商标分类 
商标转让 
您当前的位置： 一种提高L-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法与流程
2021-02-02 09:02:42|
374|
起点商标网 一种提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法
技术领域
[0001]
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法。
背景技术：
[0002]
近年来，随着新型甜味剂阿斯巴甜的市场需求量日益增大，l-苯丙氨酸（l-phenylalanine，l-phe）作为生产阿斯巴甜的主要原料，其需求迅速增大。除此之外，l-phe 在药物活性化合物，如抗炎药、中枢神经系统神经肽、hiv蛋白酶抑制剂和维生素b
6
等应用广泛，还可作为抗癌药物的载体，有效的将抗癌药物导入肿瘤位置，在增强治疗效果的同时，大幅度降低了药物的副作用，这意味着在医药领域的应用越来越受到重视。
[0003]
随着国内消耗l-苯丙氨酸总量的不断增大，目前国内生产的 l-phe 已不能满足需求，进口份额越来越大，利用大肠杆菌发酵生成苯丙氨酸，糖酸转化率仅在25%左右，产量大多在50-80 g/l，较理论值具有较大的提升空间。因此如何进一步提高微生物发酵法生产l-苯丙氨酸的产率和糖酸转化率成为了推动l-苯丙氨酸产业可持续发展的关键问题。
技术实现要素：
[0004]
本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法。
[0005]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，采用苯丙氨酸大肠杆菌生产菌经发酵获得l-苯丙氨酸，在发酵过程中随有机氮源流加氨基酸螯合微量元素，所述随有机氮源流加的氨基酸螯合微量元素由蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙组成，各组分重量体积（mg/l）比为75-140 ：50-100 ：30-70 ：25-60 ：60-100。
[0006]
优选的，上述提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，采用的发酵培养基成分为：mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h2o 7 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁75-140 mg/l，谷氨酸螯合锰50-100 mg/l，谷氨酸螯合锌30-70 mg/l，酪氨酸螯合铜25-60 mg/l，谷氨酸螯合钙60-100 mg/l，其中酵母粉、蛋白胨与氨基酸螯合物单独配置用作过程流加。
[0007]
氨基酸螯合微量元素通过氨基酸与金属阳离子的螯合反应，把无机元素变为有机元素。无机盐形式的微量元素，其利用率易受ph值、维生素、磷酸等环境与培养基成分的影响，而氨基酸螯合物形式的微量元素由于其化学性能稳定，分子内电荷趋于中性，可有效防止微量元素离子形成不溶解的化合物，或防止其被吸附在阻碍元素吸收的不溶性胶体上，因而有利于机体吸收普通的无机元素，通过螯合，即增加了有效氨基酸的营养成分，又增强了微量元素的吸收效果，提高细胞生长速率和细胞活力，进而提高苯丙氨酸产量和糖酸转
化效率。
[0008]
优选的，上述提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，所述随有机氮源流加氨基酸螯合微量元素的具体方法为：将所述发酵培养基中有机氮源酵母粉和蛋白胨按实际添加比例单独配制后定容至发酵罐最大装填系数的8-12%，并与氨基酸螯合微量元素混合均匀后在发酵过程中流加，发酵开始时一次性加入40-50%，剩余部分流加至菌体对数生长中后期。如：使用5 l发酵罐，发酵培养初始装填系数为60%，即3 l，则需mgso
4
.7h
2
o 6 g，酵母粉12 g，蛋白胨3.6 g，柠檬酸3 g，k
2
hpo
4
.3h
2
o 21 g，酪氨酸3 g，谷氨酸2.4 g，v
b1
、v
b 3
、v
b 5
各6 ml，卡那霉素30 mg，蛋氨酸螯合铁75 mg/l，谷氨酸螯合锰50 mg/l，谷氨酸螯合锌30 mg/l，酪氨酸螯合铜25 mg/l，谷氨酸螯合钙60 mg/l。其中mgso
4
.7h
2
o 、柠檬酸、k
2
hpo
4
.3h
2
o 、酪氨酸、谷氨酸、v
b1
、v
b 3
、v
b 5
、卡那霉素直接进罐，随罐灭菌；酵母粉、蛋白胨、各氨基酸螯合微量元素单独配置并定容至400-600 ml，在发酵过程中流加使用。
[0009]
优选的，上述提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，发酵过程包括缺陷物质：酪氨酸的流加，具体为随80%葡萄糖溶液流加，用量为每升糖液混合1g酪氨酸，方法为酪氨酸利用naoh溶液溶解后单独灭菌，待糖液与酪氨酸溶液均冷却后混匀。
[0010]
优选的，上述提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，具备步骤如下：菌种活化：取甘油保菌管中大肠杆菌菌株置于斜面培养基上传代活化，所述斜面培养基成分为葡萄糖1.5 g/l，酵母粉6 g/l，蛋白胨10 g/l，k
2
hpo
4.
3h
2
o 0.8 g/l，酪氨酸1 g/l，琼脂粉25 g/l；种子培养：活化好的菌株于种子培养基中进行种子培养，温度为36
±
1℃，ph通过氨水控制在6.8~7.2，种子培养基成分为：葡萄糖30 g/l，酵母粉5 g/l，蛋白胨1 g/l，柠檬酸1.2 g/l，mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，kh
2
po
4 2.0 g/l，硫酸铵2.0 g/l，v
b1 1 mg/l，feso
4
.7h
2
o 10 mg/l，mnso
4
.h
2
o 5 mg/l，维生素h 1 mg/l，酪氨酸3 g/l，卡那霉素20 mg/l；发酵培养：按20%~30%菌体接种量接种到发酵培养基，发酵温度为36
±
1℃，调节通气量与转速维持do在30-50%，ph通过氨水控制在6.8~7.2；罐内葡萄糖浓度通过流加80%葡萄糖溶液维持在0-1 g/l，并随糖液流加菌株缺陷物质：酪氨酸，每升糖液混合1 g酪氨酸，酪氨酸利用naoh溶液溶解后单独灭菌，待糖液与酪氨酸溶液均冷却后混匀，所述发酵培养基成分为：mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h2o 7 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁75-140 mg/l，谷氨酸螯合锰50-100 mg/l，谷氨酸螯合锌30-70 mg/l，酪氨酸螯合铜25-60 mg/l，谷氨酸螯合钙60-100 mg/l；其中酵母粉、蛋白胨、蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙单独配置，并在发酵过程中流加。
[0011]
优选的，上述提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，所述随有机氮源流加的蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙的用量分别为110-130 mg/l、60-70 mg/l、50-60 mg/l、45-50 mg/l、70-80 mg/l。
[0012]
有益效果：上述提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，采用氨基酸螯合微量元素流加发酵技术，在发酵过程中流加一定量的氨基酸螯合微量元素，流加氨基酸螯合微量元素包括蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜，氨基酸与金属阳离子的螯合反应，把无机元素变为有机元素，形成化学性能更为稳定的氨基酸螯合物，可有效防止微量
元素离子形成不溶解的化合物，提高了细胞生长速率和细胞活力，进而提高苯丙氨酸的产量和糖酸转化效率。发酵50 h，菌体干重达到最高达到64.8 g/l，l-苯丙氨酸最高产量为94.3 g/l，糖酸转化率为29%，分别比对照实验分别提高了22.3%、17.6%和15.5%，在不增加额外设备与人力投入的情况下，实现了菌体量的提高、l-苯丙氨酸产量和转化率的大幅提高，提高了经济效益，适合于工业化生产。
具体实施方式
[0013]
下述实施例中使用的生产菌为大肠杆菌，购自天津科技大学代谢工程实验室。
[0014]
实施例1一种提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，具体步骤如下：菌种活化：取甘油保菌管中大肠杆菌菌株置于斜面培养基上传代活化，所述斜面培养基成分为葡萄糖1.5 g/l，酵母粉6 g/l，蛋白胨10 g/l，k
2
hpo
4.
3h
2
o 0.8 g/l，酪氨酸1 g/l，琼脂粉25 g/l；种子培养：活化好的菌株于种子培养基中进行种子培养，温度为36
±
1℃，ph通过氨水控制在6.8~7.2，种子培养基成分为葡萄糖30 g/l，酵母粉5 g/l，蛋白胨1 g/l，柠檬酸1.2 g/l，mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，kh
2
po
4 2.0 g/l，硫酸铵2.0 g/l，v
b1 1 mg/l，feso
4
.7h
2
o 10 mg/l，mnso
4
.h
2
o 5 mg/l，维生素h 1 mg/l，酪氨酸3 g/l，卡那霉素20 mg/l；发酵培养：按25%菌体接种量接种到发酵培养基，发酵温度为36
±
1℃，调节通气量与转速维持do在30-50%，ph通过氨水控制在6.8~7.2；罐内葡萄糖浓度通过流加80%葡萄糖溶液维持在0-1 g/l，并随糖液流加菌株缺陷物质：酪氨酸，每升糖液混合1 g酪氨酸，酪氨酸利用naoh溶液溶解后单独灭菌，待糖液与酪氨酸溶液均冷却后混匀。发酵培养基成分为：mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁75-140 mg/l，谷氨酸螯合锰50-100 mg/l，谷氨酸螯合锌30-70 mg/l，酪氨酸螯合铜25-60 mg/l，谷氨酸螯合钙60-100 mg/l；其中酵母粉、蛋白胨、蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙单独配置，并在发酵过程中流加。
[0015]
流加80%葡萄糖溶液维持罐内葡萄糖浓度在0-1 g/l，并随糖液流加菌株缺陷物质：酪氨酸，每升糖液混合1 g酪氨酸。其中酪氨酸利用naoh溶液溶解后单独灭菌，待糖液与酪氨酸溶液均冷却后混匀。
[0016]
实施例2该部分实施例未使用氨基酸螯合物，而是添加氨基酸螯合物等质量浓度的金属离子，旨在作为对照组1与实施例6-11形成对比。使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，feso
4 52 mg/l，mnso
4 27.5 mg/l，znso
4 30 mg/l，cuso
4 25mg/，cacl
2 25 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l；灭菌条件：0.1 mpa，121℃，20 min；发酵50 h结束。放罐时，菌体干重为54 g/l，l-苯丙氨酸的产量为83.5 g/l，糖酸转化率为25%。
[0017]
实施例3该部分实施例未使用氨基酸螯合物，而是添加氨基酸螯合物等质量浓度的氨基酸，旨
在作为对照组2与实施例6-11形成对比。使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酪氨酸1.039 g/l，谷氨酸964 mg/l，蛋氨酸100 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l；灭菌条件：0.1 mpa，121℃，20 min；发酵50 h结束。放罐时，菌体干重为46 g/l，l-苯丙氨酸的产量为67 g/l，糖酸转化率为16%。
[0018]
实施例4该部分实施例未使用氨基酸螯合物，而是添加氨基酸螯合物等质量浓度的氨基酸与金属离子，旨在作为对照组3与实施例6-11形成对比。使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酪氨酸1.039 g/l，谷氨酸964 mg/l，蛋氨酸100 mg/l，feso
4 52 mg/l，mnso
4 27.5 mg/l，znso
4 30 mg/l，cuso
4 25mg/，cacl
2 25 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l；灭菌条件：0.1 mpa，121℃，20 min；发酵50 h结束。放罐时，菌体干重为55 g/l，l-苯丙氨酸的产量为85.9 g/l，糖酸转化率为25.6%。
[0019]
实施例5该部分实施例未使用氨基酸螯合物，同时不添加氨基酸螯合物对应质量浓度的氨基酸与金属离子，旨在作为对照组4与实施例6-11形成对比。使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l；灭菌条件：0.1 mpa，121℃，20 min；发酵50 h结束。放罐时，菌体干重为44 g/l，l-苯丙氨酸的产量为66.3 g/l，糖酸转化率为16%。
[0020]
实施例6该部分实施例使用氨基酸螯合微量元素随有机氮源流加，对本发明做出解释。
[0021]
使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l；发酵过程通过流加有机氮源与氨基酸螯合微量元素（酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙分别为75 mg/l、50 mg/l、30 mg/l、25 mg/l，60 mg/l，流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期），发酵50 h结束。放罐时，菌体干重达到55.4 g/l，l-苯丙氨酸的产量为86.2 g/l，糖酸转化率为26.1%。
[0022]
实施例7该部分实施例使用氨基酸螯合微量元素随有机氮源流加，对本发明做出解释。
[0023]
使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁90 mg/l，谷氨酸螯合锰55 mg/l，谷氨酸螯合锌40 mg/l，酪氨酸螯合铜35 mg/l，谷氨酸螯合钙65 mg/l；其中酵母粉、蛋白胨、蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨
酸螯合钙单独配置并在发酵过程流加；流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期，发酵50 h结束。放罐时，菌体干重达到57.4 g/l，l-苯丙氨酸的产量为88.3 g/l，糖酸转化率为26.8%。
[0024]
实施例8该部分实施例使用氨基酸螯合微量元素随有机氮源流加，对本发明做出解释。
[0025]
使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁110 mg/l，谷氨酸螯合锰60 mg/l，谷氨酸螯合锌50 mg/l，酪氨酸螯合铜45 mg/l，谷氨酸螯合钙70 mg/l；其中酵母粉、蛋白胨、蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙单独配置并在发酵过程流加；流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期，发酵50 h结束。放罐时，菌体干重达到61 g/l，l-苯丙氨酸的产量为91.7 g/l，糖酸转化率为27.8%。
[0026]
实施例9该部分实施例使用氨基酸螯合微量元素随有机氮源流加，对本发明做出解释。
[0027]
使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁120 mg/l，谷氨酸螯合锰65 mg/l，谷氨酸螯合锌55 mg/l，酪氨酸螯合铜47 mg/ll，谷氨酸螯合钙75 mg/l；其中酵母粉、蛋白胨、蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙单独配置并在发酵过程流加；流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期，发酵50 h结束。流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期），发酵50 h结束。放罐时，菌体干重达到64.8 g/l，l-苯丙氨酸的产量为94.3 g/l，糖酸转化率为29%，。
[0028]
实施例10该部分实施例使用氨基酸螯合微量元素随有机氮源流加，对本发明做出解释。
[0029]
使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁130 mg/l，谷氨酸螯合锰70 mg/l，谷氨酸螯合锌60 mg/l，酪氨酸螯合铜50 mg/ll，谷氨酸螯合钙80 mg/l；其中酵母粉、蛋白胨、蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙单独配置并在发酵过程流加；流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期，发酵50 h结束。流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期），发酵50 h结束。放罐时，菌体干重达到65.1 g/l，l-苯丙氨酸的产量为92.7 g/l，糖酸转化率为27.3%。
[0030]
实施例11该部分实施例使用氨基酸螯合微量元素随有机氮源流加，对本发明做出解释。
[0031]
使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸
800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁140 mg/l，谷氨酸螯合锰100 mg/l，谷氨酸螯合锌70 mg/l，酪氨酸螯合铜60 mg/ll，谷氨酸螯合钙100 mg/l；其中酵母粉、蛋白胨、蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙单独配置并在发酵过程流加；流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期，发酵50 h结束。流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期），发酵50 h结束。放罐时，菌体干重达到66.3 g/l，l-苯丙氨酸的产量为87.6 g/l，糖酸转化率为25.3%。
[0032]
结果表明，采用本发明可有效提高发酵生产l-苯丙氨酸的糖酸转化率与产量，同时提高了生物量，提升了经济效益，适合于工业化生产。
[0033]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
技术领域
[0001]
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法。
背景技术：
[0002]
近年来，随着新型甜味剂阿斯巴甜的市场需求量日益增大，l-苯丙氨酸（l-phenylalanine，l-phe）作为生产阿斯巴甜的主要原料，其需求迅速增大。除此之外，l-phe 在药物活性化合物，如抗炎药、中枢神经系统神经肽、hiv蛋白酶抑制剂和维生素b
6
等应用广泛，还可作为抗癌药物的载体，有效的将抗癌药物导入肿瘤位置，在增强治疗效果的同时，大幅度降低了药物的副作用，这意味着在医药领域的应用越来越受到重视。
[0003]
随着国内消耗l-苯丙氨酸总量的不断增大，目前国内生产的 l-phe 已不能满足需求，进口份额越来越大，利用大肠杆菌发酵生成苯丙氨酸，糖酸转化率仅在25%左右，产量大多在50-80 g/l，较理论值具有较大的提升空间。因此如何进一步提高微生物发酵法生产l-苯丙氨酸的产率和糖酸转化率成为了推动l-苯丙氨酸产业可持续发展的关键问题。
技术实现要素：
[0004]
本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法。
[0005]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，采用苯丙氨酸大肠杆菌生产菌经发酵获得l-苯丙氨酸，在发酵过程中随有机氮源流加氨基酸螯合微量元素，所述随有机氮源流加的氨基酸螯合微量元素由蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙组成，各组分重量体积（mg/l）比为75-140 ：50-100 ：30-70 ：25-60 ：60-100。
[0006]
优选的，上述提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，采用的发酵培养基成分为：mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h2o 7 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁75-140 mg/l，谷氨酸螯合锰50-100 mg/l，谷氨酸螯合锌30-70 mg/l，酪氨酸螯合铜25-60 mg/l，谷氨酸螯合钙60-100 mg/l，其中酵母粉、蛋白胨与氨基酸螯合物单独配置用作过程流加。
[0007]
氨基酸螯合微量元素通过氨基酸与金属阳离子的螯合反应，把无机元素变为有机元素。无机盐形式的微量元素，其利用率易受ph值、维生素、磷酸等环境与培养基成分的影响，而氨基酸螯合物形式的微量元素由于其化学性能稳定，分子内电荷趋于中性，可有效防止微量元素离子形成不溶解的化合物，或防止其被吸附在阻碍元素吸收的不溶性胶体上，因而有利于机体吸收普通的无机元素，通过螯合，即增加了有效氨基酸的营养成分，又增强了微量元素的吸收效果，提高细胞生长速率和细胞活力，进而提高苯丙氨酸产量和糖酸转
化效率。
[0008]
优选的，上述提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，所述随有机氮源流加氨基酸螯合微量元素的具体方法为：将所述发酵培养基中有机氮源酵母粉和蛋白胨按实际添加比例单独配制后定容至发酵罐最大装填系数的8-12%，并与氨基酸螯合微量元素混合均匀后在发酵过程中流加，发酵开始时一次性加入40-50%，剩余部分流加至菌体对数生长中后期。如：使用5 l发酵罐，发酵培养初始装填系数为60%，即3 l，则需mgso
4
.7h
2
o 6 g，酵母粉12 g，蛋白胨3.6 g，柠檬酸3 g，k
2
hpo
4
.3h
2
o 21 g，酪氨酸3 g，谷氨酸2.4 g，v
b1
、v
b 3
、v
b 5
各6 ml，卡那霉素30 mg，蛋氨酸螯合铁75 mg/l，谷氨酸螯合锰50 mg/l，谷氨酸螯合锌30 mg/l，酪氨酸螯合铜25 mg/l，谷氨酸螯合钙60 mg/l。其中mgso
4
.7h
2
o 、柠檬酸、k
2
hpo
4
.3h
2
o 、酪氨酸、谷氨酸、v
b1
、v
b 3
、v
b 5
、卡那霉素直接进罐，随罐灭菌；酵母粉、蛋白胨、各氨基酸螯合微量元素单独配置并定容至400-600 ml，在发酵过程中流加使用。
[0009]
优选的，上述提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，发酵过程包括缺陷物质：酪氨酸的流加，具体为随80%葡萄糖溶液流加，用量为每升糖液混合1g酪氨酸，方法为酪氨酸利用naoh溶液溶解后单独灭菌，待糖液与酪氨酸溶液均冷却后混匀。
[0010]
优选的，上述提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，具备步骤如下：菌种活化：取甘油保菌管中大肠杆菌菌株置于斜面培养基上传代活化，所述斜面培养基成分为葡萄糖1.5 g/l，酵母粉6 g/l，蛋白胨10 g/l，k
2
hpo
4.
3h
2
o 0.8 g/l，酪氨酸1 g/l，琼脂粉25 g/l；种子培养：活化好的菌株于种子培养基中进行种子培养，温度为36
±
1℃，ph通过氨水控制在6.8~7.2，种子培养基成分为：葡萄糖30 g/l，酵母粉5 g/l，蛋白胨1 g/l，柠檬酸1.2 g/l，mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，kh
2
po
4 2.0 g/l，硫酸铵2.0 g/l，v
b1 1 mg/l，feso
4
.7h
2
o 10 mg/l，mnso
4
.h
2
o 5 mg/l，维生素h 1 mg/l，酪氨酸3 g/l，卡那霉素20 mg/l；发酵培养：按20%~30%菌体接种量接种到发酵培养基，发酵温度为36
±
1℃，调节通气量与转速维持do在30-50%，ph通过氨水控制在6.8~7.2；罐内葡萄糖浓度通过流加80%葡萄糖溶液维持在0-1 g/l，并随糖液流加菌株缺陷物质：酪氨酸，每升糖液混合1 g酪氨酸，酪氨酸利用naoh溶液溶解后单独灭菌，待糖液与酪氨酸溶液均冷却后混匀，所述发酵培养基成分为：mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h2o 7 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁75-140 mg/l，谷氨酸螯合锰50-100 mg/l，谷氨酸螯合锌30-70 mg/l，酪氨酸螯合铜25-60 mg/l，谷氨酸螯合钙60-100 mg/l；其中酵母粉、蛋白胨、蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙单独配置，并在发酵过程中流加。
[0011]
优选的，上述提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，所述随有机氮源流加的蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙的用量分别为110-130 mg/l、60-70 mg/l、50-60 mg/l、45-50 mg/l、70-80 mg/l。
[0012]
有益效果：上述提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，采用氨基酸螯合微量元素流加发酵技术，在发酵过程中流加一定量的氨基酸螯合微量元素，流加氨基酸螯合微量元素包括蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜，氨基酸与金属阳离子的螯合反应，把无机元素变为有机元素，形成化学性能更为稳定的氨基酸螯合物，可有效防止微量
元素离子形成不溶解的化合物，提高了细胞生长速率和细胞活力，进而提高苯丙氨酸的产量和糖酸转化效率。发酵50 h，菌体干重达到最高达到64.8 g/l，l-苯丙氨酸最高产量为94.3 g/l，糖酸转化率为29%，分别比对照实验分别提高了22.3%、17.6%和15.5%，在不增加额外设备与人力投入的情况下，实现了菌体量的提高、l-苯丙氨酸产量和转化率的大幅提高，提高了经济效益，适合于工业化生产。
具体实施方式
[0013]
下述实施例中使用的生产菌为大肠杆菌，购自天津科技大学代谢工程实验室。
[0014]
实施例1一种提高l-苯丙氨酸发酵产率和糖酸转化率的方法，具体步骤如下：菌种活化：取甘油保菌管中大肠杆菌菌株置于斜面培养基上传代活化，所述斜面培养基成分为葡萄糖1.5 g/l，酵母粉6 g/l，蛋白胨10 g/l，k
2
hpo
4.
3h
2
o 0.8 g/l，酪氨酸1 g/l，琼脂粉25 g/l；种子培养：活化好的菌株于种子培养基中进行种子培养，温度为36
±
1℃，ph通过氨水控制在6.8~7.2，种子培养基成分为葡萄糖30 g/l，酵母粉5 g/l，蛋白胨1 g/l，柠檬酸1.2 g/l，mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，kh
2
po
4 2.0 g/l，硫酸铵2.0 g/l，v
b1 1 mg/l，feso
4
.7h
2
o 10 mg/l，mnso
4
.h
2
o 5 mg/l，维生素h 1 mg/l，酪氨酸3 g/l，卡那霉素20 mg/l；发酵培养：按25%菌体接种量接种到发酵培养基，发酵温度为36
±
1℃，调节通气量与转速维持do在30-50%，ph通过氨水控制在6.8~7.2；罐内葡萄糖浓度通过流加80%葡萄糖溶液维持在0-1 g/l，并随糖液流加菌株缺陷物质：酪氨酸，每升糖液混合1 g酪氨酸，酪氨酸利用naoh溶液溶解后单独灭菌，待糖液与酪氨酸溶液均冷却后混匀。发酵培养基成分为：mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁75-140 mg/l，谷氨酸螯合锰50-100 mg/l，谷氨酸螯合锌30-70 mg/l，酪氨酸螯合铜25-60 mg/l，谷氨酸螯合钙60-100 mg/l；其中酵母粉、蛋白胨、蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙单独配置，并在发酵过程中流加。
[0015]
流加80%葡萄糖溶液维持罐内葡萄糖浓度在0-1 g/l，并随糖液流加菌株缺陷物质：酪氨酸，每升糖液混合1 g酪氨酸。其中酪氨酸利用naoh溶液溶解后单独灭菌，待糖液与酪氨酸溶液均冷却后混匀。
[0016]
实施例2该部分实施例未使用氨基酸螯合物，而是添加氨基酸螯合物等质量浓度的金属离子，旨在作为对照组1与实施例6-11形成对比。使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，feso
4 52 mg/l，mnso
4 27.5 mg/l，znso
4 30 mg/l，cuso
4 25mg/，cacl
2 25 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l；灭菌条件：0.1 mpa，121℃，20 min；发酵50 h结束。放罐时，菌体干重为54 g/l，l-苯丙氨酸的产量为83.5 g/l，糖酸转化率为25%。
[0017]
实施例3该部分实施例未使用氨基酸螯合物，而是添加氨基酸螯合物等质量浓度的氨基酸，旨
在作为对照组2与实施例6-11形成对比。使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酪氨酸1.039 g/l，谷氨酸964 mg/l，蛋氨酸100 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l；灭菌条件：0.1 mpa，121℃，20 min；发酵50 h结束。放罐时，菌体干重为46 g/l，l-苯丙氨酸的产量为67 g/l，糖酸转化率为16%。
[0018]
实施例4该部分实施例未使用氨基酸螯合物，而是添加氨基酸螯合物等质量浓度的氨基酸与金属离子，旨在作为对照组3与实施例6-11形成对比。使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酪氨酸1.039 g/l，谷氨酸964 mg/l，蛋氨酸100 mg/l，feso
4 52 mg/l，mnso
4 27.5 mg/l，znso
4 30 mg/l，cuso
4 25mg/，cacl
2 25 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l；灭菌条件：0.1 mpa，121℃，20 min；发酵50 h结束。放罐时，菌体干重为55 g/l，l-苯丙氨酸的产量为85.9 g/l，糖酸转化率为25.6%。
[0019]
实施例5该部分实施例未使用氨基酸螯合物，同时不添加氨基酸螯合物对应质量浓度的氨基酸与金属离子，旨在作为对照组4与实施例6-11形成对比。使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l；灭菌条件：0.1 mpa，121℃，20 min；发酵50 h结束。放罐时，菌体干重为44 g/l，l-苯丙氨酸的产量为66.3 g/l，糖酸转化率为16%。
[0020]
实施例6该部分实施例使用氨基酸螯合微量元素随有机氮源流加，对本发明做出解释。
[0021]
使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l；发酵过程通过流加有机氮源与氨基酸螯合微量元素（酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙分别为75 mg/l、50 mg/l、30 mg/l、25 mg/l，60 mg/l，流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期），发酵50 h结束。放罐时，菌体干重达到55.4 g/l，l-苯丙氨酸的产量为86.2 g/l，糖酸转化率为26.1%。
[0022]
实施例7该部分实施例使用氨基酸螯合微量元素随有机氮源流加，对本发明做出解释。
[0023]
使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁90 mg/l，谷氨酸螯合锰55 mg/l，谷氨酸螯合锌40 mg/l，酪氨酸螯合铜35 mg/l，谷氨酸螯合钙65 mg/l；其中酵母粉、蛋白胨、蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨
酸螯合钙单独配置并在发酵过程流加；流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期，发酵50 h结束。放罐时，菌体干重达到57.4 g/l，l-苯丙氨酸的产量为88.3 g/l，糖酸转化率为26.8%。
[0024]
实施例8该部分实施例使用氨基酸螯合微量元素随有机氮源流加，对本发明做出解释。
[0025]
使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁110 mg/l，谷氨酸螯合锰60 mg/l，谷氨酸螯合锌50 mg/l，酪氨酸螯合铜45 mg/l，谷氨酸螯合钙70 mg/l；其中酵母粉、蛋白胨、蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙单独配置并在发酵过程流加；流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期，发酵50 h结束。放罐时，菌体干重达到61 g/l，l-苯丙氨酸的产量为91.7 g/l，糖酸转化率为27.8%。
[0026]
实施例9该部分实施例使用氨基酸螯合微量元素随有机氮源流加，对本发明做出解释。
[0027]
使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁120 mg/l，谷氨酸螯合锰65 mg/l，谷氨酸螯合锌55 mg/l，酪氨酸螯合铜47 mg/ll，谷氨酸螯合钙75 mg/l；其中酵母粉、蛋白胨、蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙单独配置并在发酵过程流加；流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期，发酵50 h结束。流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期），发酵50 h结束。放罐时，菌体干重达到64.8 g/l，l-苯丙氨酸的产量为94.3 g/l，糖酸转化率为29%，。
[0028]
实施例10该部分实施例使用氨基酸螯合微量元素随有机氮源流加，对本发明做出解释。
[0029]
使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁130 mg/l，谷氨酸螯合锰70 mg/l，谷氨酸螯合锌60 mg/l，酪氨酸螯合铜50 mg/ll，谷氨酸螯合钙80 mg/l；其中酵母粉、蛋白胨、蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙单独配置并在发酵过程流加；流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期，发酵50 h结束。流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期），发酵50 h结束。放罐时，菌体干重达到65.1 g/l，l-苯丙氨酸的产量为92.7 g/l，糖酸转化率为27.3%。
[0030]
实施例11该部分实施例使用氨基酸螯合微量元素随有机氮源流加，对本发明做出解释。
[0031]
使用5 l发酵罐，培养方法与控制参数与实施例1相同；培养基为mgso
4
.7h
2
o 2 g/l，柠檬酸1 g/l，k
2
hpo
4
.3h
2
o 7 g/l，酵母粉4 g/l，蛋白胨1.2 g/l，酪氨酸1 g/l，谷氨酸
800 mg/l，v
b1 2mg/l，v
b 3 2mg/l，v
b5 2mg/l，卡那霉素10 mg/l，蛋氨酸螯合铁140 mg/l，谷氨酸螯合锰100 mg/l，谷氨酸螯合锌70 mg/l，酪氨酸螯合铜60 mg/ll，谷氨酸螯合钙100 mg/l；其中酵母粉、蛋白胨、蛋氨酸螯合铁、谷氨酸螯合锰、谷氨酸螯合锌、酪氨酸螯合铜、谷氨酸螯合钙单独配置并在发酵过程流加；流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期，发酵50 h结束。流加液共600 ml，发酵开始时一次性加入300 ml，剩余300 ml流加至菌体对数生长后期），发酵50 h结束。放罐时，菌体干重达到66.3 g/l，l-苯丙氨酸的产量为87.6 g/l，糖酸转化率为25.3%。
[0032]
结果表明，采用本发明可有效提高发酵生产l-苯丙氨酸的糖酸转化率与产量，同时提高了生物量，提升了经济效益，适合于工业化生产。
[0033]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】
与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。
此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除
热门咨询
tips