一种脱氮菌及其应用的制作方法

：
[0001]
本发明属微生物和环境工程技术领域，具体涉及一种脱氮菌及其应用。


背景技术：
：
[0002]
随着工农业的发展，氮素大量排入各种水体环境，如海洋、湖泊、地下河及城市河流中氮素含量日渐增加，这对生态环境和人类健康构成了严重的威胁。
[0003]
水体中含氮污染物的脱除主要有物理、化学和生物等三种方法，其中微生物脱氮技术克服了物理、化学脱氮工艺的一些缺陷，具有操作简单、适应范围广、处理效果好、基本上无二次污染等优点，成为了废水脱氮处理研究领域的热点。目前，环境工程中废水处理主要采用缺氧-好氧(anoxic-oxic,ao)脱氮、厌氧-缺氧-好氧(anaerobic-ano xic-oxic,aao)脱氮、间歇式(sequencing batch reactor,sbr)脱氮、曝气生物滤池(biological aeration filter,baf)脱氮等工艺。以上脱氮工艺不仅普遍将硝化过程和反硝化过程在不同的反应器中实现，而且50％的脱氮工艺会由于反硝化所用碳源不足，而无法满足脱氮需求。针对低碳氮比(c/n)污水脱氮效率不高的解决方法中，外加碳源简单有效但费用较高。因此，如何高效、经济地脱除水体中过量的无机氮素，具有重要的现实意义。
[0004]
近年来，随着对脱氮微生物的深入研究及认识的不断提高，研究人员发现某些菌株可以在好氧条件下进行反硝化作用，这类菌被称为好氧反硝化菌。大多数好氧反硝化菌会表现出异养硝化能力，这种同时兼具异养硝化和反硝化功能的菌被称为异养硝化-好氧反硝化菌(heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacteria，hn-ad)。hn-ad菌株一般在25-37℃，ph 7-8，溶氧3-5mg/l及c/n 5-10条件下，能够进行高效的脱氮。由此说明，该类菌株在实际废水中的脱氮处理上具有很好的应用价值。
[0005]
好氧反硝化菌在生理生化和系统进化上存在多样性，其在α，β和γ-变形菌门中均有存在。此类菌株主要分离源有活性污泥、废水处理系统、养殖废水、土壤及海洋和盐碱湖的沉积物等。好氧反硝化细菌主要分布于产碱杆菌属(alcaligenes)、假单胞菌属(p seudomonas)、副球菌属(paracoccus)、芽胞杆菌属(bacillus)、海杆菌属(marinoba cter)、动胶菌属(zoogloea)、不动杆菌(acinetobacter)、克雷伯氏菌属(klebsiella)和土壤杆菌属(agrobacterium)等，且相关国家发明专利也较多。


技术实现要素：
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[0006]
本发明的第一个目的是提供一种新型脱氮菌-假单胞菌(pseudomonas sp.)jm10a2a，其于2020年9月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为：gdmcc no.61214。
[0007]
本发明的第二个目的是提供假单胞菌jm10a2a在脱除水体中硝态氮和/或铵态氮中的应用。
[0008]
本发明的第三个目的是提供假单胞菌jm10a2a在脱除水体中亚硝态氮中的应用。
[0009]
优选，是在脱除低碳氮比水体中亚硝态氮中的应用。
[0010]
本发明的第四个目的是提供一种具有脱氮功能的活菌制剂，其含有假单胞菌jm10a2a作为活性成分。
[0011]
本发明从南美白对虾养殖池塘水中分离筛选得到一种新型脱氮菌及其应用。经16srrna序列比对结果显示，该菌株与pseudomonas stutzeriatcc 17588
t
具有最大相似度98.0％，经基因组比较分析结果显示，该菌株与p.stutzeriatcc 17588
t
的平均核苷酸相似度和dna-dna杂交值分别为82.9％和25.7％。由此说明，本发明的假单胞菌jm10a2a为pseudomonas属的一个新种，命名为假单胞菌(pseudomonas sp.)jm10a2a。假单胞菌jm10a2a的脱氮特性研究结果表明，该菌株为一株异养硝化-好氧反硝化菌株，能高效地脱除水体中的硝态氮和铵态氮，且在低c/n条件下仍能高效地进行亚硝态氮的脱除，由此说明，本发明假单胞菌jm10a2a在水体脱氮方面具有很大的应用潜力。
[0012]
pseudomonas sp.jm10a2a，其于2020年9月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为：gdmcc no.61214。
附图说明
[0013]
图1为假单胞菌(pseudomonas sp.)jm10a2a的菌落形态；
[0014]
图2为假单胞菌(pseudomonas sp.)jm10a2a的透射电镜下的细胞形态；
[0015]
图3为假单胞菌(pseudomonas sp.)jm10a2a在以硝态氮为唯一氮源条件下的脱氮特性；
[0016]
图4为假单胞菌(pseudomonas sp.)jm10a2a在以铵态氮为唯一氮源条件下的脱氮特性；
[0017]
图5为假单胞菌(pseudomonas sp.)jm10a2a在不同c/n条件下亚硝态氮脱除效果的定性检测，图上的数字代表碳氮比。
具体实施方式
[0018]
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0019]
实施例1：
[0020]
1.假单胞菌jm10a2a的分离纯化和保藏
[0021]
样品采集自广东省江门市台山市年丰公司广海镇养殖基地(n21
°
56
′
31
″
；e112
°
46
′
16
″
)的南美白对虾养殖池塘水。养殖水水样品1ml，梯度稀释10-1
，10-2
，10-3
和10-4
后，取200μl 10-2
、10-3
和10-4
的稀释液涂布于脱氮菌分离筛选所用的选择性培养基上，30℃培养箱中培养。肉眼观察菌落形态，挑取形态上有差异的单菌落，分别划线纯化，将已纯化的菌落至5ml的r2a液体培养集中，30℃，120rpm培养，进行后续甘油管保存，由此纯化得到菌株jm10a2a。
[0022]
选择性培养基配方如下：琥珀酸钠2.5g，二水合柠檬酸钠2.5g，nano
2
0.69g，kno
3
1.01g，(nh
4
)
2
so
4
0.66g，na
2
hpo
4
1.0g，kh
2
po
4
1.0g，mgso
4
·
7h
2
o 0.2g，1.5％琼脂，ph 7.4，定容至1000ml，121℃，15min，高温高压灭菌。制板时添加体积比1％的复合碳源和体积比0.2％的微量元素混合液。
[0023]
复合碳源：d-葡萄糖13.8g，d-果糖13.8g，d-乳糖13.8g，90％乳酸12.8ml，甘露醇
14.0g，无水乙醇14.0ml，甘油12.6ml，苯甲酸钠9.6g，水杨酸9.2g，无水乙酸钠19.0g，溶于1000ml水中，ph 7.4，0.22μm滤膜过滤除菌。
[0024]
微量元素混合液：edta-na 58.0g，znso
4
·
7h
2
o 3.9g，cacl
2
10.0g，mncl
2
·
4h
2
o1.0g，feso
4
·
7h
2
o 10.0g，(nh
4
)
6
mo
7
o
24
·
4h
2
o 1.1g，cuso
4
·
5h
2
o 1.6g，cocl
2
·
6h
2
o 1.6g，ph调至6.0，定容至1000ml，0.22μm滤膜过滤。
[0025]
2.形态特征
[0026]
如图1和图2所示，该菌株的菌落形态特征为：米黄色，边缘不规则，似毛毯状，表面有褶皱、不透明。细胞形态特征为：大小为(0.6
×
1.7)μm，杆状，有单根的极端生鞭毛。
[0027]
3.假单胞菌jm10a2a的16s rrna序列分析
[0028]
提取菌株jm10a2a的基因组dna，用细菌16s rrna基因扩增通用引物27f/1492r扩增得到pcr产物，并送至苏州金唯智生物科技有限公司进行序列测序，核苷酸序列如seq id no.1所示，测序结果与ezbiocloud网站数据库中的16s rrna序列进行同源性比对分析，结果分析表明其与菌株pseudomonas stutzeri atcc 17588
t
的16s rrna基因序列相似性最高，为98.0％。基于以上结果分析，初步鉴定本发明菌株为pseudomonas sp.。
[0029]
4.假单胞菌jm10a2a的基因组序列分析
[0030]
提取菌株jm10a2a的基因组dna，将其送至上海美吉生物医药科技有限公司进行基因组测序，测序结果依次采用spades v3.11.1和checkm 1.0.9进行基因组的组装和质量评估。采用ezbiocloud网站上的ani calculator计算jm10a2a和p.stutzeriatcc 17588
t
的平均核苷酸相似度(ani)；采用dsmz网站上的genome-to-genome distance calculator计算jm10a2a和p.stutzeriatcc 17588
t
的dna-dna杂交值(dddh)。结果显示，菌株jm10a2a与p.stutzeri atcc 17588
t
的ani和dddh分别为82.9％和25.7％，该值均小于细菌的种水平划分阈值(ani阈值为95％，dddh阈值为70％)。以上结果更进一步证实了菌株jm10a2a为pseudomonas属的一个新种。
[0031]
综上所述，本发明的菌株jm10a2a是pseudomonas属的一个新种，命名为假单胞菌(pseudomonas sp.)jm10a2a，其于2020年9月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为：gdmcc no.61214。
[0032]
5.假单胞菌jm10a2a的脱氮特性
[0033]
将假单胞菌jm10a2a分别接种至以硝态氮或铵态氮为唯一氮源的培养基中，30℃，120rpm摇床培养，分别在培养0、6、12、24、30、36、48h时取样，一部分用于测量菌液od600值，另一部分培养液离心(8000rpm，10min)取上清，用于后续测定培养液中无机氮浓度。硝态氮浓度测定采用紫外分光光度法，铵态氮浓度测定采用纳氏试剂分光光度法。
[0034]
以硝态氮为唯一氮源的培养基：琥珀酸钠6.08g，kno
3
1.01g，na
2
hpo
4
1.0g，kh
2
po
4
1.0g，mgso
4
·
7h
2
o 0.2g，添加体积比0.2％微量元素混合液，ph 7.4，定容至1000ml，115℃，20min，高温高压灭菌。
[0035]
以铵态氮为唯一氮源的培养基：琥珀酸钠6.08g，(nh
4
)
2
so
4
0.66g，na
2
hpo
4
1.0g，kh
2
po
4
1.0g，mgso
4
·
7h
2
o 0.2g，添加体积比0.2％微量元素混合液，ph 7.4，定容至1000ml，115℃，20min，高温高压灭菌。
[0036]
如附图3所示，假单胞菌jm10a2a对水体中no
3--
n有很好的脱除效果，即在培养18h
时，该菌od600为0.7，且其对no
3--
n的脱除效果已达100％。如附图4所示，假单胞菌jm10a2a对水体中nh
4+-n也具有较好的的脱除效果，即在培养24h时，该菌od600为1.1，且其对nh
4+-n的脱除效果达83.5％。此结果表明，假单胞菌jm10a2a为一株具有异养硝化-好氧反硝化作用的菌株，其在水体脱氮中具有很大的应用潜力。
[0037]
6.假单胞菌jm10a2a在不同c/n条件下的脱氮效果
[0038]
将假单胞菌jm10a2a接种至分别以亚硝态氮和琥珀酸钠为唯一氮源和碳源的培养基中，于30℃，96孔板中静置培养。在培养48h时，用格里斯试剂定性检测亚硝态氮，即若不显红色，则亚硝态氮已完全消失，红色越深，亚硝态氮浓度越高。
[0039]
培养基配方如下：nano
2
0.025g，na
2
hpo
4
1.0g，kh
2
po
4
1.0g，mgso
4
·
7h
2
o 0.2g，琥珀酸钠分别为0.072g，0.115g，0.144g，0.216g和0.432g，即将c/n调至5、8、10、15和30，ph 7.4，添加体积比0.2％微量元素混合液，定容至1000ml，115℃，20min，高温高压灭菌。
[0040]
如附图5所示，假单胞菌jm10a2a在c/n大于等于8时，格里斯试剂显无色，即该菌株已将5mg/l亚硝态氮完全脱除。此结果表明，假单胞菌10a2a在低c/n条件下仍能进行亚硝态氮的高效脱除，更进一步说明该菌株在实际废水脱氮中的应用潜力巨大。

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