为ha，图6(d)为pdph
10k
，图6(e)为pdph
25k
。图谱显示ch
2
骨架的特征峰位置为2924cm-1
和2890cm-1
，透明质酸中c-o-c基团的特征峰位置为1151cm-1
左右，在以上两种不同分子量(pdph
25k
和pdph
10k
)中均有体现，即验证了dex，pei，ha的成功修饰。
[0095]
图7(a)至图7(c)为本发明实施例3中制备所得pdph
25k
和pdph
10k
与dna复合物的透射电镜图，其中图7(a)为pda，图7(b)为pdph
25k
与dna复合物，图7(c)为pdph
10k
与dna复合物。pda的平均粒径在110nm左右，pdph
25k
和pdph
10k
与dna复合物的平均粒径约为120nm左右，表1为动态光散射法(dls)测定pdph与dna在不同质量比时的粒径和电位结果。
[0096]
表1：不同质量比的pdph/dna复合物的粒径和电位结果
[0097][0098][0099]
图8为本发明实施例3中制备所得pdph
25k
和pdph
10k
的dna凝胶缓滞图，每孔加入1μgdna，并按照不同质量比加入pdph
25k
和pdph
10k
，结果说明pdph
25k
和pdph
10k
与dna的质量比大于4：1时，能完全负载dna，进行有效的基因传递。
[0100]
实施例4：转染效率测定
[0101]
(1)pdph
25k
和pdph
10k
的转染效率测定
[0102]
将hela细胞接种于24孔板中密度为2.5
×
10
5
个细胞/孔，培养24h后，取2μg pegfp-n1质粒与pdph
25k
和pdph
10k
按5：1，10：1，15：1，20：1的质量比,分别孵育30分钟，用500μl不含血清的培养基稀释并加入孔中；继续孵育24h后，裂解细胞，取细胞内总蛋白，用酶标仪于488nm波长激发，在520nm波长处检测荧光强度。以下所有转染效率测定的实验步骤均与该实施例同。结果如图9所示，pdph
25k
的转染效率明显高于pdph
10k
，pdph
25k
与dna的质量比为10：1时，转染效率最高。
[0103]
(2)pph
25k
、pdp
25k
和pdph
25k
的转染效率对比
[0104]
用pdph
25k
转染基因至hela细胞，并用pph
25k
、pdp
25k
作为对照。结果如图10所示，pdph
25k
的转染效率明显高于pph
25k
和pdp
25k
，说明ha和dex能显著提高纳米粒的转染效率，这是由于ha具有肿瘤细胞靶向作用，dex具有细胞核靶向作用，能够将目的基因靶向传递至靶细胞和细胞核，提高传递效率。
[0105]
(3)ha抑制后pdph
25k
的转染效率
[0106]
本发明使用4mg/ml的ha与hela细胞预培养4小时，再用pdph
25k
进行细胞转染。结果如图11所示，用ha封闭hela细胞上的ha受体后，pdph
25k
的转染效率显著降低，证明pdph
25k
中的ha具有肿瘤细胞靶向性。
[0107]
实施例5：pdph
25k
和pdph
10k
的细胞内分布结果图
[0108]
将hela细胞接种于24孔板中，密度为2.5
×
10
5
个细胞/孔，培养24h。将dna用fam荧
光标记，然后按照实施例3的方法，将纳米粒与dna-fam混合制备(a)pdp
10k
/dna、(b)pdph
10k
/dna、(c)pdp
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/dna、(d)pdph
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/dna、(e)pp
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/dna、(f)pph
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/dna、(g)pp
25k
/dna、(h)pph
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/dna复合物，然后在细胞中分别加入以上复合物，再继续培养2h(图12中的a，图12中的b)或4h(图12中的c，图12中的d)，用激光共聚焦显微镜观察。结果表明，含有dex的pdp
10k
、pdp
25k
、pdph
10k
、pdph
25k
纳米粒能够将dna传递至细胞核(如图中箭头所指)；而不含有dex的pp
10k
、pp
25k
、pph
10k
、pph
25k
纳米粒没有将dna传递至细胞核。相比其它纳米粒，同时含有dex和ha的pdph
10k
、pdph
25k
纳米粒，能将更多的dna传递至细胞核。转染4h的处理组中细胞核的荧光强度明显高于转染2h的处理组。这说明dex具有细胞核靶向性，ha具有细胞靶向性，且随着转染时间的增加，dna的摄取明显增加。
[0109]
实施例6：pdph的细胞毒性
[0110]
将hela细胞接种于96孔板中，密度为5
×
10
3
个细胞/孔，培养24h后分别加入1、10、20、50、100μg/ml的pei
25k
、pei
10k
、dex、pdph
25k
、pdph
10k
；孵育48h后加入20μl mtt继续孵育4h，弃去培养液，用100μl dmso溶解紫色结晶，用酶标仪于492nm下读取od值，并计算细胞存活率。结果如图13所示，在检测浓度内，pdph
25k
和pdph
10k
均没有毒性，细胞活性都大于80％的，而pei
25k
、pei
10k
具有明显的细胞毒性，说明pdph的毒性低，具较高的生物相容性，适合临床应用。
[0111]
实施例7：细胞划痕实验
[0112]
将hela细胞接种于24孔板中，密度为2.5
×
10
5
个细胞/孔，培养24h后，取2μg pt2spcas9-nanog质粒加入20μg pdph
25k
的水溶液，涡旋振荡，室温孵育30分钟，用500μl无血清培养基稀释后，与hela细胞孵育24h，然后换为含2％血清的培养基，对细胞进行划痕处理，继续培养细胞，在0h，6h，12h，24h进行拍照对比。结果如图14所示，未使用pdph
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/pt2spcas9-nanog转染的空白对照组在24h后细胞划痕宽度明显减少，说明细胞具有迁移能力。而经过pdph
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/pt2spcas9-nanog转染的细胞，在敲除nanog基因后，未观察到明显的细胞愈合现象，细胞已经不具备迁移能力。
[0113]
实施例8：western blot检测nanog基因的敲除
[0114]
将hela细胞接种于24孔板中，密度为2.5
×
10
5
个细胞/孔，培养24h后，取pt2spcas9-nanog质粒2μg加入20μg pdph
25k
或pdph
10k
，涡旋振荡，室温孵育30分钟，用500μl无血清培养基稀释后，加入细胞中孵育48h，裂解细胞并提取细胞总蛋白，通过western blot检测细胞内nanog蛋白的含量。结果如图15所示，相比于空白对照组，pdph
25k
或pdph
10k
转染组的nanog基因表达明显降低，说明用pdph传递pt2spcas9-nanog后，能够有效敲除nanog基因，导致nanog蛋白表达水平显著降低。
[0115]
实施例9：pcr法验证pt2spcas9-nanog插入宿主基因组
[0116]
将hela细胞接种于24孔板中密度为2.5
×
10
5
个细胞/孔，培养24h后，取pt2spcas9-nanog质粒2μg加入20μg pdph
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的水溶液中，涡旋振荡，室温孵育30分钟，用500μl无血清培养基稀释后，加入细胞中孵育48h，裂解细胞并提取细胞基因组dna，用pcr法检测细胞基因组中是否插入了crispr/cas9基因。
[0117]
pcr反应体系为：细胞基因组dna 150ng，引物各1.6μl(10μm)，taq dna聚合酶0.1μl，dntp 1.6μl，10
×
buffer 2μl，灭菌水12μl。
[0118]
pcr引物为：
[0119]
u6-f-2:5
’-
gagggcctatttcccatgattccttc-3
’
(seq id no.7)
[0120]
u6-r-2:5
’-
atttgtctgcagaattggcgcac-3
’
(seq id no.8)
[0121]
pcr反应程序为：
①
94℃反应3min；
②
94℃反应30s；
③
54℃反应30s；
④
72℃反应45s；
⑤
将步骤
②
～
④
重复30个循环；
⑥
72℃反应15min。
[0122]
结果如图16所示，用pdph
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仅转染pt2spcas9质粒的对照组，细胞基因组中未扩增出crispr/cas9基因的相关条带，说明crispr/cas9基因没有被插入细胞基因组中；而用pdph
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转染pt2spcas9+sb11(睡美人转座酶)的实验组扩增得到长度410bp的片段，符合预期，说明转座子能够将crispr/cas9基因插入细胞基因组内，从而提高其基因编辑效率。

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