含酶聚合物、包含该含酶聚合物的传感器、监测器和监测方法与流程

含酶聚合物、包含该含酶聚合物的传感器、监测器和监测方法
[0001]
相关申请的交叉引用
[0002]
本申请要求于2018年4月10日提交的新加坡申请号10201802969s的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
技术领域
[0003]
本公开总体上涉及一种含酶聚合物、一种用于合成所述含酶聚合物的方法、一种包含所述含酶聚合物的传感器、一种包含所述含酶聚合物的装置、一种监测器以及一种使用电化学代谢物检测器进行血管化移植的术后监测的方法，这些方法可以以自动连续的方式进行。


背景技术：

[0004]
在创伤事故或癌组织切除后，外科医生通常使用血管化皮肤和肌肉移植物(也称为皮瓣)对患者的身体进行重建。这些皮瓣通常通过一条或多条静脉和一条动脉从患者自身身体的一部分转移到先前切除的组织部位。然后在显微镜下重新连接血管。在头部和颈部区域，可使用诸如股前外侧皮瓣(alt)等皮瓣来进行咽部和食管缺损的重建。这些皮瓣通常被“埋藏”在腔内深处，并且临床上不易监测。
[0005]
外科医生主要关注的术后并发症之一是皮瓣坏死/衰竭，通常是血管血栓形成的结果。大部分皮瓣衰竭是由于静脉血栓形成所致，而动脉血栓形成所致则较少见。由于皮瓣的部分或全部丢失需要延长住院时间进行再次手术以更换衰竭的皮瓣，以及衰竭的皮瓣本身的并发症，外科医生认为皮瓣衰竭的后果是破坏性的。皮瓣手术通常与其他手术(例如癌组织切除)结合使用，是一个漫长的手术，通常需要8-12小时。另外，这种皮瓣手术很昂贵(通常在数万之间)，并且如果皮瓣衰竭，则这种费用可能翻倍。由于初次皮瓣手术的时间和成本的高投入以及与皮瓣衰竭相关的发病率，外科医生通常在游离皮瓣手术后将患者留在医院至少7天以便监测皮瓣。一旦怀疑血管受损，就立即进行再探查和救治。但是，检测皮瓣衰竭所需的时间越长，救治率越低。
[0006]
护士和医生承担每小时监测皮瓣最少24-48小时的劳动密集型任务。通过观察临床体征例如颜色、温度、肿胀、对针刺的出血反应和多普勒信号来人工监测皮瓣灌注。只能通过表面皮瓣观察临床体征，其中只有部分皮瓣可见。当皮瓣被埋藏并且没有一个可见时，问题加剧。头部和颈部的重建通常涉及埋藏的皮瓣，该皮瓣用于重建部分食管或咽部。目前尚没有一种被广泛接受的监测埋藏的皮瓣的方法。
[0007]
一项2007年研究表明，目前的监测方法有：皮瓣颜色变化(79.4％的外科医生使用)、多普勒信号(79.4％)、针刺和出血率(67.6％)、毛细血管再充盈(61.8％)、皮肤表面温度(11.8％)和植入式多普勒(8.8％)。然而，除了自身也存在挑战和问题的多普勒信号和植入式多普勒外，每种监测方法仍然具有严重的缺点，例如，它们的使用受到限制，从而阻止了其被广泛采用。
[0008]
在皮瓣手术后，当前的护理金标准涉及护理人员或初级临床医生人工监测皮瓣是
否出现皮瓣衰竭的临床体征，例如颜色、温度、肿胀、毛细血管再充盈和/或点刺试验的血流变化。在开始的48小时内(每小时或更频繁地)对皮瓣进行集中监测，然后每4小时监测一次，持续5-7天。这是因为大多数衰竭发生在手术后的最初2-3天。护理人员或临床医生可能必须例行前往查看患者的部位并评估皮瓣的状况。
[0009]
如果是动脉阻塞，则皮瓣呈苍白色，无毛细血管再充盈。皮瓣被刺破后，几乎没有血流出来。如果是静脉阻塞，则皮瓣会充血并看起来呈蓝色，观察到毛细血管再充盈过快。刺破皮瓣后，暗色血液迅速流出。
[0010]
临床观察非常耗时，通常依赖劳动力，并且有潜在的延迟对皮瓣衰竭的反应的风险。某些参数(例如颜色变化)易于解释，并且在肤色较深的人中可能被掩盖。血管血栓形成后，温度变化缓慢发生，并且即使当血管血栓形成时，皮瓣也可能被下面的组织欺骗性地保持温暖。依靠视觉评估的人工监测方法可能会导致“人为错误”和不一致的分析。这个过程是相当主观的。如果具有不同的感知能力水平以及劳损和疲劳水平的不同医护人员在很长的一段时间内通过视觉评估进行人工监控，则视觉评估不一致的问题可能会变得更加复杂。
[0011]
现有金标准人工监测方法的问题包括依赖于临床体征，该临床体征易于解释并且仅在血管血栓形成后数小时可观察到，使得难以在8小时窗口内挽救皮瓣，此时皮瓣仍可存活。另一个问题是，尽管患者护理负担已经很高并且在不断增加，但仍需要训练有素的临床人员每小时进行此类人工监测长达48小时，并且在术后每隔几个小时监测持续多达5天。人工监测的过程增加了“工作人员的工时”方面的医疗保健成本，既费力又依赖工作流程，并且通常对已经繁忙的医院系统造成压力。
[0012]
由于循环受损，5％-25％的皮瓣可能需要再探查，并且如果必要，通过手术接近怀疑受损的皮瓣，进行即时干预。尽管如此，皮瓣抢救成功率各不相同。在一项针对1310例皮瓣49例受损的研究中，抢救率为44.9％。另一项研究发现，抢救率为33％-57％。显然还有改进的空间。
[0013]
在美国，一项为期5年的研究指出，在所调查的95名外科医生中，除临床评估外，还有90％依赖辅助监测装置。两种最常见的监测方法分别是激光多普勒(28％)和常规多普勒(29％)。这些方法提供了可补充每小时人工观察的流量信息，但无法代替或消除目前的人工观察过程。
[0014]
一段时间以来，植入式多普勒探头一直是监测埋藏皮瓣的唯一可行方法。这些植入式探头在吻合部位缝合在血管周围，在吻合部位连接供应皮瓣的血管，并且随后通过强行拉出探头将其移除。然而，对20例埋藏皮瓣的研究发现，尽管灵敏度为100％，但植入式多普勒探头的假阳性率高达88％。另一项使用植入式多普勒探头和96个埋藏和未埋藏皮瓣的研究发现，假阳性率高达31％，从而导致不必要的再探查。不必要的再探查不仅给患者也给医生增加了负担。这种情况是不希望的，也是无效的。
[0015]
植入式多普勒探头发出的任何警报都会立即触发手术团队的响应，这将导致再次进行手术干预。较高的假阳性率意味着进行了大量不必要的手术再探查，从而导致患者不必要的额外费用、创伤和住院时间。由于与植入式多普勒相关的特异性差，外科医生对其可靠性表示怀疑。因此，植入式多普勒探头在临床实践中不是非常有用的工具。此外，在将探头放置在诸如血管连接处的吻合部位这样的敏感区域之后，需要将探头拔出，这存在着由
于去除力而可能损坏吻合或可能导致血管血栓形成的风险。这会加剧可能已经很复杂的临床情况。由于非常关注植入多普勒探头的安全性，外科医生非常不愿意使用它。
[0016]
外科医生指出，对于常规手持式多普勒探头，很难找到合适的目标血管进行监测。附近其他主要血管的存在可能导致错误阅读。在先前提到的研究中，尽管已经坏死，但是用手持多普勒探头监测的一个皮瓣具有多普勒信号。此类事件增加了在每次监测期间需要受过训练的人在床边操作多普勒探头的麻烦，从而降低了临床医生对多普勒探头的置信度，并且经常导致多普勒探头最多是人工监测表面皮瓣的辅助。因此，多普勒探头被视为在没有实际可用的有用替代方案时评估和监测埋藏皮瓣的不得已的方法。
[0017]
微血管皮瓣抢救的成功与皮瓣缺血开始和临床医生对其识别之间的时间成反比。也有一个有限的时间窗口，在该时间窗口内可以在血管阻塞之后抢救皮瓣。对于更容易发生局部缺血的空肠皮瓣，在静脉血栓形成或损害的6小时内发生全层坏死。对于其他情况，由于缺乏灌注，在首次发生血管阻塞后8-12小时，皮瓣的存活几乎变得不可能。在这段时间之后，血流的重建不再导致灌注；这种现象被称为“无复流(no-reflow)”现象。因此，监测皮瓣对早期干预至关重要。不幸的是，皮瓣衰竭的临床体征通常在血管血栓形成几小时后就变得清晰可见。
[0018]
因此，迫切需要一种准确、安全和省力的方法来监测埋藏的和表面的皮瓣。与皮瓣损失相关的高发病率和高死亡率以及医务人员进行人工皮瓣监测的有限能力导致对这种装置的迫切的临床需要。
[0019]
监测葡萄糖水平是最廉价的方法之一，其将在血管血栓形成的数分钟内显著改变。已经表明，在动物试验中可以获得关于皮瓣监测的高灵敏度和特异性，由此该过程可以自动化。实际上，在一项对完全动脉和静脉闭塞的成年大鼠的研究中，间质葡萄糖显著下降，并且通过葡萄糖测试检测的皮瓣衰竭的灵敏度和特异性分别为100％和95％。此外，为了适应不同组成的皮瓣，研究表明仅对葡萄糖进行测量是不够的(与主要由脂肪和皮肤组成的皮瓣相比，主要由肌肉组织组成的皮瓣在缺血期间显示出更显著的葡萄糖水平下降。)这就是为什么提出了将乳酸作为用于准确的皮瓣监测的附加工具进行研究的原因。
[0020]
选择电化学传感器进行葡萄糖感测是因为其固有的优势，例如高灵敏度、快速响应、易于操作和良好的便携性。第一代葡萄糖生物传感器基于依赖葡萄糖氧化酶(gox)的电化学反应。gox通过分子氧催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸内酯，同时产生过氧化氢(h2o2)和水作为副产物。葡糖酸内酯进一步与水反应生成羧酸产物葡萄糖酸。为了进行氧化反应，gox需要氧化还原辅助因子-黄素腺嘌呤二核苷酸(fad
+
)。fad
+
作为初始电子受体，其在氧化还原反应过程中被还原为fadh2。fad
+
辅因子通过随后与氧气反应生成h2o2进行再生。该反应发生在阳极，在阳极可以很容易地识别出转移的电子数量，并且该电子流与生成的h2o2量相关，因此与葡萄糖浓度相关。gox是葡萄糖生物传感器的标准酶，其价格实惠并且对葡萄糖具有高选择性。其他可用于葡萄糖感测的酶，包括己糖激酶和葡萄糖-1-脱氢酶(gdh)。
[0021]
乳酸感测的概念与葡萄糖感测相同，由于相对简单的酶促反应和简单的传感器设计，乳酸传感器中最常用的酶是l-乳酸脱氢酶(ldh)和l-乳酸氧化酶(lox)。lox可以在溶解氧的存在下催化l-乳酸氧化为丙酮酸，并形成过氧化氢(h2o2)。
[0022]
但是，第一代葡萄糖/乳酸生物传感器存在一些缺点：1)过氧化氢的安培测量法要求高操作电位以实现高选择性；以及2)氧气在生物液体中的溶解度受到限制。可以通过用
能够将电子从酶携带到工作电极表面的氧化还原介体代替氧气来实现改进。同时，酶的活性中心被厚厚的蛋白质层包围，并深深地位于分子的疏水腔中，在此处酶的直接电化学非常困难。因此，使用电连接器可以增强电子的传输。氧化还原介体是在电子转移过程中用作电子受体和电子供体的天然或人工化合物。氧化还原介体的若干实例如二茂铁衍生物、铁氰化物、奎宁、锇络合物、钌络合物等。对于植入式的葡萄糖/乳酸盐感测应用，最常用的聚合物是含有氧化还原介体的生物相容性聚合物。
[0023]
在这方面，还需要提供一种具有成功的电子氧化还原性质或氧化还原活性介体的传感器，其克服或至少改善上述一个或多个缺点。


技术实现要素：

[0024]
根据一个方面，提供了一种含酶聚合物，其包括：
[0025]
式ia的第一重复单元：
[0026][0027]
式ib的第二重复单元：
[0028][0029]
式ic的第三重复单元：
[0030][0031]
或其共轭盐，其中：
[0032]
a、b和d各自独立地为2-氨基单糖；
[0033]
e为包含n-末端胺和任选的一个或多个赖氨酸残基的酶，其中r2共价键合到所述n-末端胺或所述一个或多个赖氨酸残基的胺侧链上；
[0034]
金属为在生理条件下具有低于过氧化氢的氧化还原电位的金属络合物；
[0035]
r1为-n*(r)(c＝o)-、-n*(r)(c＝o)n(r)-、-n*(r)(cr2)
n-、-n*(r)(cr2)
n
(c＝o)-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)-、-n*(r)(cr2)
n
o(cr2)
m-、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m-、-n*(r)(cr2)
n
o-、-n*(r)(cr2)
n
(c＝o)o-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
o-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)o-、-n*(r)(cr2)
n
o(cr2)
m
o-、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m
o-、-n*＝ch(cr2)
n-、-n*＝ch(cr2)
n
(c＝o)-、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m-、-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m-、-n*＝ch(cr2)
n
o-、-n*＝ch
(cr2)
n
(c＝o)o-、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m
o-或-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m
o-，其中n*代表2-氨基单糖2位上的氮。
[0036]
r2为-n*(r)(cr2)
n
n**(r)-、-n*(r)(cr2)
n
(c＝o)n**(r)-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)n**(r)-、-n*(r)(cr2)
n
o(cr2)
m
n**(r)-、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m
n**(r)-、-n*＝ch(cr2)
n
n**(h)-、-n*＝ch(cr2)
n
(c＝o)n**(r)-、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m
n**(r)-、-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m
n**(r)-、
–
n*(r)(cr2)
n
ch＝n**-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
ch＝n**-、-n*(r)(cr2)
n
o(cr2)
m
ch＝n**-、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m
ch＝n**-、-n*＝ch(cr2)
n
ch＝n**-、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m
ch＝n**-或-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m
ch＝n**-，其中n*代表2-氨基单糖2位上的氮，且n**代表所述酶的所述n-末端胺或所述一个或多个赖氨酸残基的所述胺侧链的氮；或者r2由以下部分表示：
[0037]
r3为-n*(r)(cr2)
n
y、-n*(r)(cr2)
n
(c＝o)y、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
y、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)y、-n*(r)(cr2)
n
o(ch2)
m
y、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m
y、-n*＝ch(cr2)
n
y、-n*＝ch(cr2)
n
(c＝o)y、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m
y、-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m
y、-n*(r)(cr2)
n
ch＝y、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
ch＝y、-n*(r)(cr2)
n
o(ch2)
m
ch＝y、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m
ch＝y、-n*＝ch(cr2)
n
ch＝y、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m
ch＝y或-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m
ch＝y，其中n*代表2-氨基单糖2位上的氮；或者r3由以下部分表示：
[0038]
r在每次出现时独立地为氢、低级烷基或羟基；
[0039]
m在每次出现时独立地为选自1-20的整数；
[0040]
n在每次出现时独立地为选自1-20的整数；
[0041]
w在每次出现时独立地为选自1-20的整数；
[0042]
y为包含至少一种金属络合物的聚烷基胺，其中聚烷基胺任选地交联上述第三重复单元中的至少两个。
[0043]
根据另一方面，提供了一种氧化还原聚合物，其包括式iia的第一重复单元的：
[0044][0045]
和式iib的第二重复单元：
[0046][0047]
或其共轭盐，其中：
[0048]
a和b各自独立地为2-氨基单糖。
[0049]
金属为在生理条件下具有低于过氧化氢的氧化还原电位的金属络合物；
[0050]
r1为-n*(r)(c＝o)-、-n*(r)(c＝o)n(r)-、-n*(r)(cr2)
n-、-n*(r)(cr2)
n
(c＝o)-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)-、-n*(r)(cr2)
n
o(cr2)
m-、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m-、-n*(r)(cr2)
n
o-、-n*(r)(cr2)
n
(c＝o)o-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
o-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)o-、-n*(r)(cr2)
n
o(cr2)
m
o-、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m
o-、-n*＝ch(cr2)
n-、-n*＝ch(cr2)
n
(c＝o)-、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m-、-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m-、-n*＝ch(cr2)
n
o-、-n*＝ch(cr2)
n
(c＝o)o-、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m
o-或-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m
o-，其中n*代表2-氨基单糖2位上的氮。
[0051]
r在每次出现时独立地为氢或低级烷基；
[0052]
m在每次出现时独立地为选自1-20的整数；以及
[0053]
n在每次出现时独立地为选自1-20的整数。
[0054]
有利地，通过化学或非化学方法将酶固定在工作电极表面上的具有氧化还原特性的(含酶聚合物的)聚合物薄膜中。
[0055]
根据另一方面，提供了一种传感器，其包括：衬底；所述衬底上的第一传感器电极；所述第一传感器电极上的第一感测层，所述第一感测层包括第一含酶聚合物，所述含酶聚合物为如本文所定义的含酶聚合物；以及所述衬底上的参比电极。
[0056]
根据另一方面，提供了一种监测器，其包括：接收器模块，其被配置为接收如本文所定义的传感器的输出；处理器模块，其被配置为接收来自接收器模块的第一代谢物浓度值和第一对照值，其中处理器模块被配置为：将第一代谢物浓度值与第一对照值进行比较；并基于该比较产生第一信号。
[0057]
根据另一方面，提供了一种监测系统，其包括：如本文所定义的传感器；以及如本文所定义的监测器，其中该监测器的接收器被安排成用于接收该传感器的输出。
[0058]
根据另一方面，提供了一种制造传感器的方法，其包括：提供衬底；形成衬底上的第一传感器电极；形成位于第一传感器电极上的第一感测层，第一感测层包括第一含酶聚合物，所述含酶聚合物为如本文中所定义的含酶聚合物；以及形成位于衬底上的参比电极。
[0059]
根据另一方面，提供了一种用于监测患者组织衰竭的方法，该方法可包括以下步骤：
[0060]
(i)在所述组织上或组织内提供如本文中所定义的第一传感器，所述第一传感器能够检测和测量第一代谢物的量；
[0061]
(ii)在所述患者的对照区域上提供如本文所定义的第二传感器，所述对照区域与所述组织分离，并且其中所述第二传感器能够检测和测量所述第一代谢物的量；
[0062]
(iii)在所述组织上或组织内提供如本文所定义的第三传感器，所述第三传感器能够检测和测量第二代谢物的量，并且其中所述第三传感器与第一传感器相同或不同；
[0063]
(iv)在所述患者的所述对照区域上提供如本文所定义的第四传感器，所述第四传感器能够检测和测量所述第二代谢物的量，并且其中所述第四传感器与第二传感器相同或不同；
[0064]
(v)监测在一段时间内由所述第一传感器和第二传感器测量的所述第一代谢物的量；
[0065]
(vi)监测在一段时间内由所述第三传感器和第四传感器测量的所述第二代谢物
的量；
[0066]
其中与由所述第二传感器测量的所述第一代谢物的量相比，由所述第一传感器测量的所述第一代谢物的量降低了至少10％；以及与由所述第四传感器测量的所述第二代谢物的量相比，由所述第三传感器测量的所述第二代谢物的量增加了至少10％，指示所述组织易于衰竭。
[0067]
根据另一方面，提供了一种监测器，其包括：接收器模块，其被配置为接收传感器的传感器输出和另一传感器的对照输出；处理器模块，其被配置为接收来自接收器模块的对应于传感器输出的第一代谢物浓度值和对应于对照输出的第一对照值，其中，处理器模块被配置为：将第一代谢物浓度值与第一对照值进行比较；以及在第一代谢物浓度值与第一对照值的差值大于第一预定值的条件下，产生第一报警信号。
[0068]
根据另一方面，提供了一种用于监测患者组织衰竭的方法，该方法可包括以下步骤：
[0069]
(i)在所述组织上或组织内提供第一传感器，所述第一传感器能够检测和测量第一代谢物的量；
[0070]
(ii)在所述患者的对照区域上提供第二传感器，所述对照区域与所述组织分离，并且其中所述第二传感器能够检测和测量所述第一代谢物的量；
[0071]
(iii)在所述组织上或组织内提供第三传感器，所述第三传感器能够检测和测量第二代谢物的量，并且其中所述第三传感器与第一传感器相同或不同；
[0072]
(iv)在所述患者的所述对照区域上提供第四传感器，所述第四传感器能够检测和测量所述第二代谢物的量，并且其中所述第四传感器与第二传感器相同或不同；
[0073]
(v)监测在一段时间内由所述第一传感器和第二传感器测量的所述第一代谢物的量；
[0074]
(vi)监测在一段时间内由所述第三传感器和第四传感器测量的所述第二代谢物的量；
[0075]
其中与由所述第二传感器测量的所述第一代谢物的量相比，由所述第一传感器测量的所述第一代谢物的量降低了至少10％；以及与由所述第四传感器测量的所述第二代谢物的量相比，由所述第三传感器测量的所述第二代谢物的量增加了至少10％，指示所述组织易于衰竭。
[0076]
根据另一方面，提供了一种用于监测患者组织衰竭的方法，该方法包括以下步骤：
[0077]
(i)在所述组织上或组织内提供第一传感器，所述第一传感器能够检测和测量第一代谢物的量；
[0078]
(ii)在所述患者的对照区域上提供第二传感器，所述对照区域与所述组织分离，并且其中所述第二传感器能够检测和测量所述第一代谢物的量；
[0079]
(iii)在所述组织上或组织内提供第三传感器，所述第三传感器能够检测和测量第二代谢物的量，并且其中所述第三传感器与第一传感器相同或不同；
[0080]
(iv)在所述患者的所述对照区域上提供第四传感器，所述第四传感器能够检测和测量所述第二代谢物的量，并且其中所述第四传感器与第二传感器相同或不同；
[0081]
(v)监测在一段时间内由所述第一传感器和第二传感器测量的所述第一代谢物的量；
[0082]
(vi)监测在一段时间内由所述第三传感器和第四传感器测量的所述第二代谢物的量；
[0083]
其中由所述第一传感器测量的所述第一代谢物的量与由所述第二传感器测量的所述第一代谢物的量基本相同；以及与由所述第四传感器测量的所述第二代谢物的量相比，由所述第三传感器测量的所述第二代谢物的量增加了至少10％，指示所述组织易于衰竭。
[0084]
根据另一方面，提供了一种用于监测患者组织衰竭的方法，该方法包括以下步骤：
[0085]
(i)在所述组织上或组织内提供第一传感器，所述第一传感器能够检测和测量第一代谢物的量；
[0086]
(ii)在所述患者的对照区域上提供第二传感器，所述对照区域与所述组织分离，并且其中所述第二传感器能够检测和测量所述第一代谢物的量；
[0087]
(iii)在所述组织上或组织内提供第三传感器，所述第三传感器能够检测和测量第二代谢物的量，并且其中所述第三传感器与第一传感器相同或不同；
[0088]
(iv)在所述患者的所述对照区域上提供第四传感器，所述第四传感器能够检测和测量所述第二代谢物的量，并且其中所述第四传感器与第二传感器相同或不同；
[0089]
(v)监测在一段时间内由所述第一传感器和第二传感器测量的所述第一代谢物的量；
[0090]
(vi)监测在一段时间内由所述第三传感器和第四传感器测量的所述第二代谢物的量；
[0091]
其中与由所述第二传感器测量的所述第一代谢物的量相比，由所述第一传感器测量的所述第一代谢物的量降低了至少10％；以及由所述第三传感器测量的所述第二代谢物的量与由所述第四传感器测量的所述第二代谢物的量基本相同，指示所述组织易于衰竭。
[0092]
根据另一方面，提供了一种用于监测患者组织衰竭的方法，该方法包括以下步骤：
[0093]
(i)在所述组织上或组织内提供第一传感器，所述第一传感器能够检测和测量第一代谢物的量；
[0094]
(ii)在所述患者的对照区域上提供第二传感器，所述对照区域与所述组织分离，并且其中所述第二传感器能够检测和测量所述第一代谢物的量；
[0095]
(iii)在所述组织上或组织内提供第三传感器，所述第三传感器能够检测和测量第二代谢物的量，并且其中所述第三传感器与第一传感器相同或不同；
[0096]
(iv)在所述患者的所述对照区域上提供第四传感器，所述第四传感器能够检测和测量所述第二代谢物的量，并且其中所述第四传感器与第二传感器相同或不同；
[0097]
(v)监测在一段时间内由所述第一传感器和第二传感器测量的所述第一代谢物的量；
[0098]
(vi)监测在一段时间内由所述第三传感器和第四传感器测量的所述第二代谢物的量；
[0099]
其中与由所述第二传感器测量的所述第一代谢物的量相比，由所述第一传感器测量的所述第一代谢物的量降低了至少10％；以及与由所述第四传感器测量的所述第二代谢物的量相比，由所述第三传感器测量的所述第二代谢物的量降低了至少10％，指示所述组织易于衰竭。
[0100]
根据另一方面，提供了一种用于监测患者组织衰竭的方法，该方法包括以下步骤：
[0101]
(i)在所述组织上或组织内提供第一传感器，所述第一传感器能够检测和测量第一代谢物的量；
[0102]
(ii)在所述患者的对照区域上提供第二传感器，所述对照区域与所述组织分离，并且其中所述第二传感器能够检测和测量所述第一代谢物的量；
[0103]
(iii)在所述组织上或组织内提供第三传感器，所述第三传感器能够检测和测量第二代谢物的量，并且其中所述第三传感器与第一传感器相同或不同；
[0104]
(iv)在所述患者的所述对照区域上提供第四传感器，所述第四传感器能够检测和测量所述第二代谢物的量，并且其中所述第四传感器与第二传感器相同或不同；
[0105]
(v)监测在一段时间内由所述第一传感器和第二传感器测量的所述第一代谢物的量；
[0106]
(vi)监测在一段时间内由所述第三传感器和第四传感器测量的所述第二代谢物的量；
[0107]
其中与由所述第二传感器测量的所述第一代谢物的量相比，由所述第一传感器测量的所述第一代谢物的量增加了至少10％；以及与由所述第四传感器测量的所述第二代谢物的量相比，由所述第三传感器测量的所述第二代谢物的量增加了至少10％，指示所述组织易于衰竭。
[0108]
有利地，包括传感器的监测器可以是高度精确且高精度的。进一步有利地，包括传感器的监测器可以防止引起错误警报。
[0109]
定义
[0110]
在本说明书中，使用了本领域技术人员众所周知的许多术语。然而，为了清楚起见，将定义许多术语。本文所用的以下词语和术语应具有所指示的含义：
[0111]
术语“氧化还原聚合物(redox polymer)”与术语“电化学活化剂(electrochemical activator)”可互换使用，当在本文中使用时，其是指能够活化在酶(葡萄糖氧化酶/乳酸氧化酶)和传感器的工作(检测)电极之间传递电子的酶的任何化合物。这也可以称为电子转移剂。葡萄糖氧化酶可以缩写为gox。乳酸氧化酶可以缩写为lox。
[0112]
术语“二茂铁基衍生物(ferrocenyl derivative)”与术语“二茂铁衍生物(ferrocene derivative)”可互换使用，并且是指含有任选取代的二茂铁或二茂铁基的衍生物。
[0113]
术语“酶(enzyme)”与术语“氧化还原酶(oxidoreductase)”可互换使用，其是指通过移除或添加电子来催化底物或分析物氧化或还原的能力。术语“氧化还原酶(oxidoreductase enzyme)”也可以互换使用。
[0114]
当在本文中使用时，术语“顺序(order)”是指化合物单体根据特定顺序、模式或方法相对于彼此的排列或布置。
[0115]
当在本文中使用时，术语“无序(non-order)”是指与上述定义相反，其中化合物单体的排列或布置没有特定的顺序、模式或方法或以随机方式。
[0116]
当在本文中使用时，术语“随机(random)”是指在排列或无规则性时不可预测的或缺乏均匀性的某物。
[0117]
当在本文中使用时，术语“组织(tissue)”可被广义地定义为指皮瓣、膜、皮肤、脑
膜、结缔组织或器官如肝、胃、胰腺、肠、肾、胸腺、子宫、睾丸、膀胱、肺、心脏。术语“组织(tissue)”还可以包括游离组织(例如从动物或人类受试者分离的组织)。
[0118]
当在本文中使用时，术语“衰竭(failure)”是指血液供应受损的组织。
[0119]
在以下多个取代基的定义中，表述“该基团可以为端基或桥连基”。这意在表示该术语的使用意在涵盖该基团是分子的两个其他部分之间的连接基团以及其是末端部分的情况。使用术语烷基作为实例，一些出版物将使用术语“烯烃基(alkylene)”作为桥连基，因此在这些其他出版物中，术语“烷基(alkyl)”(端基)和“烯烃基”(桥连基)之间存在区别。在本申请中，没有进行这种区分，并且大多数基团可以为桥连基或端基。
[0120]“酰基(acyl)”是指r-c(＝o)-基团，其中r基团可以为如本文所定义的任选取代的烷基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。酰基的实例包括乙酰基。所述基团可以为端基或桥连基。如果该基团为端基，则其通过羰基碳键合到分子的其余部分。
[0121]“酰氧基”是指r-c(＝o)-o-，其中r基团可以为如本文定义的烷基、环烷基、杂环烷基；芳基或杂芳基基团。所述基团可以为端基或桥连基。如果该基团为端基，则其通过氧原子键合到分子的其余部分。
[0122]“烷酰基(alkanoyl)”是指烷基-c＝o基团，其中烷基如本文所定义。优选的烷酰基基团为c
1-c6烷酰基基团。该基团可以为端基或桥连基。如果该基团为端基，则其通过羰基的碳原子键合到分子的其余部分。
[0123]
除非另有说明，“烷基(alkyl)”作为基团或基团的一部分是指直链或支链脂肪族烃基，优选c
1-c
12
烷基、更优选c
1-c
10
烷基、最优选c
1-c6烷基。合适的直链和支链c
1-c6烷基取代基的实例包括甲基、乙基、正丙基、2-丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、己基等。该基团可以为端基或桥连基。
[0124]
除非另有说明，“烷基氨基(alkylamino)”包括单烷基氨基和二烷基氨基。“单烷基氨基(mono-alkylamino)”是指烷基-nh-基团，其中烷基如本文所定义。“二烷基氨基(dialkylamino)”是指(烷基)2n-基团，其中每个烷基可以相同或不同，并且各自如本文对烷基所定义。烷基基团优选为c
1-c6烷基基团。该基团可以为端基或桥连基。如果该基团为端基，则其通过氮原子键合至分子的其余部分。
[0125]“烷基氨基烷基(alkylaminoalkyl)”是指烷基-n-烷基基团，其中每个烷基可以相同或不同，并且各自如本文对烷基所定义。烷基基团优选为c
1-c6烷基基团。该基团可以为端基或桥连基。如果该基团为端基，则其通过氮原子键合至分子的其余部分。
[0126]“烷氧基(alkyloxy)”是指烷基-o-基团，其中烷基如本文所定义。优选地，烷氧基为c
1-c6烷氧基。实例包括但不限于甲氧基和乙氧基。该基团可以为端基或桥连基。术语烷氧基(alkyloxy)可与术语“烷氧基(alkoxy)”互换使用。
[0127]“烷氧基烷基(alkyloxyalkyl)”是指烷氧基-烷基-基团，其中烷氧基和烷基部分如本文所定义。该基团可以为端基或桥连基。如果该基团为端基，则其通过烷基基团键合至分子的其余部分。
[0128]“烷硫基(alkylthio)”是指烷基-s-基团，其中烷基如本文所定义。优选地，烷硫基为c
1-c6烷硫基。实例包括但不限于二甲基硫醚((ch3)2s)和二乙基硫醚。该基团可以为端基或桥连基。
[0129]“烷基硫代烷基(alkylthioalkyl)”是指烷硫基-烷基-基团，其中烷硫基和烷基部分如本文所定义。术语“烷基硫代烷基(alkylthioalkyl)”也可以指其中术语为-c-s-c-并且可以互换使用的硫醚。该基团可以为端基或桥连基。如果该基团为端基，则其通过烷基基团键合至分子的其余部分。
[0130]“氨基(amino)”是指
–
nr
a
r
b
形式的基团，其中r
a
和r
b
独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基和任选取代的芳基，但不限于此。
[0131]“氨基烷基(aminoalkyl)”是指nh
2-烷基-，其中烷基如本文所定义。该基团可以为端基或桥连基。如果该基团为端基，则其通过烷基基团键合至分子的其余部分。“烷基胺(alkylamine)”可以互换使用。
[0132]“羟烷基(hydroxyalkyl)”是指其中一个或多个氢原子已被oh基团取代的本文所定义的烷基。羟烷基基团通常具有式c
n
h
(2n+1-x)
(oh)
x
。在这种类型的基团中，n通常为1-10、更优选1-6、最优选1-3。x通常为1-6、更优选1-4。
[0133]
应当理解，包括在式(i)化合物家族中的化合物可以具有异构体形式，包括“e”或“z”构型异构体中的非对映异构体、对映异构体、互变异构体以及几何异构体或e和z异构体的混合物。还应当理解，一些异构体形式包括“r”或“s”构型的平面手性化合物。还应当理解，一些异构体形式如非对映异构体、对映异构体和几何异构体可以由本领域技术人员通过物理和/或化学方法分离。
[0134]
所公开的实施方案中的一些化合物可以作为单一立体异构体、外消旋体和/或对映异构体和/或非对映异构体的混合物存在。所有这样的单一立体异构体、外消旋体及其混合物都在所描述和要求保护的主题范围内。
[0135]
此外，本发明的化合物可能含有一个以上的不对称碳原子。在那些化合物中，使用实线描绘与不对称碳原子的键意在表明所有可能的立体异构体均应包括在内。使用实线描绘与本发明化合物中一个或多个不对称碳原子的键，以及使用实心或虚线楔形描绘与相同化合物中其他不对称碳原子的键，意在表明存在非对映异构体混合物。
[0136]
本文所用的术语“任选取代的(optionally substituted)”意味着该术语所指的基团可以是未取代的，或可以被独立地选自下述基团中的一个或多个基团取代：烷基、烯基、炔基、硫代烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、环烷基烯基、杂环烷基、环烷基杂烷基、环烷基氧基、环烯基氧基、环氨基、卤基(halo)、羧基、卤代烷基、卤代炔基、炔氧基、杂烷基、杂烷氧基、羟基、羟烷基、烷氧基、硫代烷氧基、烯氧基(alkenyloxy)、卤代烷氧基、卤代烯基、卤代炔基、卤代烯氧基、硝基、氨基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基杂环基、烷基氨基、二烷基氨基、烯基胺、氨基烷基、炔基氨基、酰基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基芳基、烷氧基羰基、烷氧基环烷基、烷氧基杂芳基、烷氧基杂环烷基、烯酰基(alkenoyl)、炔酰基(alkynoyl)、酰氨基、二酰基氨基、酰氧基、烷基磺酰氧基、杂环基、杂环烯基、杂环烷基、杂环烷基烷基、杂环烷基烯基、杂环烷基杂烷基、杂环烷氧基、杂环烯氧基(heterocycloalkenyloxy)、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环烷基、烷基亚磺酰基(alkylsulfinyl)、烷基磺酰基(alkylsulfonyl)、烷基亚氧硫基(alkylsulfenyl)、烷基羰氧基、烷硫基、酰硫基、氨基磺酰基、含磷基团如膦酰基(phosphono)和氧膦基(phosphinyl)、亚磺酰基、亚磺酰基氨基、磺酰基、磺酰基氨基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基杂烷基、杂芳基氨基、杂芳基氧基、芳基烯基、芳基烷基、烷基芳基、烷基
杂芳基、芳氧基、芳基磺酰基、氰基、氰酸酯、异氰酸酯、-c(o)nh(烷基)和-c(o)n(烷基)2。
[0137]
优选地，烷基为任选取代的c
1-c6烷基，烷基氨基为具有c
1-c6烷基基团的任选取代的烷基-nh-基团，二烷基氨基为具有c
1-c6烷基基团的任选取代的(alkyl)2n-基团，烷基氨基烷基为具有c
1-c6烷基基团的任选取代的烷基-nh-烷基，烷氧基羰基为具有羰基基团的任选取代的c
1-c
16
烷氧基，烷酰基为具有羰基基团的任选取代的c
1-c6烷基。
[0138]
本文所用的术语“低级烷基(lower alkyl)”，无论是用作独立取代基还是用作另一取代基的一部分，都包括具有至多并包括7个碳原子的直链或支链脂族烃基。低级烷基的实例包括但不限于碳原子数为1-3的烷基基团，例如甲基、乙基、丙基和异丙基，以及碳原子数为4-7的烷基，例如丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基等。
[0139]
词语“基本上(substantially)”不排除“完全(completely)”，例如“基本上不含(substantially free)”y的组合物可以完全不含y。必要时，词语“基本上”可以从本发明的定义中省略。
[0140]
除非另外指明，否则术语“包括(comprising、comprise)”及其语法变体旨在表示“开放式”或“包括性”语言，使得它们包括所列举的要素，但也允许包括另外的未列举的要素。
[0141]
如本文所用，在制剂的成分的浓度的情况下，术语“约(about)”通常是指所述值的
±
10％、更通常是指所述值的
±
7.5％、更通常是指所述值的
±
5％、更通常是指所述值的
±
4％、更通常是指所述值的
±
3％、更通常是指所述值的
±
2％、甚至更通常是指所述值的
±
1％、甚至更通常是指所述值的
±
0.5％。
[0142]
在本公开中，某些实施方案可以范围格式公开。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对所公开范围的范畴的非灵活限制。因此，应当认为范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1-6的范围的描述应当被认为已经具体公开了诸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等的子范围，以及在该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5、6。无论范围的宽度如何，这都适用。
[0143]
某些实施方案也可以在本文中广泛地和一般性地描述。落入一般公开内容内的每个较窄种类和亚类分组也形成本公开内容的一部分。这包括实施方案的一般性描述，其附带条件或否定限制从该类属中除去任何主题，而不管所删除的材料是否在本文中具体叙述。
具体实施方式
[0144]
本文提供了在各种条件下(包括在生理条件下)用于高选择性实时检测分析物的含酶聚合物。有利地，本文所述的含酶聚合物可以在高达5天或更长时间的连续使用下保持稳定，并且在推荐的储存条件下，该含酶聚合物的保质期可以高达6个月或更长。此外，本文所述的含酶聚合物产生足够强的信号以用于倾向于减弱最终电子信号的保护层。现在将公开含酶聚合物的示例性非限制性实施方案。
[0145]
在某些实施方案中，含酶聚合物包括：
[0146]
式ia的第一重复：
[0147][0148]
式ib的第二重复单元：
[0149][0150]
式ic的第三重复单元：
[0151][0152]
或其共轭盐，其中：
[0153]
a、b和d各自独立地为2-氨基单糖。
[0154]
e为包含n-末端胺和任选的一个或多个赖氨酸残基的酶，其中r2共价键合到所述n-末端胺或所述一个或多个赖氨酸残基的胺侧链上；
[0155]
金属为金属络合物；
[0156]
r1为-n*(r)(c＝o)-、-n*(r)(c＝o)n(r)-、-n*(r)(cr2)
n-、-n*(r)(cr2)
n
(c＝o)-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)-、-n*(r)(cr2)
n
o(cr2)
m-、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m-、-n*(r)(cr2)
n
o-、-n*(r)(cr2)
n
(c＝o)o-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
o-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)o-、-n*(r)(cr2)
n
o(cr2)
m
o-、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m
o-、-n*＝ch(cr2)
n-、-n*＝ch(cr2)
n
(c＝o)-、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m-、-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m-、-n*＝ch(cr2)
n
o-、-n*＝ch(cr2)
n
(c＝o)o-、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m
o-或-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m
o-，其中n*代表2-氨基单糖2位上的氮。
[0157]
r2为-n*(r)(cr2)
n
n**(r)-、-n*(r)(cr2)
n
(c＝o)n**(r)-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)n**(r)-、-n*(r)(cr2)
n
o(cr2)
m
n**(r)-、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m
n**(r)-、-n*＝ch(cr2)
n
n**(r)-、-n*＝ch(cr2)
n
(c＝o)n**(r)-、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m
n**(r)-、-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m
n**(r)-、
–
n*(r)(cr2)
n
ch＝n**-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
ch＝n**-、-n*(r)(cr2)
n
o(cr2)
m
ch＝n**-、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m
ch＝n**-、-n*＝ch(cr2)
n
ch＝n**-、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m
ch＝n**-或-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m
ch＝n**-，其中n*代表2-氨基单糖2位上的氮，且n**代表酶的n-末端胺或一个或多个赖氨酸残基的胺侧链的氮；或者r2由以下部分表示：
[0158]
r3为-n*(r)(cr2)
n
y、-n*(r)(cr2)
n
(c＝o)y、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
y、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)y、-n*(r)(cr2)
n
o(cr2)
m
y、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m
y、-n*＝ch(cr2)
n
y、-n*＝ch(cr2)
n
(c＝o)y、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m
y、-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m
y、-n*(r)(cr2)
n
ch＝y、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
ch＝y、-n*(r)(cr2)
n
o(ch2)
m
ch＝y、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m
ch＝y、-n*＝ch(cr2)
n
ch＝y、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m
ch＝y或-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m
ch＝y，其中n*代表2-氨基单糖2位上的氮；或者r3由以下部分表示：
[0159]
r在每次出现时独立地为氢、低级烷基或羟基；
[0160]
m在每次出现时独立地为选自1-20的整数；
[0161]
n在每次出现时独立地为选自1-20的整数；
[0162]
w在每次出现时独立地为选自1-20的整数；
[0163]
y为包含至少一种金属络合物的聚烷基胺，其中该聚烷基胺任选地交联上述第三重复单元中的至少两个。金属络合物可以为本领域已知的任何基本上无毒的金属络合物。金属络合物的选择在本领域普通技术人员的能力范围内。在某些实施方案中，金属络合物在生理条件下的氧化还原电势低于过氧化氢。示例性金属络合物包括但不限于铁或二茂铁基络合物、铜络合物、二茂钴络合物、钌络合物、锇络合物、锌络合物或其组合。在某些实施方案中，金属络合物是任选取代的二茂铁基。
[0164]
在含酶聚合物中，金属可以为任选取代的二茂铁基衍生物。二茂铁基衍生物可以被认为是包含二茂铁和其他官能部分的任何二茂铁基衍生物。二茂铁基衍生物可以任选地被其他官部分取代。二茂铁基衍生物可以由式fc表示：
[0165][0166]
其中x可以独立地代表至少一个烷基基团、一个羰基基团或可以不存在，并且n可以独立地为0-10的整数或者为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0167]
二茂铁基衍生物可以选自下组：
[0168][0169]
以及
[0170]
任选取代的二茂铁基衍生物可通过r1取代基以30％w/w-50％w/w、35％w/w-50％
w/w、40％w/w-50％w/w、45％w/w-50％w/w、30％w/w-35％w/w、30％w/w-40％w/w或30％w/w-45％w/w的接枝百分比(接枝率)与含酶聚合物连接。在某些实施方案中，任选取代的二茂铁基衍生物通过r1取代基以40％w/w的接枝率连接到含酶聚合物上。
[0171]
二茂铁基衍生物能够提供局部电活性，并因此能够参与氧化还原反应。在某些实施方案中，当二茂铁基衍生物参与氧化还原反应时，不会引起聚合物中的键的重组。
[0172]
含酶聚合物中第一重复单元与第三重复单元的摩尔比可以为1:5至5:1。在某些实施方案中，含酶聚合物中第一重复单元与第三重复单元的摩尔比为1:4至4:1、1:3至3:1、1:2至2:1或0.8:1至1:0.8。在某些实施方案中，含酶聚合物中第一重复单元与第二重复单元的摩尔比为3:1、2:1、1:1、1:2或1:3。
[0173]
a、b和d各自可以独立地为本领域已知的任何2-氨基单糖。示例性的2-氨基单糖包括但不限于2-氨基-2-脱氧-(d或l)-阿拉伯糖、3-脱氧-3-(甲基氨基)-l-阿拉伯糖(4-表-庆大糖胺(gentosamine))、2-氨基-2-脱氧-d-核糖、2-氨基-2-脱氧呋喃戊糖、2-氨基-2-脱氧-d-木糖、2-氨基-2-脱氧-d-别吡喃糖(d-阿洛糖胺)、2-氨基-2-脱氧-d-半乳糖(软骨糖胺、d-半乳糖胺)、2,6-二脱氧-2-(甲基氨基)-d-半乳糖(甲基岩藻糖胺)、2-氨基-2-脱氧-d-葡萄糖(d-葡萄糖胺、壳糖胺)、2-氨基-2-脱氧-l-葡萄糖、2-氨基-2-脱氧甘露糖(甘露糖胺)和2-脱氧-2-(甲基氨基)-l-葡萄糖。在某些实施方案中，2-氨基单糖选自葡萄糖胺、甘露糖胺和半乳糖胺。在某些实施方案中，2-氨基单糖为葡萄糖胺。
[0174]
有利地，含酶聚合物可以是稳定的、生物相容的和可生物降解的。
[0175]
在某些实施方案中，含酶聚合物包括修饰的壳聚糖聚合物，其中壳聚糖的葡萄糖胺单体单元被合成修饰，从而形成第一重复单元、第二重复单元和第三重复单元。在这些实施方案中，改性的壳聚糖聚合物还可以包括选自n-乙酰葡萄糖胺、葡萄糖胺及其组合的单体单元。
[0176]
在含酶聚合物由壳聚糖制备的情况下，壳聚糖的分子量(m
w
)可以为约10,000-约250,000g/mol、约20,000-约250,000g/mol、约30,000-约250,000g/mol、约40,000-约250,000g/mol、约50,000-约250,000g/mol、约60,000-约250,000g/mol、约70,000-约250,000g/mol、约80,000-约250,000g/mol、约90,000-约250,000g/mol、约100,000-约250,000g/mol、约120,000-约250,000g/mol、约140,000-约250,000g/mol、约160,000-约250,000g/mol、约180,000-约250,000g/mol、约200,000-约250,000g/mol、约220,000-约250,000g/mol、约240,000-约250,000g/mol、约10,000-约240,000g/mol、约10,000-约220,000g/mol、约10,000-约200,000g/mol、约10,000-约180,000g/mol、约10,000-约160,000g/mol、约10,000-约140,000g/mol、约10,000-约120,000g/mol、约10,000-约100,000g/mol、约10,000-约90,000g/mol、约10,000-约80,000g/mol、约10,000-约70,000g/mol、约10,000-约60,000g/mol、约10,000-约50,000g/mol、约10,000-约40,000g/mol、约10,000-约30,000g/mol或约10,000-约20,000g/mol。壳聚糖(chitosan)单体单元可以具有大于75％、或80％或更大的脱乙酰化度(dd)。在某些实施方案中，壳聚糖的dd为75％-95％、75％-85％或85％-95％。
[0177]
含酶聚合物可包括1-1,500个第一重复单元、第二重复单元和第三重复单元中的每一个。在某些实施方案中，含酶聚合物包含1-500个或1-50个第一重复单元、第二重复单元和第三重复单元中的每一个。含酶聚合物可以为包含第一重复单元、第二重复单元和第三重复单元的无规、交替、嵌段或顺序共聚物。
[0178]
在某些实施方案中，酶选自葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶、苹果酸氧化酶、半乳糖氧化酶、黄嘌呤脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、醇氧化酶、胆碱氧化酶、黄嘌呤氧化酶、谷氨酸氧化酶或胺氧化酶。在某些实施方案中，酶为葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。在某些实施方案中，酶为葡萄糖氧化酶(黑曲霉aspergillus niger)或乳酸氧化酶(绿色气球菌aerococcus viridans)。
[0179]
酶可以通过移除或添加电子来帮助催化底物的氧化或还原。(当将包含含酶聚合物的传感器放置在患者体内或体表的测试位点时)，酶可以为葡萄糖氧化酶以检测来自分析物的葡萄糖的存在或浓度。葡萄糖氧化酶可用于将葡萄糖氧化成葡萄糖酸。合适的氧化还原酶的存在可能有助于加速氧化反应，因此使酶活性和分析物分析变得容易。酶还可以为乳酸氧化酶以检测分析物中的乳酸盐。乳酸氧化酶可用于在氧存在下催化乳酸盐氧化成丙酮酸盐。
[0180]
有利地，含酶聚合物的特异性酶可以仅与选择的代谢物结合，然后作为介质的氧化还原聚合物将允许改善的从酶向电极的电子转移，这进而导致在电极上接收到更好的信号。
[0181]
当特异性酶选自多种酶并且用于传感器中时，可以从分析物中检测与特异性酶一致的特异性代谢物。特异性代谢物可来自多种代谢物。代谢物可以为第一代谢物和/或第二代谢物。从分析物中检测到的代谢物的数目可以为至少两种代谢物。第一代谢物和/或第二代谢物可以为相同或不同的代谢物。第一代谢物和/或第二代谢物可以选自葡萄糖、乳酸盐、黄嘌呤、胆固醇、苹果酸盐、半乳糖、黄嘌呤、醇、胆碱、黄嘌呤、谷氨酸盐和胺。在适用的情况下，除了第一代谢物和第二代谢物之外，还可以检测另外的代谢物。在某些实施方案中，r1为-n*(r)(c＝o)-、-n*(r)(cr2)
n-、-n*(r)(cr2)
n
(c＝o)-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)-、-n*(r)(cr2)
n
o-、-n*(r)(cr2)
n
(c＝o)o-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
o-或-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)o-。在某些实施方案中，r1为-n*(r)(c＝o)-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n-或-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)-或-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
o-，其中n为选自1-10、1-8或1-6之间的整数；m为选自1-10、1-8或1-6之间的整数。在某些实施方案中，r1为-n*(h)(c＝o)-、-n*(h)(c＝o)(ch2)
n-、-n*(h)(c＝o)(ch2)
n
(c＝o)-或-n*(h)(c＝o)(ch2)
n
o-，且n为选自1-10；1-8；或1-6之间的整数。在某些实施方案中，r1为-n*(h)(ch2)
6-、-n*(h)(ch2)5(c＝o)-、-n*(h)(c＝o)-、-n*(h)(ch2)(c＝o)-、-n*(h)(c＝o)(ch2)2(c＝o)-。
[0182]
在含酶聚合物中，r1可以代表任选取代的烷基、任选取代的烷酰基、任选取代的烷基氨基烷基、任选取代的烷基硫代烷基或任选取代的烷氧基烷基二价连接基。r1可以选自任选取代的c
2-c
18
烷基、任选取代的c
2-c
18
烷酰基、任选取代的c
2-c
18
烷基氨基烷基、任选取代的c
2-c
18
烷基硫代烷基和任选取代的c
2-c
18
烷氧基烷基。r1可以为任选取代的c
2-c
12
烷基或任选取代的c
2-c8烷基二价连接基。
[0183]
在某些实施方案中，r2为-n*＝ch(cr2)
n
ch＝n**-。在某些实施方案中，r2为-n*＝ch(cr2)
n
ch＝n**-，其中n为1-10、1-8、1-6。在某些实施方案中，r2为-n*＝ch(ch2)4ch＝n**-。
[0184]
在某些实施方案中，r2由以下部分表示：
[0185][0186]
在某些实施方案中，r3为-n*＝ch(cr2)
n
ch＝n**-。在某些实施方案中，r2为-n*＝ch(cr2)
n
ch＝n**-，其中n为1-10、1-8、1-6。在某些实施方案中，r2为-n*＝ch(ch2)4ch＝n**-。
[0187]
在某些实施方案中，r3由以下部分表示：
[0188][0189]
在某些实施方案中，r为氢、c
1-c6烷基、c
1-c5烷基、c
1-c4烷基、c
1-c3烷基或c
1-c2烷基。在某些实施方案中，r为氢或甲基。在某些实施方案中，r为氢。
[0190]
在某些实施方案中，m在每次出现时独立地为选自1-20、1-16、1-14、1-12、1-10、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、2-8或2-6的整数。
[0191]
在某些实施方案中，n在每次出现时独立地为选自1-20、1-16、1-14、1-12、1-10、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、2-8或2-6的整数。
[0192]
在某些实施方案中，w在每次出现时独立地为选自1-20、1-16、1-14、1-12、1-10、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、2-8或2-6的整数。
[0193]
y可以为本领域已知的任何聚烷基胺。聚烷基胺可包含乙二胺重复单元。聚烷基胺可以为直链或支链的、或树枝状的。聚烷基胺的氨基基团可以选自伯氨基、仲氨基或叔氨基或其组合。聚烷基胺可选自聚乙烯亚胺和聚(丙烯亚胺)。聚烷基胺可优选为支化聚乙烯亚胺。
[0194]
在某些实施方案中，y为选自线性聚乙烯亚胺、支化聚乙烯亚胺和树枝状聚乙烯亚胺的聚乙烯亚胺。聚乙烯亚胺的平均分子量可为1,000-50,000amu。在某些实施方案中，聚乙烯亚胺的平均分子量为5,000-50,000、5,000-40,000、5,000-30,000、10,000-30,000、15,000-25,000amu。在某些实施方案中，聚乙烯亚胺是支化的并且平均分子量为5,000-25,000、10,000-25,000、15,000-25,000、17,000-25,000、17,000-22,000、18,000-22,000或19,000-22,000amu。
[0195]
所述聚烷基胺可包括至少一种金属络合物。所述金属络合物可以为本领域已知的任何基本上无毒的金属络合物。金属络合物的选择在本领域普通技术人员的能力范围内。在某些实施方案中，金属为任选取代的二茂铁基。
[0196]
任选取代的二茂铁基衍生物可以30％w/w-50％w/w、35％w/w-50％w/w、40％w/w-50％w/w、45％w/w-50％w/w、30％w/w-35％w/w、30％w/w-40％w/w或30％w/w-45％w/w的接枝百分比(接枝率)与聚烷基胺连接。在某些实施方案中，任选取代的二茂铁基衍生物以40％w/w的接枝率与聚烷基胺连接。
[0197]
支化聚乙烯亚胺可具有包含仲胺、叔胺和伯胺端基的高度不规则结构。许多可能的支化聚乙烯亚胺重复单元中的仅一种的示例性简化表示描述如下：
[0198][0199]
前述示例性支化聚乙烯亚胺重复单元的许多结构变化可存在于支化聚乙烯亚胺中。
[0200]
支化聚乙烯亚胺可包括一种或多种金属络合物，例如任选取代的二茂铁基。金属络合物可以共价键合到伯胺或仲胺中的任何一种或多种，如以下箭头所示：
[0201][0202]
其中r4在每种情况下独立地为氢或金属络合物(例如任选取代的二茂铁基)，条件是至少一个r4为金属络合物。金属络合物可以任选地通过任选的连接基连接到聚烷基胺(例如支化聚乙烯亚胺)上。连接基可选自
--
或或其中代表来自聚烷基胺的氮，并且当为伯胺时，r
x
为氢，而当为仲胺时，r
x
为与聚烷基胺的共价键。在某些实施方案中，连接基为或或或在某些实施方案中，r4选自：
[0203][0204]
以及
[0205]
聚烷基胺具有与一个或多个第三重复单元形成一个或多个交联键的能力。聚烷基胺可以与同一条含酶聚合物链中的一个或多个第三重复单元形成分子内交联键；可以与不同的含酶聚合物链中的一个或多个第三重复单元形成分子间交联键；及其组合。在聚烷基胺与一个以上的第三重复单元形成交联键的情况下，交联结构可以表示如下：
[0206][0207]
聚烷基胺具有形成一个或多个交联键的能力，其可以如下所示：
[0208][0209]
其中q可以≥1。在某些实施方案中，q为1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、1-5或1-3。
[0210]
在某些实施方案中，第一重复单元具有式iiia：
[0211][0212]
第二重复单元具有式iiib：
[0213][0214]
第三重复单元具有式iiic：
[0215][0216]
其中
[0217]
r1为-(c＝o)-、-(c＝o)n(r)-、-(cr2)
n-、-(cr2)
n
(c＝o)-、-(c＝o)(cr2)
n-、-(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)-、-(cr2)
n
o(cr2)
m-、-(cr2)
n
s(cr2)
m-、-(cr2)
n
o-、-(cr2)
n
(c＝o)o-、-(c＝o)
(cr2)
n
o-、-(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)o-、-(cr2)
n
o(cr2)
m
o-、-(cr2)
n
s(cr2)
m
o-；
[0218]
r2为-n*＝ch(cr2)
n
ch＝n**-、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m
ch＝n**-或-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m
ch＝n**-；
[0219]
r3为-n*＝ch(cr2)
n
ch＝n**-、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m
ch＝n**-或-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m
ch＝n**-；
[0220]
r在每次出现时独立地为氢或低级烷基；
[0221]
m在每次出现时独立地为选自1-20的整数；
[0222]
n在每次出现时独立地为选自1-20的整数；以及
[0223]
y是包含至少一种金属络合物的聚烷基胺，其中该聚烷基胺任选地交联所述第三重复单元中的至少两个。
[0224]
在某些实施方案中，第一重复单元具有式iiia，第二重复单元具有式iiib，第三重复单元具有式iiic，其中r1为-(c＝o)-、-(c＝o)(ch2)
n-、-(c＝o)(ch2)
n
(c＝o)-、-(ch2)
n
(c＝o)o-或-(c＝o)(ch2)
n
o-；r2为-(ch2)
n-；r3为-(ch2)
n-；且y为支化聚乙烯亚胺，其包括至少一个与具有以下结构的部分共价键合的伯胺或仲胺：
[0225][0226]
在某些实施方案中，第一重复单元具有式iiia，第二重复单元具有式iiib，第三重复单元具有式iiic，r1为-(c＝o)-；r2为-(ch2)
3-；且r3为-(ch2)
3-。
[0227]
在某些实施方案中，含酶聚合物还包括式iiid的第四重复单元：
[0228][0229][0230]
在某些实施方案中，含酶聚合物中至多40％的重复单元为第四重复单元。在某些实施方案中，含酶聚合物中0.1％-40％、5％-40％、10％-40％或者20％-40％的重复单元为第四重复单元。
[0231]
在某些实施方案中，含酶聚合物还包括式iiie的第五重复单元：
[0232][0233]
在某些实施方案中，式iiid的第四重复单元与式iiie的第五重复单元之间的比例为至少1:3。第一重复单元、第二重复单元和第三重复单元的比例将总计为式iiie的总重复
单元。在某些实施方案中，含酶聚合物可以含有至多5％的仍然未反应的式iiie的第五重复单元。
[0234]
本文还提供了氧化还原聚合物。氧化还原聚合物是用于制备本文所述的含酶聚合物的有用的合成中间体。在某些实施方案中，氧化还原聚合物包含式iia的第一重复：
[0235][0236]
和式iib的第二重复单元：
[0237][0238]
或其共轭盐，其中
[0239]
a和b各自独立地为2-氨基单糖。
[0240]
金属为在生理条件下具有低于过氧化氢的氧化还原电位的金属络合物；
[0241]
r1为-n*(r)(c＝o)-、-n*(r)(c＝o)n(r)-、-n*(r)(cr2)
n-、-n*(r)(cr2)
n
(c＝o)-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)-、-n*(r)(cr2)
n
o(cr2)
m-、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m-、-n*(r)(cr2)
n
o-、-n*(r)(cr2)
n
(c＝o)o-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
o-、-n*(r)(c＝o)(cr2)
n
(c＝o)o-、-n*(r)(cr2)
n
o(cr2)
m
o-、-n*(r)(cr2)
n
s(cr2)
m
o-、-n*＝ch(cr2)
n-、-n*＝ch(cr2)
n
(c＝o)-、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m-、-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m-、-n*＝ch(cr2)
n
o-、-n*＝ch(cr2)
n
(c＝o)o-、-n*＝ch(cr2)
n
o(cr2)
m
o-或-n*＝ch(cr2)
n
s(cr2)
m
o-，其中n*代表2-氨基单糖2位上的氮。
[0242]
r在每次出现时独立地为氢或低级烷基；
[0243]
m在每次出现时独立地为选自1-20的整数；以及
[0244]
n在每次出现时独立地为选自1-20的整数。
[0245]
在氧化还原聚合物的某些实施方案中，a、b、r1、r、m、n和金属的定义与前面定义的相同。
[0246]
在氧化还原聚合物的某些实施方案中，第一重复单元具有式iiie：
[0247][0248]
并且第二重复单元具有式ivb：
[0249][0250]
其中r1为-(c＝o)-、-(c＝o)(ch2)
n-、-(c＝o)(ch2)
n
(c＝o)-、-(ch2)
n
(c＝o)o-或-(c＝o)(ch2)
n
o-。
[0251]
在氧化还原聚合物的某些实施方案中，第二重复单元具有式ivb且r1为-(c＝o)-。
[0252]
在某些实施方案中，氧化还原聚合物还包括式iiid的第三重复单元：
[0253][0254]
在某些实施方案中，氧化还原聚合物中至多40％的重复单元为第三重复单元。在某些实施方案中，氧化还原聚合物中0.1％-40％、5％-40％、10％-40％或者20％-40％的重复单元为第三重复单元。
[0255]
氧化还原聚合物可包括具有官能团的侧链，该官能团促进与具有合适官能团的其他分子的交联。这允许聚合物也连接到多种分子上。结合这两个特性，这些聚合物非常适合用于需要电子介导的应用，例如用于生物传感器和生物燃料电池的酶电极，以及在酶电反应器中进行的酶促合成。
[0256]
氧化还原聚合物可以为可被认为是电化学活化剂的聚合物氧化还原介体。电化学活化剂可表示为单体电化学活化剂。电化学活化剂可以含有氧化还原活性金属离子。氧化还原金属离子可选自铁、银、金、铜、镍、钴、锇或钌离子及其混合物。电化学活化剂可优选为二茂铁基衍生物。二茂铁基衍生物可以是水溶性的。
[0257]
氧化还原聚合物可以相应地结合到膜中。氧化还原聚合物可具有在分析样品期间或当传感器夹在组织上时防止或基本上减少氧化还原物质的扩散损失的化学结构。氧化还原介体的扩散损失可以通过使氧化还原聚合物从传感器的工作电极上非释放而降低。一种类型的非释放的聚合物氧化还原介体可以包含与聚合物化合物共价连接的氧化还原物质。氧化还原聚合物可以为具有与合适的聚合物骨架共价键合的氧化还原活性过渡金属基侧基的过渡金属化合物。聚合物骨架可以是或不是电活性的。聚合物骨架可以为含氨基的多糖基团。
[0258]
有利地，氧化还原聚合物能够调节不同电极之间的电流，使得分析物的电解(电氧化或电还原)平稳。更有利地，氧化还原介体还可以使得不适合在工作电极上直接电化学反应的分析物分子能够进行电化学分析。
[0259]
氧化还原聚合物的分子量可以为约50,000-约190,000道尔顿、约60,000-约190,
000、约70,000-约190,000、约80,000-约190,000、约90,000-约190,000、约100,000-约190,000、约110,000-约190,000、约120,000-约190,000、约130,000-约190,000、约140,000-约190,000、约150,000-约190,000、约160,000-约190,000、约170,000-约190,000、约180,000-约190,000、约50,000-约60,000、约50,000-约70,000、约50,000-约80,000、约50,000-约90,000、约50,000-约100,000、约50,000-约110,000、约50,000-约120,000、约50,000-约130,000、约50,000-约140,000、约50,000-约150,000、约50,000-约160,000、约50,000-约170,000、约50,000-约180,000道尔顿。
[0260]
氧化还原聚合物可具有约2wt％-约40wt％、约2wt％-约35wt％、约2wt％-约30wt％、约2wt％-约25wt％、约2wt％-约20wt％、约2wt％-约17wt％、约17wt％-约40wt％、约20wt％-约40wt％、约25wt％-约40wt％、约30wt％-约40wt％、约35wt％-约40wt％、约2wt％-约3wt％、约3wt％-约14wt％、约14wt％-约20wt％或者约14wt％-约40wt％的二茂铁负载。
[0261]
氧化还原聚合物可优选具有至少高于wt 2％的高水平的二茂铁负载。低水平的二茂铁负载通常可能会限制可测量的葡萄糖浓度。
[0262]
葡萄糖浓度可能远高于存在的二茂铁分子的介导能力。因此，所产生的电流响应可能受到少量的介导二茂铁分子的限制，从而导致不准确的测量。因此，通过使用具有较高水平的二茂铁负载的式(ii)的氧化还原聚合物，可以用传感器测试的葡萄糖浓度的上限升高，并且因此需要较小体积的样品。
[0263]
现在将公开制备含酶聚合物的方法的示例性非限制性实施方案。
[0264]
该方法可包括以下步骤：
[0265]
(i)使如上定义的氧化还原聚合物和包含至少一种金属络合物的聚烷基胺在第一交联剂的存在下接触，从而形成所述含酶聚合物的前体，以及(ii)使所述含酶聚合物的前体与酶在第二交联剂的存在下接触，从而形成所述含酶聚合物。
[0266]
(i)中的接触步骤可以指在第一交联剂的存在下，氧化还原聚合物的溶液与包含至少一种金属络合物的聚烷基胺的溶液混合。可以通过将氧化还原聚合物溶解在磷酸盐缓冲盐(pbs)溶液中来制备氧化还原聚合物溶液。可以通过将包含至少一种金属络合物的聚烷基胺溶解在酸性溶液例如乙酸溶液中来制备包含至少一种金属络合物的聚烷基胺溶液。第一交联剂可以为包含至少两个醛官能团的反应物。包含至少两个醛官能团的反应物可以为在低级烷基反应物的两个末端中的每个末端均包含醛官能团的低级烷基反应物。第一交联剂可以为乙二醇二缩水甘油醚、聚(乙二醇)二缩水甘油醚或戊二醛。在某些实施方案中，第一交联剂为戊二醛。可以通过将交联剂溶解在磷酸盐缓冲盐(pbs)溶液中来制备第一交联剂溶液。交联剂溶液可以在加入到反应混合物中之前在水溶液中进一步稀释。步骤(i)的反应时间可以为约1-约6小时、约2-约6小时、约3-约6小时、约4-约6小时、约5-约6小时、约1-约2小时、约1-约3小时、约1-约4小时、约1-约5小时。反应时间可以优选为2小时。该反应可以在室温下进行。室温可以为约20-约25℃或者为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃。
[0267]
(ii)中的接触步骤可以是指在第二交联剂的存在下，将在步骤(i)中获得的所述含酶聚合物的前体溶液与酶溶液混合，从而形成含酶聚合物。酶可以为葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。酶溶液可以通过将酶与pbs溶液混合来制备。第二交联剂可以为包含至少两个醛官能团的反应物。包含至少两个醛官能团的反应物可以为在低级烷基反应物的两个末端中
的每个末端均包含醛官能团的低级烷基反应物。第二交联剂可以为乙二醇二缩水甘油醚、聚(乙二醇)二缩水甘油醚或戊二醛。在某些实施方案中，第二交联剂为戊二醛。制备含酶聚合物的方法的反应时间可以为约20分钟-约20小时、约20分钟-60分钟、约1-约10小时、约1-约3小时、约1-约6小时、约3-约10小时、约6-约10小时、约10-约16小时、约11-约16小时、约12-约16小时、约13-约16小时、约14-约16小时、约15-约16小时、约10-约11小时、约10-约12小时、约10-约13小时、约10-约14小时、约10-约15小时或约16-约20小时。反应时间可以为12小时。该反应可以在室温下进行。室温可以为约20-约25℃或者为为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃。在步骤(ii)中获得的含酶聚合物可以作为薄膜薄层施加在传感器芯片上并干燥。
[0268]
在某些实施方案中，第一交联剂和第二交联剂可以为用于蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖的天然交联剂。第一交联剂和第二交联剂可以为相同或不同的交联剂。
[0269]
用于制备氧化还原聚合物的方法还可以包括以下步骤：在一种或多种试剂的存在下，使包括式iia
[0270][0271]
或其共轭盐(其中a为2-氨基单糖；)
[0272]
的第一重复的多糖与二茂铁基衍生物接触，并分离为下一步骤形成的氧化还原聚合物。
[0273]
氧化还原聚合物的多糖可以来自壳聚糖固体或壳聚糖薄片。用于制备氧化还原聚合物的方法的一种或多种试剂可以为用于在羧酸和胺之间形成酰胺的任何试剂。该试剂可以为用于形成酰胺键的偶联剂。该偶联剂可以选自：n-乙基-n
’-
(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)-鏻鎓六氟磷酸盐、苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基-鏻鎓六氟磷酸盐和(2-(7-氮杂-1h-苯并三唑-1-基)-n,n,n
’
,n
’-
四甲基铵四氟硼酸盐/六氟磷酸盐。该偶联剂可以优选为n-乙基-n'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。用于制备氧化还原聚合物的方法的一种或多种试剂可以包含添加剂。添加剂可以为促进羧酸和胺之间形成酰胺的试剂。添加剂可以选自n-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑、羟基-3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪、1-羟基-7-氮杂-1h-苯并三唑、1-羟基苯并三唑-6-磺酰胺基甲基树脂
·
hcl和4-(n,n-二甲基氨基)吡啶。在某些实施方案中，添加剂为n-羟基琥珀酰亚胺。偶联剂和添加剂的选择在本领域普通技术人员的能力范围内。当多糖与二茂铁基衍生物接触时，可以将多糖溶解在水溶液中，并且将二茂铁基衍生物溶解在溶剂中。水溶液可以为去离子水。溶剂可以为有机溶剂。有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷或亚甲基氯、氯仿、四氢呋喃、丙酮、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或1,4-二氧六环。在某些实施方案中，溶剂为甲醇或无水甲醇。制备氧化还原聚合物的方法的反应时间可以为约1-约20小时、约1-约3小时、约1-约6小时、约3-约10小时、约6-约10小时、约1-约10小时、约10-约16小时、约11-约16小时、约12-约16小时、约13-约16小时、约14-约16小时、约15-约16小时、约10-约11小时、约10-约12小时、约10-约13小时、约10-约14小时、约10-约15小时或约16-约20小时。反应时间
可以为12小时。该反应可以于室温下在惰性气氛下，优选在氮气或氩气气氛下进行。室温可以为约20-约25℃或者为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃。分离氧化还原聚合物的方法可以为本领域普通技术人员技术范围内的标准分离技术。分离方法中使用的碱可以为任何无机碱，优选氢氧化钠。分离过程根据需要可能需要其他水溶液或溶剂，优选无水甲醇。氧化还原聚合物还可溶解于酸性溶液中以用于下一步骤。酸性溶液可以由有机酸、优选乙酸制备。
[0274]
制备包含至少一种金属络合物的聚烷基胺的方法还可以包括在碱性反应条件下使二茂铁基衍生物与聚烷基胺接触，并分离为下一步骤形成的包含至少一种金属络合物的聚烷基胺。
[0275]
聚烷基胺可以如上所述选择，并且可以溶解在有机溶剂中，优选无水甲醇中。二茂铁基衍生物可以如上所述选择，并且可以溶解在有机溶剂中，优选无水甲醇中。使二茂铁基衍生物与聚烷基胺接触的步骤可以为在碱性条件下将二茂铁基衍生物溶液滴加到聚烷基胺溶液中的形式。碱性条件可以包括在溶剂中的有机碱，优选在无水甲醇中的三乙胺。制备包含至少一种金属络合物的聚烷基胺的方法的反应时间可以为约1-约20小时、约1-约3小时、约1-约6小时、约3-约10小时、约6-约10小时、约1-约10小时、约10-约16小时、约11-约16小时、约12-约16小时、约13-约16小时、约14-约16小时、约15-约16小时、约10-约11小时、约10-约12小时、约10-约13小时、约10-约14小时、约10-约15小时或约16-约20小时。反应时间可以为12小时。
[0276]
该反应可以于室温下在惰性气氛下，优选在氮气或氩气气氛下进行。室温可以为约20-约25℃或者为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃。分离包含至少一种金属络合物的聚烷基胺的方法可以为本领域普通技术人员技术范围内的标准分离技术。分离过程中使用的溶剂可以为任何有机溶剂，例如选自氯仿、己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷或亚甲基氯和乙腈的有机溶剂。在某些实施方案中，用于分离过程的有机溶剂是氯仿和己烷的组合。氯仿/己烷混合溶剂的体积/体积(v/v)比可以为1:5v/v、1:4v/v、1:3v/v、1:2v/v或1:1v/v，更优选1:4v/v。分离过程根据需要可能需要其他水溶液或溶剂，优选甲醇。包含至少一种金属络合物的聚烷基胺还可以溶解在缓冲溶液中以用于下一步骤。缓冲溶液可以制备为磷酸盐缓冲盐(pbs)溶液。
[0277]
在某些实施方案中，该方法可以包括在交联剂的存在下使如上定义的氧化还原聚合物与酶接触，从而形成含酶聚合物。
[0278]
该方法还可包括以下步骤：a)通过在特定温度下搅拌一段时间，将多糖前体与酸混合制备多糖溶液；b)将二茂铁基衍生物溶解在溶剂和醇的混合溶液中；c)将多糖溶液和二茂铁基溶液混合，然后加热一段时间，并分离所形成的氧化还原聚合物；以及d)将步骤(c)中形成的氧化还原聚合物的溶液与酶在交联剂的存在下混合，从而形成所述含酶聚合物。
[0279]
多糖前体可以为壳聚糖固体或壳聚糖薄片。酸可以为无机酸或有机酸。酸可以为乙酸、甲酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸和苯甲酸。在某些实施方案中，酸为乙酸。
[0280]
步骤(a)中的反应时间可以在30分钟-12小时之间变化。它可以在约30分钟-约6小时、约1-约6小时、约1.5-约6小时、约2-约6小时、约2.5-约6小时、约3-约6小时、约3.5-约6小时、约4-约6小时、约5-约6小时、约30分钟-约5小时、约30分钟-约4小时、约30分钟-约3小
时、约30分钟-约2小时、约30分钟-约1小时、约6-约12小时、约7-约12小时、约8-约12小时、约9-约12小时、约10-约12小时、约11-约12小时、约6-约7小时、约6-约8小时、约6-约9小时、约6-约10小时、约6-约11小时的范围内变化，或者优选可以为约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时或约6小时或者更优选为约3小时。
[0281]
步骤(a)中的第一反应温度可以为约20-约25℃或者为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃，或者优选为室温。
[0282]
在步骤(b)中，反应可以在溶剂中进行。溶剂可以选自乙酸乙酯、二氯甲烷或亚甲基氯、四氢呋喃(thf)、丙酮、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、1,4-二氧六环及其组合。溶剂可优选为乙酸乙酯或丙酮。醇可以为选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、3-戊醇或己醇的直链烷基醇或支链烷基醇。在某些实施方案中，醇为甲醇。
[0283]
步骤(c)中的反应混合物条件可以为酸性、碱性或中性条件。反应混合物条件可以优选为在碱性ph条件下。当在碱性条件下时，在步骤(c)中产生碱性ph条件的碱可以为无机碱或有机碱。无机碱可以为无机化合物。无机碱可以选自碳酸钾、三元磷酸钾或碳酸铯。无机碱可以优选为碳酸钾。有机碱可以为有机化合物。有机碱可以为包含有机碱的质子受体。有机碱可以选自三乙胺、hunig碱、吡啶、甲胺、咪唑、苯并咪唑和组氨酸。有机碱可以优选为三乙胺。反应混合物条件可以优选为在中性条件下。当在中性条件下时，可以在步骤(c)中的多糖和二茂铁基溶液中加入还原剂。还原剂可以为在氧化还原化学反应中失去电子变成另一化学物质的元素或化合物。当还原剂失去电子时，可以说该还原剂已经被氧化。还原剂可以选自氢化铝锂、硼氢化钠、硫酸铁(ii)、氢化二异丁基铝和氯化锡(ii)。
[0284]
步骤(c)中的加热可以在适合于溶剂沸点的升高的反应温度下进行。升高的反应温度可以为约50-约80℃、约50-约55℃、约50-约60℃、约50-约65℃、约50-约70℃、约50-约75℃、约55-约80℃、约60-约80℃、约65-约80℃、约70-约80℃或约75-约80℃。升高的反应温度可以认为是加热到溶剂的回流温度。
[0285]
步骤(c)中的反应时间可以在约20-约28小时、约20-约27小时、约20-约26小时、约20-约25小时、约20-约24小时、约20-约23小时、约20-约22小时、约20-约21小时、约21-约28小时、约22-约28小时、约23-约28小时、约24-约28小时或约25-约28小时、约26-约28小时、约27-约28小时的范围内变化或者优选为约24小时。
[0286]
反应完成后，可以用非极性溶剂提取含有氧化还原聚合物的反应溶液。非极性溶剂可选自乙醚、己烷、戊烷、环己烷、甲苯和氯仿。非极性溶剂可优选为乙醚。
[0287]
然后通过用干燥剂干燥反应溶液、过滤并加压浓缩来分离氧化还原聚合物。干燥步骤也被认为是提取步骤，可以进行至少一次、两次、三次、四次或至多五次。干燥剂可以选自无水硫酸钠、硫酸镁、氯化钙或硫酸钙。合并的反应溶液可以减压浓缩。反应残余物(反应粗产物)可以通过洗涤和进一步干燥来纯化。
[0288]
在步骤(d)中，将步骤(c)中形成的氧化还原聚合物溶解在水溶液中并在交联剂的存在下与酶反应以形成含酶聚合物。水溶液可以为缓冲溶液。缓冲溶液可以为由弱酸及其共轭碱的混合物组成的水溶液，反之亦然。当加入少量强酸或碱时，ph值变化很小。缓冲溶液可用作监测接近恒定值的ph值的手段。缓冲溶液可以选自柠檬酸-na2hpo4溶液、柠檬酸-柠檬酸钠溶液和乙酸钠-乙酸溶液。缓冲溶液最好是乙酸钠-乙酸(hoac/oac-)溶液。
[0289]
如上定义的化合物可以根据如上所公开的一般方法或根据工作实例的一般原理
制备。如上定义的化合物可以通过其他替代的化学反应制备并且不限于如上公开的一般方法。
[0290]
然后可以使用含酶聚合物在传感器上形成感测层，该传感器可以用于监测组织的衰竭。含酶聚合物可在选自约10-约14小时、约11-约14小时、约12-约14小时、约13-约14小时、约10-约11小时、约10-约12小时、约10-约13小时或优选约12小时的时间段内固化在传感器表面上。
[0291]
现在将公开监测表面和掩埋组织的生理变化以便检测衰竭早期症状的系统的示例性非限制性实施方案。监测系统可以包括如本文所定义的传感器；以及如本文所定义的监测器，其中监测器的接收器被布置成在使用中接收传感器的输出。这里，组织可以指皮瓣或器官，例如移植的器官。
[0292]
该系统可以包括一个或多个电化学代谢物生物传感器，其与具有相关算法的传感器读取器连接，该传感器读取器直接测量组织内的代谢物浓度。该系统力图在衰竭组织的早期检测中提供高灵敏度和准确性，并在至少5-7天内具有良好的长期稳定性。该系统旨在用于病房和重症监护室(icu)以监测患者(例如刚刚进行了皮瓣重建手术的患者)的组织。该系统的优点包括准确性、使用方便(即需要很少的训练)、自动化(即不需要人工监督)、快速响应时间(从血管血栓形成事件起15分钟内)和连续监测(5-7天)。在数据记录期间，电极是固定的。
[0293]
在一个实施方式中，组织传感器被放置在组织处或组织内部。如果由组织传感器读取的来自组织的第二代谢物(如乳酸盐)的量与对照值相比升高到某一阈值以上，并且如果由组织传感器读取的来自组织的第一代谢物(如葡萄糖)的量与对照值相比降低到某一阈值以下，则解释为组织开始衰竭。该对照值可以借助于放置在同一患者的正常、健康部分之上或之内的对照传感器来获得，使得测试传感器和对照传感器之间的任何偏差可以被认为是组织的健康或衰竭的指示。可以设想，可以使用或获取其他可能的对照读数，以基于不同的代谢物组成和/或化学组分/化合物水平和/或其他特征来确定、分析和监测组织衰竭状况。因此，可以使用其他替代算法来确定组织衰竭状况。
[0294]
根据一个实施方案，提供了通过连续监测血液代谢物如葡萄糖和乳酸的水平变化来检测组织中血管血栓形成的电化学代谢物生物传感器。生物传感器可以在临床诊断中有效，因为它可以将来自生物事件的信息转换为可测量的信号。生物传感器可以由必须是选择性的生物识别元件、产生可测量信号的转换器和信号处理单元组成。电化学生物传感器可以在电极/转换器上包含生物识别元件，该生物识别元件与分析物反应，然后产生相应的电化学信号。电化学生物传感器的优点是它们便宜、提供快速响应、具有高灵敏度和简单的构造。关于血液代谢物、葡萄糖和乳酸，基于酶的电流型生物传感器将电化学技术与酶的特异性结合。以葡萄糖为例，所采用的感测原理是基于葡萄糖氧化酶(gox)催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸内酯的反应。体内连续葡萄糖监测可以通过基于用于皮下监测的金或碳材料的可植入式葡萄糖传感器来实现。这种装置可以插入皮肤并显示实时葡萄糖浓度。一次性传感器每分钟产生读数，并且通常可以使用三到七天。该系统不是直接测量血糖，而是跟踪皮下组织间质液中的葡萄糖水平。这里，提供了一种用于连续监测间质液代谢物(用于此实施方案的葡萄糖和乳酸盐)的实时电化学生物传感器。
[0295]
在组织重建手术结束时，外科医生可以将一个或多个传感器(称为组织传感器)植
入重建组织的表面。可以将对照传感器植入健康的非皮瓣组织区域。来自两个传感器的读数之间的差值确定了该组织是健康的还是衰竭的。当组织发生衰竭时，来自传感器、组织和对照传感器的读数都可能遵循某种模式。例如，当代谢物为葡萄糖和乳酸盐时，差值或偏差为葡萄糖水平降低了至少10％和/或乳酸盐水平增加了至少10％。至少两种代谢物的组织传感器与对照传感器之间的差值或偏差可以遵循相同的方向(即，至少两种代谢物可以全部增加，或至少两种代谢物可以全部减少)。可替代地，各代谢物采取的方向可以彼此相反。组织传感器和对照传感器之间的差值或偏差可以取决于被检测的代谢物的类型以及被监测的组织的类型。与组织接触的电化学葡萄糖和乳酸盐传感器可以在血管阻塞的数分钟内检测代谢物变化。
[0296]
用于监测患者组织衰竭的方法可以包括以下步骤：
[0297]
(i)在所述组织上或组织内提供如本文中所定义的第一传感器，所述第一传感器能够检测和测量第一代谢物的量；
[0298]
(ii)在所述患者的对照区域上提供如本文所定义的第二传感器，所述对照区域与所述组织分离，并且其中所述第二传感器能够检测和测量所述第一代谢物的量；
[0299]
(iii)在所述组织上或组织内提供如本文所定义的第三传感器，所述第三传感器能够检测和测量第二代谢物的量，并且其中所述第三传感器与第一传感器相同或不同；
[0300]
(iv)在所述患者的所述对照区域上提供如本文所定义的第四传感器，所述第四传感器能够检测和测量所述第二代谢物的量，并且其中所述第四传感器与第二传感器相同或不同；
[0301]
(v)监测在一段时间内由所述第一传感器和第二传感器测量的所述第一代谢物的量；
[0302]
(vi)监测在一段时间内由所述第三传感器和第四传感器测量的所述第二代谢物的量；
[0303]
其中与由所述第二传感器测量的所述第一代谢物的量相比，由所述第一传感器测量的所述第一代谢物的量降低了至少10％；以及与由所述第四传感器测量的所述第二代谢物的量相比，由所述第三传感器测量的所述第二代谢物的量增加了至少10％，指示所述组织易于衰竭。
[0304]
用于监测患者组织衰竭的方法可以包括以下步骤：
[0305]
(i)在所述组织上或组织内提供第一传感器，所述第一传感器能够检测和测量第一代谢物的量；
[0306]
(ii)在所述患者的对照区域上提供第二传感器，所述对照区域与所述组织分离，并且其中所述第二传感器能够检测和测量所述第一代谢物的量；
[0307]
(iii)在所述组织上或组织内提供第三传感器，所述第三传感器能够检测和测量第二代谢物的量，并且其中所述第三传感器与第一传感器相同或不同；
[0308]
(iv)在所述患者的所述对照区域上提供第四传感器，所述第四传感器能够检测和测量所述第二代谢物的量，并且其中所述第四传感器与第二传感器相同或不同；
[0309]
(v)监测在一段时间内由所述第一传感器和第二传感器测量的所述第一代谢物的量；
[0310]
(vi)监测在一段时间内由所述第三传感器和第四传感器测量的所述第二代谢物
的量；
[0311]
其中由所述第一传感器测量的所述第一代谢物的量与由所述第二传感器测量的所述第一代谢物的量基本相同；以及与由所述第四传感器测量的所述第二代谢物的量相比，由所述第三传感器测量的所述第二代谢物的量增加了至少10％，指示所述组织易于衰竭。
[0312]
由所述第一传感器测量的所述第一代谢物的量和由所述第二传感器测量的所述第一代谢物的量可以基本相同，而由所述第三传感器和所述第四传感器测量的所述第二代谢物的量增加。
[0313]
用于监测患者组织衰竭的方法可以包括以下步骤：
[0314]
(i)在所述组织上或组织内提供第一传感器，所述第一传感器能够检测和测量第一代谢物的量；
[0315]
(ii)在所述患者的对照区域上提供第二传感器，所述对照区域与所述组织分离，并且其中所述第二传感器能够检测和测量所述第一代谢物的量；
[0316]
(iii)在所述组织上或组织内提供第三传感器，所述第三传感器能够检测和测量第二代谢物的量，并且其中所述第三传感器与第一传感器相同或不同；
[0317]
(iv)在所述患者的所述对照区域上提供第四传感器，所述第四传感器能够检测和测量所述第二代谢物的量，并且其中所述第四传感器与第二传感器相同或不同；
[0318]
(v)监测在一段时间内由所述第一传感器和第二传感器测量的所述第一代谢物的量；
[0319]
(vi)监测在一段时间内由所述第三传感器和第四传感器测量的所述第二代谢物的量；
[0320]
其中与由所述第二传感器测量的所述第一代谢物的量相比，由所述第一传感器测量的所述第一代谢物的量降低了至少10％；以及由所述第三传感器测量的所述第二代谢物的量与由所述第四传感器测量的所述第二代谢物的量基本相同，指示所述组织易于衰竭。
[0321]
由所述第三传感器测量的所述第二代谢物的量和由所述第四传感器测量的所述第二代谢物的量可以基本相同，而由所述第一传感器和所述第二传感器测量的所述第一代谢物的量降低。
[0322]
用于监测患者组织衰竭的方法可以包括以下步骤：
[0323]
(i)在所述组织上或组织内提供第一传感器，所述第一传感器能够检测和测量第一代谢物的量；
[0324]
(ii)在所述患者的对照区域上提供第二传感器，所述对照区域与所述组织分离，并且其中所述第二传感器能够检测和测量所述第一代谢物的量；
[0325]
(iii)在所述组织上或组织内提供第三传感器，所述第三传感器能够检测和测量第二代谢物的量，并且其中所述第三传感器与第一传感器相同或不同；
[0326]
(iv)在所述患者的所述对照区域上提供第四传感器，所述第四传感器能够检测和测量所述第二代谢物的量，并且其中所述第四传感器与第二传感器相同或不同；
[0327]
(v)监测在一段时间内由所述第一传感器和第二传感器测量的所述第一代谢物的量；
[0328]
(vi)监测在一段时间内由所述第三传感器和第四传感器测量的所述第二代谢物
的量；
[0329]
其中与由所述第二传感器测量的所述第一代谢物的量相比，由所述第一传感器测量的所述第一代谢物的量降低了至少10％；以及与由所述第四传感器测量的所述第二代谢物的量相比，由所述第三传感器测量的所述第二代谢物的量降低了至少10％，指示所述组织易于衰竭。
[0330]
用于监测患者组织衰竭的方法可以包括以下步骤：
[0331]
(i)在所述组织上或组织内提供第一传感器，所述第一传感器能够检测和测量第一代谢物的量；
[0332]
(ii)在所述患者的对照区域上提供第二传感器，所述对照区域与所述组织分离，并且其中所述第二传感器能够检测和测量所述第一代谢物的量；
[0333]
(iii)在所述组织上或组织内提供第三传感器，所述第三传感器能够检测和测量第二代谢物的量，并且其中所述第三传感器与第一传感器相同或不同；
[0334]
(iv)在所述患者的所述对照区域上提供第四传感器，所述第四传感器能够检测和测量所述第二代谢物的量，并且其中所述第四传感器与第二传感器相同或不同；
[0335]
(v)监测在一段时间内由所述第一传感器和第二传感器测量的所述第一代谢物的量；
[0336]
(vi)监测在一段时间内由所述第三传感器和第四传感器测量的所述第二代谢物的量；
[0337]
其中与由所述第二传感器测量的所述第一代谢物的量相比，由所述第一传感器测量的所述第一代谢物的量增加了至少10％；以及与由所述第四传感器测量的所述第二代谢物的量相比，由所述第三传感器测量的所述第二代谢物的量增加了至少10％，指示所述组织易于衰竭。
[0338]
第一代谢物的量或水平可以降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。第一代谢物可以为葡萄糖。
[0339]
第二代谢物的量或水平可以增加至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。第二代谢物可以为乳酸盐。
[0340]
通过具有能够测量第一代谢物和第二代谢物的基线或自然量或静止量的对照传感器(如第二传感器和第四传感器所示)，以及通过使用与这些基线量的百分比偏差(由第一传感器和第三传感器测量)来确定组织(可以为皮瓣或移植的器官)是否容易衰竭或可能衰竭，这可以被认为是用于确定组织是否易于衰竭的自参考或自校准方法。因此，通过具有在第一代谢物和第二代谢物的测量中形成基线的对照传感器，并获得与基线测量值的偏差，这可以允许具有更高准确度的更精确的系统。通过测定第一代谢物和第二代谢物的值并监测这些值，可以进行更准确的测定。
[0341]
在一个实施方式中，可以通过考虑以下因素的算法来确定组织衰竭：(i)组织值相对于对照传感器值的偏差，以及(ii)在预定时间段内组织传感器相对于对照传感器的偏差的历史趋势，预定时间例如2分钟、5分钟、10分钟或15分钟，以使噪声信号的影响最小化。
[0342]
例如，在特定时间窗口(例如，x至x+5秒)内，组织传感器值相对于对照传感器值的偏差为30％。在随后的5秒(即x+5至x+10秒)内，组织传感器值相对于对照传感器值的偏差
为10％。然而，在前10分钟(即，x-10分钟)内，组织传感器值的偏差为5％-15％。基于历史趋势，该算法可以确定在x至x+5秒内信号中存在噪声，并且可以基于x-10分钟内的偏差范围来归一化该时间窗口内30％的偏差。
[0343]
现在将公开监测器的示例性非限制性实施方案。
[0344]
监测器可包括：接收器模块，其被配置为接收传感器的传感器输出和另一传感器的对照输出；处理器模块，其被配置为接收来自接收器模块的对应于传感器输出的第一代谢物浓度值和对应于对照输出的第一对照值，其中，处理器模块被配置为：将第一代谢物浓度值与第一对照值进行比较；以及在第一代谢物浓度值与第一对照值的差值大于第一预定值的条件下，产生第一报警信号。
[0345]
监测器的处理器模块还可以配置为从接收器模块接收对应于传感器输出的第二代谢物浓度值和对应于对照输出的第二对照值，并且其中处理器模块进一步配置为：将第二代谢物浓度值与第二对照值进行比较；以及在所述第二代谢物浓度值与所述第二对照值之间的差值高于第二预定值的条件下产生第二警报信号。
[0346]
监测器的处理器模块可以被配置为在第一代谢物浓度值与第一对照值之间的差值可以与第一预定值相差至少10％的条件下产生第一警报信号。
[0347]
监测器的处理器模块可以被配置为在第二代谢物浓度值与第二对照值之间的差值可以与第二预定值相差至少10％的条件下产生第二警报信号。
[0348]
用于监测患者组织衰竭的方法可以包括以下步骤：
[0349]
(i)在所述组织上或组织内提供第一传感器，所述第一传感器能够检测和测量第一代谢物的量；
[0350]
(ii)在所述患者的对照区域上提供第二传感器，所述对照区域与所述组织分离，并且其中所述第二传感器能够检测和测量所述第一代谢物的量；
[0351]
(iii)在所述组织上或组织内提供第三传感器，所述第三传感器能够检测和测量第二代谢物的量，并且其中所述第三传感器与第一传感器相同或不同；
[0352]
(iv)在所述患者的所述对照区域上提供第四传感器，所述第四传感器能够检测和测量所述第二代谢物的量，并且其中所述第四传感器与第二传感器相同或不同；
[0353]
(v)监测在一段时间内由所述第一传感器和第二传感器测量的所述第一代谢物的量；
[0354]
(vi)监测在一段时间内由所述第三传感器和第四传感器测量的所述第二代谢物的量；
[0355]
其中与由所述第二传感器测量的所述第一代谢物的量相比，由所述第一传感器测量的所述第一代谢物的量降低了至少10％；以及与由所述第四传感器测量的所述第二代谢物的量相比，由所述第三传感器测量的所述第二代谢物的量增加了至少10％，指示所述组织易于衰竭。
[0356]
现在将公开传感器和制造传感器的方法的示例性非限制性实施方案。
[0357]
在一个实施方案中，传感器可以包括衬底、衬底上的第一传感器电极、第一传感器电极上的第一感测层以及衬底上的参比电极。第一感测层包括第一含酶聚合物，所述含酶聚合物为根据本文公开的实施方案的含酶聚合物。
[0358]
传感器还可以包括衬底上的第二传感器电极以及第二传感器电极上的第二感测
层。第二感测层包括第二含酶聚合物，所述含酶聚合物为根据本文公开的实施方案的含酶聚合物。
[0359]
第一含酶聚合物和/或第二含酶聚合物的厚度可以为约0.010-约0.300mm。第一传感器电极和/或第二传感器电极可以为具有允许导电性的惰性材料的电极。第一传感器电极和/或第二传感器电极可以包括金，并且参比电极可以包括银-氯化银(ag/agcl)。参比电极通过提供稳定的参考电位而用作参考。
[0360]
在同时具有(i)第一传感器电极和相关的第一感测层以及(ii)第二传感器电极和相关的第二感测层的实施方式中，(i)第一传感器电极和相关的第一感测层检测第一代谢物的浓度，同时(ii)第二传感器电极和相关的第二感测层检测第二代谢物的浓度。输出为电流信号。此外，尖端部分可以具有用于第一传感器电极、第二传感器电极和参比电极的三个凹槽。第一代谢物可以为葡萄糖，第二代谢物可以为乳酸盐。
[0361]
传感器还可以包括细长主体部分和尖端部分，细长主体部分具有在中心延伸穿过细长主体部分的主体轴线，尖端部分具有在中心延伸穿过尖端部分的尖端轴线。尖端部分包括衬底(以及传感器电极和感测层)。尖端部分邻近细长主体部分并以主体轴线和尖端轴线之间的90
°-
170
°
、更优选地130
°-
160
°
的钝角布置。
[0362]
与没有任何弯曲部分的细长传感器装置相比，这种排列(即，尖端部分邻近细长主体部分并以90
°-
170
°
的钝角布置)有利地促进组织穿透。
[0363]
细长主体部分可以包括流体储存器并且尖端部分还可以包括可膨胀构件。在流体储存器和可膨胀构件之间布置有通道，以提供流体储存器和可膨胀构件之间的流体连通。
[0364]
细长主体部分还可以包括致动器，致动器被配置为将流体储存器中的一定量的流体通过通道递送至可膨胀构件以便使该可膨胀构件膨胀。有利地，可膨胀构件允许无针固定并且将传感器容易地移除到表面和掩埋组织(例如皮瓣)上。例如，在将传感器插入到患者身体中之后，可膨胀构件可连续膨胀以在患者身体中提供更紧密的配合，从而将传感器更好地固定到患者身体。换言之，可膨胀构件被设计为向外扩大，这样使得传感器可以通过可膨胀构件和组织之间的摩擦接触而保持在患者体内的适当位置。在移除传感器期间，可膨胀构件可进一步膨胀以暂时移位传感器周围的组织以便于移除传感器。可替代地，在移除传感器期间，可膨胀构件可以被放泄流以便于传感器的移除。所述流体可以为一种不可压缩的流体，如填充在流体储存器腔室内的盐水溶液。可膨胀构件可以由弹性体制成。
[0365]
传感器的形状和尺寸与针的形状和尺寸相似，以使传感器容易地植入组织中。该传感器部件可以为针状的、微针状的、细长的、具有成角度的或弯曲的边缘或允许其插入患者皮肤的任何其他合适的结构或机械形式。在一实施方案中，尺寸为约5mm(l)
×
2.3mm(w)
×
0.85mm(h)。这些尺寸是非限制性的。
[0366]
细长主体部分用作继电器，以便容易地将电线连接到具有感测元件的尖端部分。细长主体部分的形状和尺寸可以根据用途而变化。细长主体部分与传感器部件之间的角度倾斜还便于更容易地将传感器植入组织中、从组织移除传感器和将传感器固定到组织上。尖端部分可以是锥形的以便于组织穿透。
[0367]
衬底用作第一传感器电极、第二传感器电极和参比电极的物理支撑。衬底还保护第一传感器电极、第二传感器电极和参比电极，提供电极尺寸、聚合物深度的一致性，并保持电极间距离。可以在所有相关部件之间建立电连接。
[0368]
可提供电流信号接收器/检测器，以及经配置为执行处理算法的处理器模块。输入是以安培和时间为单位的传感器输出。输出是组织衰竭风险评分和警报。
[0369]
在一种实施方式中，在传感器聚合物/酶层上提供了保护层(例如nafion、聚(乙二醇)(peg)、peg衍生的水凝胶、聚环氧乙烷、聚氨酯、仿生物、硅酮弹性体、多孔碳涂层)以保护其免受环境因素的影响。
[0370]
传感器的工作温度范围预期为室温至约45℃，最小可检测的代谢物水平变化低至0.2mm。
[0371]
酶的生物活性中心被厚蛋白层包围，并位于分子疏水腔深处。因此酶内的直接电化学或电子转移是困难的。因此，需要使用电连接器来增强酶和代谢物之间的电子传输。氧化还原聚合物或含酶聚合物可用作氧化还原中心，以介导从酶到电极的电子转移，这是由于其优点包括电子转移速率快、电流密度高、生物相容性好、化学稳定性好以及对微生物降解惰性。酶与电极的附着可以通过诸如吸附、包封、截留、共价结合、交联等方法实现。其中，化学交联提供良好的长期稳定性。将含酶聚合物组装到电极表面上。然后可以可选地将nafion层涂覆在感测层上以获得更长的稳定性。所得的传感器可以在体外和体内应用。通过恒电位仪测量葡萄糖和/或乳酸盐被其酶电氧化产生的电流。
[0372]
如上所述的传感器，其中含酶聚合物的厚度可以为约0.010-约0.200mm、约0.020-约0.200mm、约0.030-约0.200mm、约0.040-约0.200mm、约0.050-约0.200mm、约0.060-约0.200mm、约0.070-约0.200mm、约0.080-约0.200mm、约0.090-约0.200mm、约0.100-约0.200mm、约0.110-约0.200mm、约0.120-约0.200mm、约0.130-约0.200mm、约0.140-约0.200mm、约0.150-约0.200mm、约0.160-约0.200mm、约0.170-约0.200mm、约0.180-约0.200mm、约0.190-约0.200mm、约0.010-约0.020mm、约0.010-约0.030mm、约0.010-约0.040mm、约0.010-约0.050mm、约0.010-约0.060mm、约0.010-约0.070mm、约0.010-约0.080mm、约0.010-约0.090mm、约0.010-约0.100mm、约0.010-约0.110mm、约0.010-约0.120mm、约0.010-约0.130mm、约0.010-约0.140mm、约0.010-约0.150mm、约0.010-约0.160mm、约0.010-约0.170mm、约0.010-约0.180mm、约0.010-约0.190mm或优选为约0.125mm。
[0373]
在这方面，应当注意，本发明也可以涵盖实现该技术的化学作用的替代方法。换言之，允许装置的部件的按比例放大和生产的方法应该被认为与本技术相关。
[0374]
使用chi1040c恒电位仪(ch仪器，德克萨斯州奥斯汀)进行了体外电化学性能研究。记录传感器对0.3v下不同浓度代谢物(在pbs缓冲液中1mm-30mm)的电流响应。研究了代谢物的连续监测直至5.5天。
[0375]
在替代实施方案中，所述的电化学代谢物生物传感器可按以下方式进行工业制造：
[0376]
(1)通过铣削和线切割加工分别制造pc芯片(3层)和金箔。
[0377]
(2)粘结层1(pc 0.5mm)和层2(pc 0.25mm)。
[0378]
(3)丝网印刷ag迹线至粘结层2。在烘箱内于130℃下固化。
[0379]
(4)用mylar薄膜保护ag迹线。
[0380]
(5)将金迹线嵌入粘结层2。
[0381]
(6)除去mylar薄膜，粘结层3(0.1mm)。
[0382]
(7)用mylar薄膜保护金迹线。
[0383]
(8)将ag/cl丝网印刷到ag迹线上。
[0384]
(9)用注射泵以1ul/min的速度分配聚合物5秒钟。固化聚合物。
[0385]
(10)重复步骤9两次，直到聚合物厚度达到0.1mm。
[0386]
还应该考虑的是，替代的材料或化学组分可以用于具体的组分并且不限于以上提供的具体实例。
[0387]
在又一个实施方案中，掺入酶的膜可以能够放大信号并过滤不相关的分析物。
[0388]
电线将传感器连接到读取器/分析器。电线可以为将传感器连接到读取器/分析器的绝缘电线。对于掩埋组织的情况，电线可以跟随通常用于排出流体的排出套管。这些电线可用于将来自传感器的电信号传输到读取器。这些电信号由读取器读取和解释。在可选实施方案中，该连接可以为无线连接。在这样的实施方案中，可以通过诸如近场通信(nfc通信)的手段来替换导线，这使得整个装置成为无线的并因此在使用期间可能更方便。无线部件可以被嵌入细长主体部分中。
[0389]
读取器/分析器可以是用于收集、分析和比较对照传感器与组织传感器之间的电流读数(以安培为单位)的恒电位仪。以设定的间隔(例如，每隔15分钟)；读取器/分析器收集这些数据并评估趋势。例如，如果来自两个传感器的结果遵循相同的向上趋势，则读取器/分析器显示组织仍然是健康的。然而，如果来自组织传感器的读数明显偏离对照传感器，则算法计算组织衰竭的概率。如果检测到组织衰竭，则警告临床医师，因为可能需要手术干预。算法可以存在于读取器/分析器中。
[0390]
读取器/分析器可以包括三(3)个主要部分：读取器、执行分析算法的处理器以及警报系统。读取器可以为恒电位仪，该恒电位仪以安培为单位测量这些传感器的输出并绘制这些输出的曲线图。这些曲线图示出了随时间变化的安培数，并且可以被解释为在进行测量时组织的葡萄糖和乳酸盐的浓度水平。这样，可以在一个时间点收集四(4)个不同的读数：来自对照传感器的两(2)个读数和来自组织传感器的两(2)个读数。来自传感器的两个(2)读数对应于1)葡萄糖浓度水平和2)乳酸盐浓度水平。乳酸盐水平可以通过检测乳酸被其酶氧化时的电流来确定。用于组织存活力的检测算法可以基于葡萄糖和乳酸盐水平。
[0391]
然后使用算法分析随时间变化的安培的读数。算法可以将来自对照传感器的葡萄糖浓度水平与来自组织传感器的葡萄糖浓度水平进行比较，并且对乳酸盐浓度水平进行相同的比较。之后，可以评估来自两个传感器的葡萄糖和乳酸盐趋势。
[0392]
从下面提供的分析可以得出四(4)种可能的说明，尽管也可以考虑其他说明。还应当考虑到，可以使用替代性代谢物或化学组分，并且因此这些将提供读数的替代性说明，这些读数可以提供研究组织衰竭状况的参考。
[0393]
说明：
[0394]
(1)两个传感器的葡萄糖和乳酸盐浓度以相似的方式变化。
[0395]
(2)与来自对照值的葡萄糖浓度相比，来自组织的葡萄糖浓度下降至特定阈值以下，但是来自两个传感器的乳酸盐浓度仍然趋向于相同的方向。
[0396]
(3)与来自对照值的乳酸盐浓度相比，来自组织的乳酸盐浓度增加至特定阈值以上，但是来自两个传感器的葡萄糖浓度仍然趋向于相同的方向。
[0397]
(4)与来自对照值的葡萄糖浓度相比，来自组织的葡萄糖浓度下降至特定阈值以
下，且与来自对照值的乳酸盐浓度相比，来自组织的乳酸盐浓度增加至特定阈值以上。
[0398]
例如，在第一种情况下，组织的代谢物水平以与在对照传感器处感测的代谢物类似的方式增加和降低，因此该组织被认为是健康的。
[0399]
例如，在第二和第三种情况下，组织的葡萄糖或乳酸盐水平与健康或衰竭组织的自然状态或静息状态不一致。在这种情况下，可以针对葡萄糖和乳酸盐水平实施第二临界阈值。如果乳酸盐升高至该阈值以上或者如果葡萄糖下降至该阈值以下，则认为组织衰竭。
[0400]
例如，在第四种情况下，来自组织的葡萄糖水平与对照传感器处感测到的葡萄糖相比降低了太多，且乳酸水平升高了。因此认为该组织是衰竭的。
[0401]
以上仅是示例性的，并且可以设想其他情况或实例。
[0402]
不同的阈值可以基于组织的代谢物水平和对照代谢物水平之间的相对百分比差值。然而，其他类型的信息、特征或阈值差值也可以与本技术的工作相关，以便提供对患者的组织衰竭状况的洞察。其他类型的相关阈值将与能够提供患者的组织衰竭状况的细节的合适算法的对照值一致。因此，虽然差值可基于相对百分比差值，但替代情形也是可能的。
[0403]
读取器/分析器可以包括一个警报系统以警告临床团队患者的组织正在衰竭。如果达到一个或多个临界阈值，则可以根据提供组织衰竭效果的量化的合适算法来触发警报或替代的信令或通知系统。
[0404]
系统可以作为一种平台技术用于其他目的，例如监测移植器官(肾、肝、肺、心脏、面部、手和生殖器官)中的组织灌注状态。研究表明，分析物浓度如葡萄糖或乳酸盐的测量可以提高检测缺血早期症状的机会，从而改善了那些区域的患者护理。此外，研究还表明乳酸盐是监测危重病患者的重要方面。实际上，当这些患者处于早期恢复阶段时，可以通过了解他们的血乳酸盐水平来确定治疗选择。因此，可以针对这种需要实施监测系统。
[0405]
有利地，本发明的实施方案寻求更早和客观地检测出衰竭组织，提供对靶器官的直接监测，节省临床医生监测每个患者的时间，并且节省由并发症引起的费用。
[0406]
此外，除非上下文另外明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括(comprise、comprising)”等应被解释为包括性的，而不是排他性的或穷举性的；也就是说，意味着“包括但不限于(including,but not limited to)”。
附图说明
[0407]
附图示出了所公开的实施方案，并用于解释所公开的实施方案的原理。然而，应当理解，附图仅仅是为了说明的目的而设计的，而不是作为对本发明的限制的定义。
[0408]
图1
[0409]
[图1]示出了在氧化还原聚合物介导的传感器中发生的耦联氧化还原反应的示意图。
[0410]
图2
[0411]
[图2]示出了根据示例实施方案在泄流模式下操作的传感器的示意图。
[0412]
图3
[0413]
[图3]示出了根据示例实施方案在膨胀模式下操作的传感器的示意图。
[0414]
图4
[0415]
[图4]示出了根据示例实施方案在泄流模式下操作的传感器的示意图(放大等距
视图)。
[0416]
图5
[0417]
[图5]示出了根据示例实施方案在膨胀模式下操作的传感器的示意图(放大等距视图)。
[0418]
图6
[0419]
[图6]示出了根据示例实施方案在泄流模式下操作的传感器的示意图(放大侧视图)。
[0420]
图7
[0421]
[图7]示出了根据示例实施方案在膨胀模式下操作的传感器的示意图(放大侧视图)。
[0422]
图8
[0423]
[图8]示出了根据示例实施方案在泄流模式下操作的传感器的示意图(放大顶视图)。
[0424]
图9
[0425]
[图9]示出了根据示例实施方案在泄流模式下操作的传感器的示意图(放大底视图)。
[0426]
图10
[0427]
[图10a]示出了根据示例实施方案在泄流模式下操作的具有流体储存器的传感器的示意图(放大侧视图)。
[0428]
[图10b]示出了根据示例实施方案在膨胀模式下操作的具有流体储存器的传感器的示意图(放大侧视图)。
[0429]
图11
[0430]
[图11]示出了根据示例实施方案的传感器的示意图(放大分解等距视图)。
[0431]
图12
[0432]
[图12a]示出了根据示例实施方案的尖端部分的示意图(分解等距视图)。
[0433]
[图12b]示出了根据示例实施方案的尖端部分的示意图(等距视图)。
[0434]
图13
[0435]
[图13a]示出了根据示例实施方案在激活模式下操作的传感器的示意图。
[0436]
[图13b]示出了根据示例实施方案在激活模式下操作的传感器的示意图(放大等距视图)。
[0437]
[图13c]示出了根据示例实施方案在激活模式下操作的传感器的示意图(放大侧视图)。
[0438]
[图13d]示出了根据示例实施方案在暂停模式下操作的传感器的示意图(放大等距视图)。
[0439]
[图13e]示出了根据示例实施方案在暂停模式下操作的传感器的示意图(放大侧视图)。
[0440]
[图13f]示出了根据示例实施方案处于中间模式的传感器的示意图(放大等距视图)。
[0441]
[图13g]示出了根据示例实施方案处于中间模式的传感器的示意图(放大侧视
图)。
[0442]
图14
[0443]
[图14a]示出了根据示例实施方案的传感器的示意图(放大等距视图)。
[0444]
[图14b]示出了根据示例实施方案的传感器的示意图(放大顶视图)。
[0445]
[图14c]示出了根据示例实施方案的传感器的示意图(放大侧视图)。
[0446]
[图14d]示出了根据示例实施方案的传感器的示意图(放大后视图)。
[0447]
图15
[0448]
[图15]示出了用磷酸盐缓冲液稀释1mm葡萄糖后电流信号的变化。
[0449]
图16
[0450]
[图16]示出了在搅拌下将100μl的2mm乳酸盐连续添加到10ml磷酸盐缓冲液(pbs)中时电流信号的变化。
[0451]
图17
[0452]
[图17]示出了壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物的结构，其中壳聚糖-二茂铁基(chit-fc)氧化还原聚合物通过交联剂(1701)、戊二醛(ga)与支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(bpei-fc)中间体交联。
[0453]
图18
[0454]
[图18]示出了含酶聚合物，其中酶可以为葡萄糖氧化酶(1801)或乳酸氧化酶(1803)和交联剂(1805)。
[0455]
图19
[0456]
[图19]示出了壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物的伏安图，其中将工作电极上的电流相对于施加的电压(即，工作电极电位)作图，以得到循环伏安线扫图。
[0457]
图20
[0458]
[图20]示出了安培测量法曲线图(电流随时间的变化)，记录含酶聚合物(葡萄糖氧化酶)的电流随时间的变化，由此测试了对葡萄糖的灵敏度。壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物与葡萄糖氧化酶之间的体积比为3:1。
[0459]
图21
[0460]
[图21]示出了安培测量法曲线图(电流随时间的变化)，记录含酶聚合物(葡萄糖氧化酶)的电流随时间的变化，由此测试了对葡萄糖的灵敏度。壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物与葡萄糖氧化酶之间的体积比为3:2。
[0461]
图22
[0462]
[图22]示出了安培测量法曲线图(电流随时间的变化)，记录含酶聚合物(乳酸氧化酶)的电流随时间的变化，由此测试了对乳酸盐的灵敏度。壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物与乳酸氧化酶之间的体积比为3:1。
[0463]
图23
[0464]
[图23]示出了安培测量法曲线图(电流随时间的变化)，记录含酶聚合物(乳酸氧化酶)的电流随时间的变化，由此测试了对乳酸盐的灵敏度。壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物与乳酸氧化酶之间的体积比为3:2。
[0465]
图24
[0466]
[图24]示出了使用包被有含酶聚合物的传感器芯片进行葡萄糖和乳酸测量的动物(兔子)试验的一系列照片：图24a示出了如何从兔子身上挑起并移除皮瓣(2401)，图24b和图24c示出了供应到肌肉和皮肤的血管(2411和2421)的位置，图24d示出了用皮瓣(2431)包裹的传感器芯片(2433)，以及图24e示出了为了测试而被夹紧的血管(2441)。
[0467]
图25
[0468]
图25示出了安培测量法曲线图(电流随时间的变化)，记录600秒时夹紧(2503)皮瓣上的血管之前和之后，针对葡萄糖(2501)的动物试验的电流随时间的变化。
[0469]
图26
[0470]
图26示出了安培测量法曲线图(电流随时间的变化)，记录600秒时夹紧(2603)皮瓣上的血管之前和之后，针对乳酸盐(2601)的动物试验的电流随时间的变化。
[0471]
附图详细说明
[0472]
参考图2，图2示出了根据示例实施方案在泄流模式下操作的传感器的示意图。传感器200包括细长主体部分204和尖端部分202。细长主体部分204包括流体储存器206。传感器200还包括连接器208。连接器208包括用于连接到读取器、显示模块或监测器装置的接口。
[0473]
参考图3，图3示出了根据示例实施方案在膨胀模式下操作的传感器的示意图。与图2类似，传感器300包括细长主体部分304和尖端部分302。尖端部分302还包括可膨胀构件312。在流体储存器306和可膨胀构件312之间布置有通道以提供其间的流体连通。流体储存器306容纳不可压缩流体和无毒物质，例如盐水溶液。致动器310(在图3中示出为夹持机构)被配置为用于将流体储存器306中的一定量的流体通过通道递送至可膨胀构件312以便使可膨胀构件膨胀。比较图2和图3，在图3中可以看出，当致动器310布置在流体储存器306上方时，可膨胀构件312膨胀。致动器310提供压缩力以将不可压缩流体从流体储存器306通过通道移动至可膨胀构件312。
[0474]
参考图4，图4示出了根据示例实施方案在泄流模式下操作的传感器的示意图(放大等距视图)。与图2和图3类似，传感器400包括细长主体部分404和尖端部分402。尖端部分402包括被泄流的可膨胀构件412。
[0475]
参考图5，图5示出了根据示例实施方案在膨胀模式下操作的传感器的示意图(放大等距视图)。与图5类似，传感器500包括细长主体部分504和尖端部分502。尖端部分502包括被膨胀的可膨胀构件512。
[0476]
参考图6，图6示出了根据示例实施方案在泄流模式下操作的传感器的示意图(放大侧视图)。传感器600包括细长主体部分(由虚线区域604清楚地界定)和尖端部分(由虚线区域602清楚地界定)。尖端部分602包括被泄流的可膨胀构件612。细长主体部分604具有在中心延伸穿过该细长主体部分604的主体轴线604a。尖端部分602具有在中心延伸穿过该尖端部分602的尖端轴线602a。尖端部分邻近细长主体部分604并以主体轴线604a和尖端轴线602a之间的90
°-
170
°
钝角布置。更优选，主体轴线604a和尖端轴线602a之间的钝角为130
°-
160
°
。
[0477]
参考图7，图7示出了根据示例实施方案在泄流模式下操作的传感器的示意图(放大侧视图)。传感器700类似于传感器600，并且示出了被膨胀的可膨胀构件712。
[0478]
参考图8，图8示出了根据示例实施方案在泄流模式下操作的传感器的示意图(放
大顶视图)。与图2和图7类似，传感器800包括细长主体部分(由虚线区域804清楚地界定)和尖端部分(由虚线区域802清楚地界定)。尖端部分802包括被泄流的可膨胀构件812。
[0479]
参考图9，图9示出了根据示例实施方案在泄流模式下操作的传感器的示意图(放大底视图)。传感器的尖端部分902包括衬底(在图9中未清楚地看到)。第一传感器电极914、第二传感器电极916和参比电极918布置在衬底上。第一传感器电极914和第二传感器电极916可以包括金或碳。参比电极918可以包括银(ag)或氯化银(agcl)。
[0480]
参考图10a，图10a示出了根据示例实施方案在泄流模式下操作的具有流体储存器的传感器的示意图(放大侧视图)。与图3类似，传感器包括细长主体部分1004。在流体储存器1006和可膨胀构件(未示出)之间布置有通道1020以提供其间的流体连通。流体储存器1006容纳不可压缩流体和无毒物质，例如盐水溶液。传感器还包括连接器1008。连接器1008包括用于连接到读取器、显示模块或监测器装置(未示出)的接口。
[0481]
参考图10b，图10b示出了根据示例实施方案在膨胀模式下操作的具有流体储存器的传感器的示意图(放大侧视图)。与图10a类似，传感器包括细长主体部分1004。在流体储存器1006和可膨胀构件(未示出)之间布置有通道1020以提供其间的流体连通。流体储存器1006容纳不可压缩流体和无毒物质，例如盐水溶液。传感器还包括连接器1008。致动器1010(在图10b中示出为夹持机构)被配置为用于将流体储存器1006中的一定量的流体通过通道1020递送至可膨胀构件以便使该可膨胀构件膨胀。当致动器1010布置在流体储存器1006上方时，流体储存器1006(由弹性和柔性材料制成)被压缩。换言之，致动器1010提供压缩力以将不可压缩流体从流体储存器1006通过通道1020移动至可膨胀构件。
[0482]
参考图11，图11示出了根据示例实施方案的传感器的示意图(放大分解等距视图)。传感器包括与可膨胀构件1112流体连通的通道1120。传感器还包括可以由聚碳酸酯制成的传感器主体1126。可膨胀构件1112和一部分通道1120可以布置在传感器主体1126内部。柔性电子线缆膜(flexible electronics wire film)1128提供尖端部分处的电极与读取器或监测器装置之间的电连接。可以提供具有集成介电膜的电子线缆应变消除装置(electronic wiring strain relief)1124。还可以提供具有银迹线1122的银通孔以形成电极。这些电极可以被布置在形成于传感器主体1126中的凹槽内部。当在插入、固定或移除传感器主体期间而使线缆1128弯曲时，应力消除装置1124防止具有银迹线连接1122的银通孔的磨损和连接的丢失。当插入、固定或移除传感器时，电介质充当与导线1128的连接介质以及具有银迹线连接1122的银通孔与外部元件(例如血液或其他体液)的绝缘和保护介质。
[0483]
参考图12a，图12a示出了根据示例实施方案的尖端部分的示意图(分解等距视图)。衬底1230提供了物理支撑并保护传感器电极，提供了电极尺寸、聚合物深度的一致性并保持电极间距离。否则，传感器性能可能不一致，并且传感器可能由于环境暴露而快速降级。提供了银电极和迹线1232。提供了银通孔1234以实现金属接触。可以提供聚碳酸酯层1236。聚碳酸酯层1236的厚度可以为约0.5mm。此外，可以提供碳电极1238和/或金电极1240。最后，可以提供另一聚碳酸酯层1242。聚碳酸酯层1242的厚度可以为约0.125mm。
[0484]
返回参考图9，碳电极1238和/或金电极1240对应于第一传感器电极914和/或第二传感器电极916。银电极1232对应于参比电极918。
[0485]
第一感测层布置在第一传感器电极914上。第一感测层包括第一含酶聚合物，所述含酶聚合物为如本文所述的含酶聚合物。第二感测层布置在第二传感器电极916上。第二感
测层包括第二含酶聚合物，所述含酶聚合物为如本文所述的含酶聚合物。含酶聚合物的厚度为约0.010-约300mm。含酶聚合物可以沉积在聚碳酸酯层1242中切出的狭缝范围内的碳电极1238上方。
[0486]
参考图12b，图12b示出了根据示例实施方案的尖端部分的示意图(等距视图)。与图12a类似，提供了衬底1230。提供了银电极和迹线1232。可以提供第一下部聚碳酸酯层1236。可以提供碳电极1238。可以提供第一上部聚碳酸酯层1242。含酶聚合物可以沉积在第二上部聚碳酸酯层1242中切出的狭缝范围内的碳电极1238上方。
[0487]
参考图13a，图13a示出了根据示例实施方案在激活模式下操作的传感器的示意图。与图2类似，传感器1300包括细长主体部分1304和尖端部分1302。细长主体部分1304包括致动臂1306、线缆延伸件1320、偏置构件1349和固定销1350(图13c中示出)。致动臂1306可操作地联接到线缆延伸件1320，线缆延伸件1320又可操作地联接到偏置构件1349和固定销1350。尖端部分1302包括可移动构件1312和固定构件1348。固定构件1348包括如图9所示的第一传感器电极914、第二传感器电极916和参比电极918。与图2类似，传感器1300还包括连接器1308。连接器1308包括用于连接到读取器、显示模块或监测器装置的接口。
[0488]
参考图13b，图13b示出了根据示例实施方案在激活模式下操作的传感器的示意图(放大等距视图)。尖端部分1302包括固定构件1348和处于激活模式的可移动构件1312。
[0489]
参考图13c，图13c示出了根据示例实施方案在激活模式下操作的传感器的示意图(放大侧视图)。尖端部分1302包括固定构件1348和处于激活模式的可移动构件1312。细长主体部分1304包括致动臂1306(图13c中未示出)、线缆延伸件1320、处于激活模式的偏置构件1349和处于激活模式的固定销1350。
[0490]
参考图13d，图13d示出了根据示例实施方案在暂停模式下操作的传感器的示意图(放大等距视图)。尖端部分1302包括固定构件1348和处于暂停模式的可移动构件1312。
[0491]
参考图13e，图13e示出了根据示例实施方案在暂停模式下操作的传感器的示意图(放大侧视图)。尖端部分1302包括固定构件1348和处于暂停模式的可移动构件1312。细长主体部分1304包括致动臂1306(图13e中未示出)、线缆延伸件1320、处于暂停模式的偏置构件1349和处于暂停模式的固定销1350。
[0492]
参考图13f，图13f示出了根据示例实施方案处于中间模式的传感器的示意图(放大等距视图)。尖端部分1302包括固定构件1348和处于激活模式与暂停模式之间的中间模式中的可移动构件1312。
[0493]
参考图13g，图13g示出了根据示例实施方案处于中间模式的传感器的示意图(放大侧视图)。尖端部分1302包括固定构件1348和处于中间模式的可移动构件1312。细长主体部分1304包括致动臂1306(图13g中未示出)、线缆延伸件1320、处于中间模式的偏置构件1349和处于中间模式的固定销1350。
[0494]
在使用中，处于暂停模式中的传感器1300被放置在组织上，使得传感器1300的固定构件1348位于该组织内部且可移动构件1312位于患者体外。为了将传感器1300固定到患者，可移动构件1312被使用者物理地向下按压，使得可移动构件1312围绕枢轴1312a旋转到激活位置。参照图13c，在本实施方案中为弹簧形式的偏置构件1349在固定销1350上提供弹力，并使固定销1350在激活模式下充分延伸，从而通过限制可移动构件1312绕枢轴1312a旋转而将可移动构件1312固定在激活位置。
[0495]
为了将传感器1300从组织中移除，拉动致动臂1306以缩回缆线延伸件1320，这进而致使偏置构件1349压缩并且固定销1350沿着导轨滑动到暂停位置，这样使得当可移动构件1312被使用者物理地向上拉动时，可移动构件1312可以围绕枢轴1312a旋转到暂停位置。参考图13e，偏置构件1349在固定销1350上提供弹力并且使固定销1350在激活模式下在可移动构件1312上施加力(参见图13e中的箭头)，由此通过限制可移动构件1312围绕枢轴1312a旋转来将可移动构件1312固定在激活位置处。
[0496]
参考图14a，图14a示出了根据示例实施方案的传感器的示意图(放大等距视图)。与图2类似，传感器1400包括细长主体部分1404(在图14a中部分示出)和尖端部分1402。细长主体部分1404包括具有与主体轴线604a正交的轴线(如图6所示)的缝合通孔1403，这允许展开缝合线以将传感器1400固定到组织上。细长主体部分1404可包括具有缝合通孔1403的凸缘1460。优选地，缝合通孔1403的直径至少为0.3mm。与图2类似，传感器1400还包括连接器(图14a中未示出)。连接器包括用于连接到读取器、显示模块或监测器装置的接口。
[0497]
参考图14b，图14b示出了根据示例实施方案的传感器的示意图(放大顶视图)。
[0498]
参考图14c，图14c示出了根据示例实施方案的传感器的示意图(放大侧视图)。与图6类似，细长主体部分1404具有在中心延伸穿过细长主体部分1404的主体轴线。尖端部分1402具有在中心延伸穿过尖端部分1402的尖端轴线。尖端部分1402邻近细长主体部分1404并以主体轴线和尖端轴线之间的90
°-
170
°
钝角布置。更优选，主体轴线和尖端轴线之间的钝角为130
°-
160
°
。
[0499]
参考图14d，图14d示出了根据示例实施方案的传感器的示意图(放大后侧视图)。
[0500]
本发明的实施方案还可以包括布置在传感器的细长主体部分和/或尖端部分的下侧处的一个或多个生物相容性粘合剂层，使得生物相容性粘合剂层可以与组织接触以用于通过粘合剂装置将传感器固定到组织。
[0501]
本领域技术人员可以想到，上述一个或多个固定机构可以组合使用。例如，如图3所示的传感器300的可膨胀构件312可以与如图14a所示的传感器1400的缝合通孔1403结合使用，并且还可以与生物相容性粘合剂层结合使用。
[0502]
参考图15，图15示出了用磷酸盐缓冲液稀释1mm葡萄糖后电流信号的变化。当葡萄糖水平降低时，电流信号读数可能不同于原始电流信号读数。图15表明当葡萄糖水平降低时，电流信号读数可能相应地下降。将葡萄糖氧化酶和氧化还原聚合物与交联剂混合并沉积在传感器表面上。在测试期间，将传感器插入到葡萄糖溶液中，并且在酶和葡萄糖之间发生电化学反应。反应释放的电子在含酶聚合物和传感器表面之间移动，并通过恒电位仪转换为电流信号。当被pbs溶液稀释后葡萄糖浓度降低时，电流信号值也降低。对于体内应用，当组织衰竭时，葡萄糖水平将降低并且由组织传感器监测的电流信号值也将降低，而由对照传感器监测的电流信号值将保持不变。
[0503]
参考图16，图16示出了在搅拌下将100μl的2mm乳酸盐连续添加到10ml磷酸盐缓冲液(pbs)中时电流的变化。当乳酸盐水平增加时，电流信号读数可能不同于原始电流信号读数。图16表明当乳酸盐水平增加时，电流信号读数可能增加并保持在一定水平。将乳酸氧化酶和氧化还原聚合物与交联剂混合并沉积在传感器表面上。在测试期间，将传感器插入到乳酸盐溶液中，并且在酶和乳酸盐之间发生电化学反应。反应释放的电子在含酶聚合物和传感器表面之间移动，并通过恒电位仪转换为电流信号。当乳酸盐浓度增加时，电流信号值
也增加。对于体内应用，当组织衰竭时，乳酸盐水平将增加并且由组织传感器监测的电流信号值也将增加，而由对照传感器监测的电流信号值将保持不变。
[0504]
参考图17，图17示出了壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物的结构，其中壳聚糖-二茂铁基(chit-fc)氧化还原聚合物通过交联剂(1701)戊二醛(ga)与支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(bpei-fc)中间体交联。脱乙酰基单体单元(e1)和与支化聚乙烯亚胺-二茂铁基中间体(e2)交联的单体单元之间的比例可以为1:2、1:1和2:1。具有二茂铁基衍生物(d)的单体单元、脱乙酰化单体单元(e1)和与支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(e2)交联的单体单元将总计为壳聚糖(b)的总脱乙酰化单体单元。
[0505]
参考图18，图18示出了含酶聚合物，其中酶可以为葡萄糖氧化酶(1801)或乳酸氧化酶(1803)和交联剂(1805和1807)。具有酶(e1)的单体单元和与支化聚乙烯亚胺-二茂铁基中间体(e2)交联的单体单元之间的比例可以为1:2、1:1和2:1。具有二茂铁基衍生物(d)的单体单元、具有酶(e1)的单体单元和与支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(e2)交联的单体单元将总计为壳聚糖(b)的总脱乙酰化单体单元。
[0506]
参考图20，图20示出了安培测量法曲线图(电流随时间的变化)，记录含酶聚合物(葡萄糖氧化酶)的电流随时间的变化，由此测试了对葡萄糖的灵敏度。壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物与葡萄糖氧化酶之间的体积比为3:1，其中两种反应物通过交联剂交联。葡萄糖氧化酶在1 x pbs缓冲液中的浓度为20mg/ml。从0秒(2001)开始记录电流，在最初的120秒(2分钟)中，电流信号被视为基线，因为电解质溶液中没有代谢物与制剂(氧化还原共轭物和酶)反应。在最初的120秒后(2分钟)后，向pbs电解质溶液中加入葡萄糖，由此在每50秒或100秒后加入更多的葡萄糖。这种添加使得葡萄糖的量增加至0.5mm(2003)和1.0mm(2005)。随着葡萄糖的量增加至1.5mm(2007)、2.0mm(2009)和2.5mm(2011)，电流也随时间增加，直到葡萄糖的量为3.0mm(2013)，曲线图或电流变平至约3.1μa的恒定值。约5分钟后，为了模拟皮瓣衰竭，加入5ml的pbs溶液(2015)，由此葡萄糖浓度降低至1.8mm(2017)并且这是葡萄糖的终浓度。当葡萄糖浓度逐渐下降时，电流也随时间降低。
[0507]
参考图21，图21示出了安培测量法曲线图(电流随时间的变化)，记录含酶聚合物(葡萄糖氧化酶)的电流随时间的变化，由此测试了对葡萄糖的灵敏度。壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物与葡萄糖氧化酶之间的体积比为3:2，其中两种反应物通过交联剂交联。葡萄糖氧化酶在1 x pbs缓冲液中的浓度为20mg/ml。从0秒(2101)开始记录电流，在最初的120秒(2分钟)中，电流信号被视为基线，因为电解质溶液中没有代谢物与制剂(氧化还原共轭物和酶)反应。在最初的300秒后(5分钟)后，向pbs电解质溶液中加入葡萄糖，由此在每50秒或100秒后加入更多的葡萄糖。这种添加使得葡萄糖的量增加至0.2775mm(2103)和0.555mm(2105)。随着葡萄糖量增加到0.8325mm(2107)，电流也随时间增加，直到在2109添加pbs溶液以降低/稀释葡萄糖浓度。这是为了模拟皮瓣衰竭，并且实际上由于葡萄糖浓度的降低或稀释(2111)而使电流降低。
[0508]
参考图22，图22示出了安培测量法曲线图(电流随时间的变化)，记录含酶聚合物(乳酸氧化酶)的电流随时间的变化，由此测试了对乳酸盐的灵敏度。壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物与乳酸氧化酶之间的体积比为3:1，其中两种反应物通过交联剂交联。乳酸氧化酶在1 x pbs缓冲液中的浓度为20mg/ml。从0秒
(2201)开始记录电流，在最初的120秒(2分钟)中，电流信号被视为基线，因为电解质溶液中没有代谢物与制剂(氧化还原共轭物和酶)反应。在最初的120秒后(2分钟)后，向pbs电解质溶液中加入乳酸钠，由此在每50秒或100秒后加入更多的乳酸钠。这种添加使得乳酸盐的量增加至0.024mm(2203)和0.048mm(2205)。随着乳酸盐的量增加至0.072mm(2207)和0.192mm(2209)时，电流也随时间增加，直到曲线图或电流变平至约0.8μa的恒定值。约5分钟后，为了模拟皮瓣衰竭，在2211加入更多的乳酸钠，并且乳酸盐的浓度增加至0.216mm(2213)，并增加直至最终量为约0.336mm(2215)。当乳酸钠的浓度逐渐增加时，电流也随时间增加。
[0509]
参考图23，图23示出了安培测量法曲线图(电流随时间的变化)，记录含酶聚合物(乳酸氧化酶)的电流随时间的变化，由此测试了对乳酸盐的灵敏度。壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物与乳酸氧化酶之间的体积比为3:2，其中两种反应物通过交联剂交联。乳酸氧化酶在1 x pbs缓冲液中的浓度为20mg/ml。从0秒(2301)开始记录电流，在最初的120秒(2分钟)中，电流信号被视为基线，因为电解质中没有代谢物与制剂(氧化还原共轭物和酶)反应。在最初的600秒后(5分钟)后，向pbs电解质溶液中加入乳酸钠，由此在每50秒或100秒后加入更多的乳酸钠。这种添加使得乳酸盐的量增加至0.0892mm(2303)和0.1784mm(2305)。随着乳酸含量增加至0.2676mm(2307)、0.5354mm(2309)、0.58mm(2311)和0.6246mm(2313)，电流也随时间增加。为了模拟皮瓣衰竭，在2313年加入更多的乳酸钠，大约20分钟后，乳酸盐的浓度增加到0.94mm(2315)的最终浓度。当乳酸钠的浓度逐渐增加时，电流也随时间增加。
[0510]
参考图24，图24a示出了从兔子身上挑起的带有3cm
×
5cm皮岛的皮瓣(2401)。图24c示出了切开皮肤，并基于供给肌肉和皮肤的腹壁下血管(2411和2421)来使皮瓣成岛状。基于来自兔子每侧上腹壁下血管(2411和2421)的血液供给设计双侧皮瓣。图24d示出了被皮瓣(2431)包裹的、涂覆有含酶聚合物的传感器芯片(2433)。图24e示出了用于葡萄糖和乳酸盐测试的被夹紧的血管(2441)。
[0511]
参考图25，图25示出了安培测量法曲线图(电流随时间的变化)，记录在600秒时夹紧(2503)皮瓣上的血管之前和之后，针对葡萄糖的电流随时间的变化(2501)。电流从600秒时的约3.75μa(2503)显著下降到1100秒时的约2.25μa(2505)。
[0512]
参考图26，图26示出了安培测量法曲线图(电流随时间的变化)，记录在600秒时夹紧(2603)皮瓣上的血管之前和之后，针对乳酸盐的电流随时间的变化(2601)。在约800秒时，电流从约0.20μa(2605)开始增加到850秒时的约0.50μa(2607)。
[0513]
实施例
[0514]
通过参考具体实施例将进一步更详细地描述本发明的非限制性实施例，这些实施例不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
[0515]
所用的缩写列表
[0516]
ace：丙酮
[0517]
acoh：乙酸
[0518]
bpei：支化聚乙烯亚胺
[0519]
chcl3：氯仿
[0520]
chit：壳聚糖
[0521]
di：去离子水
[0522]
edc
·
hcl：n-乙基-n
’-
(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
[0523]
ether：乙醚
[0524]
et3n：三乙胺
[0525]
etoac：乙酸乙酯
[0526]
etoh：乙醇
[0527]
fccooh：二茂铁甲酸
[0528]
fccocl：氯甲酰基二茂铁或二茂铁甲酰氯
[0529]
ga：戊二醛
[0530]
h：小时
[0531]
hcl：盐酸
[0532]
ipa：异丙醇(2-丙醇)
[0533]
l：升
[0534]
me：甲基
[0535]
meoh：无水甲醇
[0536]
min：分钟
[0537]
naoh：氢氧化钠
[0538]
nhs：n-羟基琥珀酰亚胺
[0539]
k2co3：碳酸钾
[0540]
pbs：磷酸盐缓冲盐
[0541]
sec：秒
[0542]
材料和方法
[0543]
壳聚糖薄片(来自虾壳，至少75％脱乙酰)、葡萄糖氧化酶(ec 1.1.3.4，冻干粉，～200u/mg)和乳酸氧化酶(来自绿色气球菌)购自sigma-aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。支化聚乙烯亚胺、葡萄糖、乳酸钠和戊二醛获自sigma-aldrich。(6-溴己基)二茂铁、二茂铁甲酸、二茂铁甲酰氯和其他二茂铁基衍生物获自pichem(中国上海)。其他试剂包括乙酸、盐酸、碳酸钾、氢氧化钠、n-羟基琥珀酰亚胺、三乙胺和1n-乙基-n
’-
(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐也获自sigma-aldrich。溶剂包括氯仿、乙酸乙酯、丙酮、己烷、甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇和pbs缓冲溶液获自sigma-aldrich。除非另有说明，否则所有试剂和溶剂均为acs试剂级，按原样使用。pbs(1x)缓冲溶液稀释自10x pbs储备溶液，并将准备使用的缓冲溶液保存在4℃的冰箱中以避免细菌污染。当需要时，从主储备中取出5-20ml pbs(1x)缓冲液并转移至样品小瓶中使用。在葡萄糖和乳酸盐分析期间进行搅拌。
[0544]
代谢物(葡萄糖和乳酸盐)的灵敏度测试
[0545]
制备传感器芯片
[0546]
用去离子水(di)和乙醇(etoh)漂洗预清洁传感器芯片，并用氮气流干燥。含酶聚合物的前体与相应的酶(共轭物chit-fc/bpei-fc:gox和chit-fc/bpei-fc:lox)在浓缩溶液中制备。壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物与葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶的体积比为3:1，两种反应物通过交联剂交联。葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶在1x pbs缓冲液中的浓度为20mg/ml。壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物与葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶的的体积比还制备为3:2，其中两
种反应物用相同的交联剂交联。葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶在1x pbs缓冲液中的浓度也为20mg/ml。将制剂溶液小心地滴在dropsens芯片的工作电极上(即中心的圆盘)，然后在室温下干燥过夜，以在电极上形成薄膜薄层。
[0547]
测试装置(testing set-up)
[0548]
传感器芯片连接电缆通过铁支架固定，而另一端则连接恒电位仪。然后将传感器芯片(电极垫末端)与连接器电缆装配在一起，并且将工作电极末端浸入电解质溶液中。
[0549]
电流分析法中的i-t扫描中的时间对照和电压对照
[0550]
施加0.4v-0.6v的电压以激活氧化还原共轭物和酶之间的反应以产生电流信号。测试周期按需设定为15分钟-2小时。
[0551]
用于动物研究的材料和方法
[0552]
对于动物研究，所选择的物种为兔子，并且原种来自新西兰白兔，其中体重为3kg并且兔子的性别为雌性。将兔子饲养在新加坡singhealth实验医学中心的动物设施中。所有手术均在全身麻醉下进行。所有手术均在无菌条件下使用无菌手术器械进行。诱导抗生素和止痛药：给予恩诺沙星(皮下5mg/kg)和卡洛芬(5mg/kg bw)。所有手术均使用带温度探头的电热垫。从兔子身上挑起带有3cm
×
5cm的皮岛(skin paddle)的双侧腹直肌肌皮瓣。切开皮肤，并基于供给肌肉和皮肤的腹壁下血管来使皮瓣成岛状。基于兔子每侧上腹壁下血管的血液供给设计双侧皮瓣。被挑起的皮瓣是包含脂肪和皮肤组织的真皮(皮肤)皮瓣，而不是主要由肌肉组织组成的骨骼肌(肌肉)皮瓣。在这种情况下，与肌肉皮瓣相比，皮瓣在停止血液供给后显示的乳酸盐水平升高较不明显。
[0553]
实施例1
[0554]
合成己二茂铁基-壳聚糖氧化还原聚合物
[0555]
通过将1.0g壳聚糖薄片溶解于100ml的1.0％乙酸中并在室温下搅拌3小时直至完全溶解来制备1.0％壳聚糖(chi)溶液。不使用时将溶液保存在冰箱中。简而言之，将1mg的chi(≥75％脱乙酰化)加入到20ml的异丙醇4n氢氧化钠溶液中，并将混合物加热回流。用移液管将(6-溴己基)二茂铁缓慢加入聚合物溶液中。将混合物在氮气下加热回流4小时；减压除去溶剂。将残余物重复用乙醚(x 3)和甲醇(x 2)洗涤以除去残余杂质，然后真空干燥。然后将所得己基二茂铁基壳聚糖用去离子水透析3天。
[0556]
制备氧化还原聚合物-酶传感器
[0557]
氧化还原聚合物-葡萄糖氧化酶
[0558]
将合成的氧化还原聚合物溶解在hoac/oac-缓冲溶液(ph 5)中，直到聚合物溶液的最终浓度为10mg/ml。将10μl的10mg/ml氧化还原聚合物溶液、5μl的10mg/ml葡萄糖氧化酶(gox)和作为交联剂的1μl的1％戊二醛(ga)混合在一起，并置于传感器表面。然后使混合物固化12小时。最后，将另一层生物膜nafion涂覆到传感器表面作为保护层。
[0559]
氧化还原聚合物-乳酸氧化酶
[0560]
将合成的氧化还原聚合物溶解在hoac/oac-缓冲溶液(ph 5)中，直到聚合物溶液的最终浓度为10mg/ml。将10μl的10mg/ml氧化还原聚合物溶液、5μl的10mg/ml乳酸氧化酶(lox)和作为交联剂的1μl的1％戊二醛(ga)混合在一起，并置于传感器表面。然后使混合物固化12小时。最后，将另一层生物膜nafion涂覆到传感器表面作为保护层。
[0561]
氧化还原聚合物具有以下结构：
[0562][0563]
含酶聚合物具有以下结构：
[0564][0565]
实施例2
[0566]
步骤一：合成壳聚糖-二茂铁基(chit-fc)氧化还原聚合物(粗产物)
[0567]
fccooh以40％w/w的接枝率连接到chit：将chit
·
hcl溶解在去离子水中，将fccooh溶解在无水meoh中，并通过edc
·
hcl和nhs活化30分钟。
[0568]
然后将fccooh/edc
·
hcl/nhs混合物滴加到chit
·
hcl溶液中。将反应在惰性氮气下搅拌12小时。通过用0.1m氢氧化钠溶液(调节ph至10)中和，然后用去离子水和meoh洗涤数次得到chit-fc氧化还原聚合物。如方案1所示，将得到的沉淀干燥，然后溶于1wt％乙酸溶液(5mg/ml)。
[0569]
步骤二：合成支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(bpei-fc)中间体(粗产物)
[0570]
fccooh以40％w/w的接枝率连接到bpei：将bpei和fccocl分别溶于5％w/v的无水meoh中。
[0571]
将fccocl逐滴添加到bpei溶液中，并向反应混合物中添加几滴et3n。将反应在惰性氮气下搅拌12小时。通过在chcl3/己烷(1:4v/v)混合溶剂中沉淀获得bpei-fc中间体。将获得的沉淀用甲醇洗涤并再沉淀两次。如方案2所示，将再沉淀的沉淀物干燥，然后溶解在1 x pbs(35mg/ml)中。
[0572]
[0573][0574]
步骤三：合成壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物和含酶聚合物
[0575]
如图17所示，在8μl的ga溶液(25wt％水溶液，在1
×
pbs中稀释为5mg/ml)存在下，将16μl的bpei-fc(溶于1
×
pbs(35mg/ml)中)与120μl的chit-fc(溶于1％乙酸(5mg/ml)中)于室温下充分混合并搅拌2小时，得到chit-fc/bpei-fc共轭物。
[0576]
如图18所示，然后将chit-fc/bpei-fc共轭物分成两部分并与相应的酶(葡萄糖氧化酶和乳酸氧化酶)混合以产生含酶聚合物。
[0577]
实施例3
[0578]
代谢物(葡萄糖和乳酸钠)的灵敏度测试
[0579]
在传感器芯片用含酶聚合物(共轭物和相应的酶)的薄层涂覆并浸入pbs电解质溶液后，进行灵敏度测试。如上所述制备含酶聚合物薄层。还基于如上所述的方法制备pbs电解质溶液。
[0580]
对于葡萄糖测试，制备两种不同体积比的壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物和葡萄糖氧化酶。对于3:1的第一体积比，当时间为0秒时测量并记录电流，其中前120秒(2分钟)被认为是基线，因为在pbs电解质溶液中不存在代谢物与含酶聚合物的薄膜反应。在120秒时，向pbs电解质溶液中加入葡萄糖，随后每50秒或100秒增加葡萄糖浓度。如图20中所示，向电解质溶液中加入更多的葡萄糖直到电流变平至恒定值并且为了模拟皮瓣衰竭，通过用pbs电解质溶液(2015)稀释来降低葡萄糖的浓度。电流随着葡萄糖浓度降低至1.8mm而降低(2017)。如图21所示，当壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物与葡萄糖氧化酶之间的体积比变为3:2时，将聚合物也涂覆在芯片上并用于测试。同样地，前120秒或更长时间的电流被认为是基线。在前300秒(5分钟)之后，当将葡萄糖加入到电解质溶液中时，电流随着葡萄糖浓度增加而增加，直到图21的2109处，在此处加入更多的pbs电解质溶液后发生稀释。如图21的2111所示，一旦葡萄糖浓度降低，电流也降低。对葡萄糖的检测灵敏度低至每次改变该制剂0.28mm。
[0581]
对于乳酸盐测试，制备两种不同体积比的壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物和乳酸氧化酶。对于3:1的第一体积比，当时间为0秒时测量并记录电流，其中前120秒(2分钟)被认为是基线，因为在pbs电解质溶液中不存在代谢物与含酶聚合物的薄膜反应。在120秒时，向pbs电解质溶液中加入乳酸盐，随后每50秒或100秒增加乳酸盐浓度。在图22的2211处，向电解质溶液中加入更多的乳酸盐直到电流变平至恒定值并且为了模拟瓣衰竭，通过向pbs电解质溶液中加入更多的乳酸盐来进一步增加乳酸盐的浓度。当乳酸盐增加至0.336mm时(2215)，电流继续增加。如图23所示，当壳聚糖-二茂铁基/支化聚乙烯亚胺-二茂铁基(chit-fc/bpei-fc)共轭物与乳酸氧化酶之间的体积比变为3:2时，将聚合物也涂覆在芯片上并用于测试。同样地，前120秒的电流被认为是基线。在约600秒(5分钟)后，当将乳酸盐加入到电解质溶液中时，电流随着乳酸盐浓度的增加而增加，直到图23的最终浓度为0.94mm(2315)。对乳酸钠的检测灵敏度低至每次改变该制剂0.024mm。
[0582]
实施例4
[0583]
动物研究——使用涂覆有含酶聚合物的传感器芯片进行葡萄糖和乳酸盐测量
[0584]
在动物研究中使用兔子，基于如上所述的方法并如图24a-图24e所示制备皮瓣(2401)。为了测量皮瓣上的葡萄糖和乳酸水平，通过夹紧(2441)传感器芯片周围的区域切断皮瓣的血液供给(2411和2421)来模拟血管闭塞。传感器芯片用含酶聚合物薄层涂覆，并用皮瓣(2433)包裹。
[0585]
对于葡萄糖传感器芯片测试，使用标准电化学方法——电流分析法记录将夹具固定在皮瓣上后的电流变化。如图25所示，在用于葡萄糖分析的电流-时间(i-t)扫描(2501)中，从0秒开始记录电流，随后在600秒(2503)时夹紧血管。在皮瓣中的血管被夹紧后几乎立即观察到电流的显著下降。电流从600秒时的约3.75μa降低到1100秒(2505)时的约2.25μa。这个结果表明，一旦停止血液供给，样本中存在的葡萄糖的量将减少。
[0586]
对于乳酸盐传感器芯片测试，使用标准电化学方法——电流分析法记录将夹具固定在皮瓣上后的电流变化。如图26所示，在用于乳酸盐分析的电流-时间(i-t)扫描(2601)中，从0秒开始记录电流，随后在600秒(2603)时夹紧血管。在夹紧皮瓣中的血管之后，在约800秒时观察到电流增加。电流从800秒时的约0.18μa增加到850秒时的约0.50μa。电流响应
的延迟归因于血管被夹紧后皮瓣中乳酸的缓慢积累。由于皮瓣是主要包含脂肪和皮肤组织的皮肤皮瓣，所以乳酸盐水平的升高不太明显(即仅在800秒时电流增加)。
[0587]
工业实用性
[0588]
所公开的含酶聚合物可用于检测组织中代谢物的存在。所公开的含酶聚合物可用于传感器中以检测组织中代谢物的存在。在传感器中使用两种或多种不同的含酶聚合物的情况下，可以测量两种或多种代谢物的量，并且代谢物量之间的关系可表示组织是否健康或可能衰竭。因此，含酶聚合物以及相关的传感器(或装置)可用于临床环境以便于医生和/或护士对组织的监测。该传感器或装置甚至可以在组织被掩埋时使用。
[0589]
显然，在阅读了上述公开内容之后，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本发明的各种其他修改和变型对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且所有这些修改和变型都落入所附权利要求的范围内。

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