用于甘蓝黑腐病抗性筛选的PCR引物、试剂盒及其应用的制作方法

用于甘蓝黑腐病抗性筛选的pcr引物、试剂盒及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及分子育种技术，具体涉及一种辅助鉴定甘蓝黑腐病抗性的pcr引物、试剂盒及其应用。


背景技术：

[0002]
结球甘蓝(brassica oleracea var.capitata)简称甘蓝，是重要的十字花科芸薹属蔬菜之一，其适应性好、抗逆性强、易贮耐运、产量高，又具有较高的营养和保健价值，在我国乃至世界各地广泛栽培。目前，我国甘蓝年栽培面积约90万hm2，占世界甘蓝类蔬菜收获面积的1/3以上，在蔬菜周年供应和出口创汇中发挥重要作用。
[0003]
甘蓝黑腐病由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(xanthomonas campestris pv.campestris)引起，是危害甘蓝生产的三大主要病害之一。黑腐病主要症状为叶片呈“v”字型病斑，严重时叶脉变黑，甚至整株萎蔫、死亡。该病自1895年发现于美国后在世界各地主要甘蓝产区逐渐发现并加重，我国自20世纪50年代发现，至80年代已在全国普遍流行。近几年，由于栽培面积的增加及不合理栽培方式的影响(如高密度、连作等)，其危害程度日趋严重，极大地威胁着甘蓝类蔬菜的质量与产量。
[0004]
在病害防治上，种子消毒，药剂防治，合理轮作与间作等传统方法收效甚微，并不能从根本地上解决黑腐病对甘蓝类作物的为害，因此抗病品种的培育尤为重要。常规的抗病育种方法虽然发挥了重大作用，但主要通过杂交和多代自交，且抗病材料筛选和田间鉴定等过程较复杂，周期相对较长，易受环境条件影响，可靠性较差。因而本领域亟需开发出一种pcr引物及相关试剂盒用于辅助筛选含黑腐病抗性基因的甘蓝材料。


技术实现要素：

[0005]
根据本领域的上述需求，本发明提供一种用于甘蓝黑腐病抗性筛选的pcr引物，其特异性强，稳定性好，能够快速、有效、灵活地利用任一阶段的甘蓝植株筛选出含黑腐病抗性基因的甘蓝材料，用于育种。
[0006]
本发明请求保护的技术方案如下：
[0007]
用于筛选甘蓝(brassica oleracea var.capitata)黑腐病抗性材料的pcr引物，其核苷酸序列为：
[0008]
上游引物bobr8631-f：5`-gtcgaggctagaactaagtg-3
’
[0009]
下游引物bobr8631-r：5`-taaagacaacatacccggac-3
’
；
[0010]
所述pcr引物扩增的甘蓝黑腐病抗性材料特征条带大小为158bp，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0011]
用于筛选甘蓝黑腐病抗性材料的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的液体剂或粉剂pcr引物。
[0012]
所述试剂盒，还包括用于进行pcr和/或电泳所需的试剂。
[0013]
用于筛选甘蓝黑腐病抗性材料的方法，其特征在于，包括采用所述的pcr引物和/
或所述的试剂盒进行如下步骤：
[0014]
(1)以待测甘蓝样品为材料，提取样品的基因组dna；
[0015]
(2)采用所述pcr引物对待测甘蓝材料的基因组dna进行pcr；
[0016]
(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所述pcr产物；
[0017]
(3)从所述电泳检测结果中筛选出与所述甘蓝黑腐病抗性材料特征条带大小一致的材料；
[0018]
所述甘蓝黑腐病抗性材料特征条带为158bp，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0019]
所述pcr反应体系为：pcr反应总体积为10μl，其中上下游引物(10μmol/l)各0.5μl，2
×
3g taq master mix(诺唯赞生物)for page 5μl，模板dna(50ng/μl)1μl，ddh2o 3μl。
[0020]
所述pcr的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
[0021]
所述凝胶电泳检测指采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，于165v恒功率电泳分离60分钟，经固定、银染、显色后拍照。
[0022]
所述试剂盒的制备方法，其特征在于，在标有甘蓝黑腐病抗性筛选用途的包装盒内装有所述的pcr引物。
[0023]
所述标有甘蓝黑腐病抗性筛选用途的包装盒内还装有用于进行pcr和/或电泳所需的试剂。
[0024]
本发明根据抗病甘蓝材料“05-574”与感病甘蓝材料“02-359”重测序结果设计得到。首先使用smatools搜索重测序序列中的indel序列信息位点，然后选取indel差异3-20bp以上的序列为靶标序列，利用软件primer 6.0设计indel引物，从众多候选引物中筛选得到特异性引物。
[0025]
专业术语：
[0026]
重测序：对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
[0027]
indel：insertion-deletion，指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组统一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失。
[0028]
本发明所提供的pcr引物特异性强，稳定性好，在58℃退火温度下无非特异扩增，能高度准确地检测出待测甘蓝植株中是否具有黑腐病抗性位点。一般不同品种甘蓝材料的抗性需要接种鉴定才能确定，而采用本发明的引物bobr8631-f/bobr8631-r进行甘蓝黑腐病抗性辅助筛选，在幼苗期就能够快速筛选出目标株系。而接种鉴定需经过繁琐的接种过程，且易受环境条件等影响，可重复性差，结果不可靠。因此，采用本发明的pcr标记进行甘蓝抗黑腐病育种的辅助选择，可大大缩短育种周期，提高育种效率。
[0029]
本发明还提供一种用于甘蓝黑腐病抗性辅助筛选的方法，该方法操作简单易行，只需提取待测甘蓝基因组dna，采用引物bobr8631-f/bobr8631-r进行pcr反应，通过聚丙烯酰氨凝胶电泳检测pcr产物特征条带的长短，即可判断待测植株中是否具有黑腐病抗性。
[0030]
综上所述，利用本发明提供的pcr标记和引物进行甘蓝黑腐病抗性筛选，操作简单易行，特异性强，稳定性好，可大大缩短育种周期，提高育种效率。
附图说明
[0031]
图1.引物在“05-574”和“02-359”构建的f1、f2群体中部分扩增情况。
[0032]
图2.引物在甘蓝材料中的扩增情况，其中，m：dna ladder；1-11：“05-574”、“19br90-4”、“19br90-5”、“19br90-8”、“19br90-24”、“19br90-41”、“19br90-43”、“19br90-49”、“19br90-57”、“19br90-63”、“md”为抗黑腐病材料；12-28：“01-20”、“02-359”、“hb1180”、“中甘11”、“yr中甘21”、“中甘167”、“中甘628”、“sca026”、“0102”、“旺旺”、“bj1012”、“yc205”、“y650”、“xw796”、“吉宝”、“嘉宝”、“哥本哈根”为感黑腐病材料。
具体实施方式
[0033]
以下结合具体实施实例进一步阐述本发明，需要说明的是，实例仅用于解释
[0034]
本发明而不限制本发明的范围。
[0035]
本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，或采用本领域常规方法配制而得，可商购获得，规格为实验室纯级即可。
[0036]
生物材料
[0037]
抗病甘蓝“05-574”和感病甘蓝“02-359”为父母本构建获得的10株f1、107株f2；甘蓝材料“05-574”、“19br90-4”、“19br90-5”、“19br90-8”、“19br90-24”、“19br90-41”、“19br90-43”、“19br90-49”、“19br90-57”、“19br90-63”、“md”、“01-20”、“02-359”、“hb1180”、“中甘11”、“yr中甘21”、“中甘167”、“中甘628”、“sca026”、“0102”、“旺旺”、“bj1012”、“yc205”、“y650”、“xw796”、“吉宝”、“嘉宝”、“哥本哈根”。
[0038]
以上生物材料本实验室均有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验。
[0039]
实施例1、本发明所述分子标记及pcr引物
[0040]
引物开发过程：本发明所述引物是根据抗病甘蓝材料“05-574”与感病甘蓝材料“02-359”重测序结果设计得到。首先使用smatools搜索重测序序列中的indel序列信息位点，然后选取indel差异3-20bp以上的序列为靶标序列，利用软件primer 6.0设计indel引物。
[0041]
引物的主要参数是，引物长度18-26bp；退火温度tm值48℃-65℃；(g+c)含量30％-70％；pcr扩增产物长度100-300bp。
[0042]
并用oligo 6.65验证引物各项指标的适合度，是否存在引物二聚体、发卡结构。从中筛选出符合条件的引物序列并由苏州金唯智生物科技有限公司合成，然后使用抗病甘蓝“05-574”与感病甘蓝“02-359”自交系材料进行筛选，最终得到本发明所述引物。
[0043]
本实施例提供一种用于筛选甘蓝黑腐病抗性材料的pcr引物，具有如下的核苷酸序列：
[0044]
上游引物bobr8631-f：5`-gtcgaggctagaactaagtg-3
’
[0045]
下游引物bobr8631-r：5`-taaagacaacatacccggac-3
’
；
[0046]
上述pcr引物可以人工合成。
[0047]
所述pcr引物扩增的与甘蓝黑腐病抗性基因borbr1紧密连锁的分子标记特征条带大小为158bp，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0048]
实施例2、本发明所述试剂盒及制备
[0049]
本实施例提供一种用于筛选甘蓝黑腐病抗性材料的试剂盒，其包括实施例1所述的pcr引物。
[0050]
所述试剂盒还包括用于进行pcr和/或电泳所需的试剂。
[0051]
上述试剂盒的生产方法：在标有甘蓝黑腐病抗性筛选用途的包装盒内装有实施例1所述的pcr引物。
[0052]
所述标有甘蓝黑腐病抗性筛选用途的包装盒内还装有用于进行pcr和/或电泳所需的试剂。
[0053]
实施例3、引物bobr8631-f/bobr8631-r在“05-574”和“02-359”构建的f1、f2群体中的扩增情况
[0054]
1、提取基因组dna
[0055]
用ctab(十六烷基三乙基溴化铵，hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取甘蓝“05-574”和“02-359”构建获得的10株f1和107株f2群体基因组dna。dna提取方法参见murray mg,thompson wf(1980)rapid isolation of high molecular weight plant dna.nucleic acids res 8:4321-4325。
[0056]
2、引物bobr8631-f/bobr8631-r在“05-574”和“02-359”构建的f1和f2群体中的扩增情况
[0057]
为鉴定引物在已构建的f1和f2群体中的扩增情况，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成实施例1所述的引物，或采用实施例2所述的试剂盒，继续进行如下步骤：以步骤1得到的基因组dna为模板，按照下列反应体系和反应程序进行pcr反应。
[0058]
所述pcr反应体系为：pcr反应总体积为10μl，其中上下游引物(10μmol/l)各0.5μl，诺唯赞生物2
×
3g taq master mix for page 5μl，模板dna(50ng/μl)1μl，ddh2o 3μl。
[0059]
pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
[0060]
扩增产物采用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测，165v恒压60min，经固定、银染、显色后拍照。
[0061]
结果表明，将引物bobr8631-f/bobr8631-r用于甘蓝f1和f2材料扩增时，所有甘蓝样品均未发生非特异扩增，条带清晰，差异明显；扩增条带在f1单株为杂合条带；在f2群体扩增条带表现为三种类型：带型与“05-574”一致、带型与“02-359”一致、带型与f1一致，部分单株的pcr条带如图1所示。
[0062]
根据f2群体单株的病情指数调查结果，以病情指数小于30为抗病标准，则群体中抗病单株有26株。10株f1中，pcr扩增产物均为杂合条带；107株f2中，pcr扩增产物带型与“05-574”一致的单株为23株，这23株包含了所有的抗病单株。
[0063]
上述实验数据表明，本发明提供的引物bobr8631-f/bobr8631-r能够准确鉴定或筛选抗病甘蓝材料“05-574”和感病甘蓝材料“02-359”的杂交后代。
[0064]
实施例4、鉴定引物bobr8631-f/bobr8631-r验证甘蓝黑腐病抗性材料的准确性
[0065]
1、提取基因组dna
[0066]
用ctab(十六烷基三乙基溴化铵，hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法提取“05-574”、“19br90-4”、“19br90-5”、“19br90-8”、“19br90-24”、“19br90-41”、“19br90-43”、“19br90-49”、“19br90-57”、“19br90-63”、“md”、“01-20”、“02-359”、“hb1180”、“中甘
11”、“yr中甘21”、“中甘167”、“中甘628”、“sca026”、“0102”、“旺旺”、“bj1012”、“yc205”、“y650”、“xw796”、“吉宝”、“嘉宝”、“哥本哈根”甘蓝幼苗的基因组dna。
[0067]
dna提取方法参见murray mg,thompson wf(1980)rapid isolation of high molecular weight plant dna.nucleic acids res 8:4321-4325。
[0068]
2、鉴定引物bobr8631-f/bobr8631-r在甘蓝材料中的扩增情况
[0069]
为鉴定引物在甘蓝中的扩增情况，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成实施例1所述的引物，或采用实施例2所述的试剂盒，继续进行如下步骤：以步骤1得到的基因组dna为模板，按照下列反应体系和反应程序进行pcr反应。
[0070]
所述pcr反应体系为：pcr反应总体积为10μl，其中上下游引物(10μmol/l)各0.5μl，诺唯赞生物2
×
3g taq master mix for page 5μl，模板dna(50ng/μl)1μl，ddh2o 3μl。
[0071]
pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
[0072]
扩增产物采用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测，165v恒压60min，经固定、银染、显色后拍照。
[0073]
结果表明，将引物bobr8631-f/bobr8631-r用于甘蓝自交系材料扩增时，所有甘蓝样品均未发生非特异扩增(图2)，条带清晰，差异明显。
[0074]
按照上述方法进行标记辅助筛选，在28份材料中鉴定出11棵植株具有抗病带型，17份具有感病带型，其中2份材料与后期接种鉴定结果相悖，标记鉴定与表型鉴定吻合率达92.86％。
[0075]

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