OsMAPKK4基因在改良水稻抗病性中的应用的制作方法

2021-02-02 09:02:10|

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osmapkk4基因在改良水稻抗病性中的应用
技术领域
[0001]
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及osmapkk4基因的应用，所述的基因为水稻osmapkk4 基因，所述基因可用于增强广谱抗白叶枯病和细菌性条斑病水稻品种的培育。

背景技术：

[0002]
水稻中抗病基因主要可以分为主效抗病基因和抗病相关基因两大类，其中主效抗病基因也叫r基因，常常只对一种或少数几种病原菌致病小种具有抗性，如已经克隆的xa21,xa13,xa3/26,xa1/2/14等；主效抗病基因以外的抗病基因都被称为抗病相关基因，如oswrky45,oswrky13,osedr1,ospad4等。目前生产上应用比较多的是r基因，但r基因所介导的抗性除抗谱窄外，常常还不持久，且抗性容易丧失；相较于r 基因，抗病相关基因具有抗谱广，而且抗性不易丧失等优点。因此，挖掘水稻中抗病相关基因的资源，对于培育抗病新品种具有重要意义。
[0003][0004]
丝裂原活化蛋白激酶级联反应(mapk cascade)是真核生物中非常保守的信号传导方式，它可以将外界的生长发育或逆境胁迫信号通过mapkkk、mapkk和mapk三类保守的蛋白激酶逐级磷酸化的方式放大并传递到细胞内。水稻中主要有75个mapkkks，8个mapkks和17个mapks蛋白。经过多年的研究，水稻中mapk信号级联取得了一定进展，多个mapk信号级联中的蛋白被鉴定，参与调控水稻的免疫反应。如osedr1和osmpk6分别负调控和正调控水稻对白叶枯病菌的抗性；osmapkkk11/18和osmapkkk24 通过激活osmapkk4-osmapk6级联反应参与水稻对几丁质信号的识别和对稻瘟病菌的抗性； osmapkk3-osmapk7信号级联反应可以调控水稻对白叶枯病菌的抗性；osmapkk10-2-osmapk6信号级联可以响应水杨酸的信号，调控水稻对细菌性条斑病的抗性。
[0005]
本发明发现超量表达水稻中的osmapkk4基因可以增强水稻对白叶枯病和细菌性条斑病的抗性，对于改良水稻对白叶枯病和细菌性条斑病的抗性，培育抗病新品种方面具有重要的意义。

技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，通过对osmapkk4基因的生物学功能的研究，发现osmapkk4基因在水稻抗白叶枯病和细菌性条斑病上具有重要调控作用，通过调节该基因表达水平，从而影响水稻对白叶枯病和细菌性条斑病的广谱抗病性。因此，本发明对于重要粮食作物水稻在抗白叶枯病和细菌性条斑病的改良上具有重要的意义。
[0007]
本发明的技术方案如下所述：
[0008]
本发明证实在水稻中超量表达osmapkk4基因可以增强水稻对多种白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的抗性。通过系统研究，申请人发现osmapkk4基因在水稻抗白叶枯病和细菌性条斑病方面有着重要调控功能。
[0009]
经过生物学功能验证证明本发明所提供的水稻osmapkk4基因具有以下特性：
[0010]
1、osmapkk4基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
[0011]
seq id no:1所示的核苷酸序列由水稻osmapkk4基因及其上下游非编码序列共1880个脱氧核糖核苷酸组成。seq id no:1所示序列中第1位至107位的脱氧核糖核苷酸为osmapkk4基因的上游非编码序列；第108位至1217位的脱氧核糖核苷酸为osmapkk4基因的外显子序列；第1218位至1880位的脱氧核糖核苷酸为osmapkk4基因的下游非编码序列。
[0012]
2、本发明的osmapkk4基因序列可用于在作物，特别是水稻的抗病育种、转基因株系和基因新品种中的应用。
[0013]
更详细的技术方案参见《具体实施方式》。
[0014]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0015]
osmapkk4基因正向调控水稻对白叶枯病和细菌性条斑病的广谱抗病性。
附图说明
[0016]
图1：本发明鉴定和分离克隆水稻osmapkk4基因以及验证osmapkk4基因功能的技术流程图。
[0017]
图2：用定量反转录-pcr(quantitative reverse transcription-pcr，qrt-pcr)技术检测水稻品种中花11 和mkbzh1(中花11背景下含有主效抗病基因xa26)分别接种白叶枯病菌pxo61后，osmapkk4基因的表达模式；同时用qrt-pcr技术检测茉莉酸处理后的水稻品种中花11中osmapkk4基因的表达模式。附图标记说明：图2中的a图表示水稻品种中花11和mkbzh1接种白叶枯病原菌后不同时间点osmapkk4基因的表达量水平；图2中的b图表示茉莉酸处理后的水稻品种中花11中osmapkk4基因的表达量水平。每个样品中 osmapkk4基因的表达量是相对于处理前水稻中花11样品中osmapkk4基因的表达量。每个数据是平均值 (3个重复)
±
标准差。
[0018]
图3：本发明所用遗传转化载体pu1301-osmapkk4的载体图谱。附图标记说明：rb和lb分别表示 t-dna的右边界和左边界，gus表示β-葡糖苷酸酶基因，hpt表示潮霉素磷酸转移酶基因，pubi表示玉米泛素基因启动子,tevl表示烟草蚀刻病毒翻译前导肽序列，nos表示胭脂碱合成酶基因的多聚腺苷酸化信号。
[0019]
图4：osmapkk4基因超量表达水稻株系中osmapkk4基因表达量鉴定。附图标记说明：图4中的a图表示qrt-pcr显示osmapkk4基因超量表达水稻家系35阳性单株的表达量明显高于野生型和分离出的阴性；图4中的b图表示qrt-pcr显示osmapkk4基因超量表达水稻家系66阳性单株的表达量明显高于野生型和分离出的阴性。
[0020]
图5：osmapkk4基因超量表达水稻株系接种白叶枯病菌pxo347后的病斑面积。附图标记说明：图5 中的a图表示osmapkk4基因超量表达家系35接种白叶枯病菌pxo347后的发病病斑面积与野生型植株和转基因阴性植株相比显著性变小；图5中的b图表示osmapkk4基因超量表达家系66接种白叶枯病菌 pxo347后的发病病斑面积与野生型植株和转基因阴性植株相比显著性变小。
[0021]
图6：osmapkk4基因超量表达水稻株系相对于野生型对不同白叶枯病菌(pxo71、pxo341、pxo347、 zhe173、t1和gd1358)具有广谱抗病性。
[0022]
图7：相对于野生型，osmapkk4基因超量表达水稻株系增强了对细菌性条斑菌rh3
的抗性。
[0023]
图8：osmapkk4基因超量表达水稻株系接种白叶枯病菌pxo341后叶片中白叶枯病菌生长量。相对于野生型对照，osmapkk4基因超量表达水稻株系中白叶枯病菌数量显著降低。
[0024]
图9：osmapkk4基因超量表达水稻株系接种细菌性条斑病菌rh3后叶片中细菌性条斑病菌生长量。相对于野生型对照，osmapkk4基因超量表达水稻株系中细菌性条斑病菌数量显著降低。
具体实施方式
[0025]
对序列表的说明：
[0026]
序列表seq id no:1是osmapkk4基因的核苷酸序列，序列长度为1880bp。
[0027]
下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。图1描述了鉴定和分离克隆osmapkk4基因以及验证 osmapkk4基因功能的流程。需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不能以任何方式构成对本发明权利要求范围的限制。
[0028]
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参考：《molecular cloning:alaboratory manual》(sambrook，j.，russell,david w.，molecular cloning:a laboratory manual，3rd edition， 2001，ny，cold spring harbor)或相关产品。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场采购的常规产品。
[0029]
实施例1：分析白叶枯病菌和茉莉酸处理水稻后osmapkk4基因的表达模式
[0030]
为了验证osmapkk4基因是否参与调控水稻的抗病反应。申请人对孕穗期水稻品种中花11(或称zh11, 来源中国农业科学院作物科学研究所用于科研的模型品种)和mkbzh1(水稻品种中花11背景下含有主效抗病基因xa26的一种材料，由华中农业大学王石平教授课题组惠赠，一种科研交流材料)分别接种白叶枯病菌，同时对分蘖期的水稻品种中花11用茉莉酸处理，然后采用qrt-pcr技术分析osmapkk4基因的表达模式。结果显示osmapkk4基因都能被白叶枯病菌和茉莉酸诱导表达。这一结果提示：osmapkk4基因可能参与调控水稻对白叶枯病菌的防卫反应，超量表达osmapkk4基因可能会提高水稻的抗病性。结果见图 2。
[0031]
实施例2：osmapkk4基因超量表达材料的获得
[0032]
(1)osmapkk4基因超量表达载体的构建
[0033]
本实施例是关于pu1301-osmapkk4载体构建的一个通用说明。
[0034]
以水稻品种中花11的cdna为模板，设计引物kk4-f-kpni(5
’-ꢀ
ggggtaccatgcgaccgggcgggcc-3
’
)和kk4-r-kpni(5
’-ꢀ
ggggtacctcatgacggaggcggtgcga-3
’
)，利用高保真dna聚合酶pcr扩增得到osmapkk4基因的全长cdna片段(seq id no:1所示序列中第108位至1217位脱氧核糖核苷酸，共计1110个脱氧核糖核苷酸)。电泳回收pcr产物，用限制性内切酶kpni酶切pcr产物，电泳回收酶切产物，同时将载体pu1301用 kpni酶切过夜并回收。将回收的酶切产物与载体片段以摩尔比约3：1的量进行连接(t4 ligase) 过夜。第二天将连接产物转化大肠杆菌dh5α，并于37℃培养过夜，可获得单克隆。选取单克隆在3ml含卡那霉素抗生素的lb培养基中过夜培养，第二天提取质粒，然后酶切
质粒，对切出外源片段的单克隆进一步测序验证。从而获得植物转化载体(pu1301-osmapkk4)。植物转化载体pu1301-osmapkk4的图谱见图3。
[0035]
(2)osmapkk4基因超量表达水稻株系的获得及其鉴定
[0036]
将含有强启动子p
ubi
驱动osmapkk4基因全长cdna的pu1301-osmapkk4载体通过农杆菌介导的遗传转化方法导入水稻品种中花11，获得了多个独立的转基因家系，选取家系35和家系66，利用qrt-pcr技术来检测osmapkk4基因的表达水平。
[0037]
从中国，湖北，武汉大田取孕穗期的水稻剑叶叶片，根据transzol(北京全式金生物技术有限公司) 使用说明书抽提rna。取5μg总rna用dnasei(美国invitrogen公司)处理15分钟以去除基因组dna污染，然后使用oligo(dt)
15
寡聚引物和m-mlv反转录酶(美国promega公司)进行反转录。采用实时定量pcr分析试剂盒 pcr master mix(大连tokara公司)，并根据试剂盒使用说明书，在abi 7500 real-time pcr system(美国applied biosystems公司)仪器上进行实时定量pcr反应。用水稻内源肌动蛋白基因的表达量衡量、并均一化样品rna含量。qrt-pcr分析中osmapkk4基因特异pcr引物是 osmapkk4-real-f(5
′-
gcttcggcctgagcattct-3
′
)和osmapkk4-real-r(5
′ꢀ-
agcaaatcgcgcacatgag-3
′
)，肌动蛋白基因pcr引物是actin-f(5
′ꢀ-
tgctatgtacgtcgccatccag-3
′
)和actin-r(5
′-
aatgagtaaccacgctccgtca-3
′
)。
[0038]
qrt-pcr结果显示，转基因家系中阳性单株中osmapkk4基因的表达水平显著高于阴性单株和野生型对照中的表达水平，结果见图4。
[0039]
实施例3：osmapkk4基因超量表达水稻株系的相关分析与功能验证
[0040]
(1)osmapkk4基因超量表达水稻株系孕穗期抗白叶枯病表型分析
[0041]
在中国，湖北，武汉的夏季田间对osmapkk4基因超量表达水稻株系及野生型对照进行白叶枯病菌接种实验。结果显示，本发明的osmapkk4基因超量表达水稻株系在孕穗期接种白叶枯病菌致病小种 pxo347，与野生型(非转基因的中花11，下同)相比，osmapkk4基因超量表达水稻家系35和家系66阳性单株发病病斑面积均显著性小于阴性单株和野生型对照(p<0.01)。见图5。以上结果表明，osmapkk4 基因超量表达水稻株系增强了水稻对白叶枯病菌致病小种pxo347的抗性。
[0042]
(2)osmapkk4基因超量表达水稻株系对不同白叶枯病菌的广谱抗性分析
[0043]
在中国，湖北，武汉夏季田间对osmapkk4基因超量表达水稻株系及野生型对照进行白叶枯病菌接种试验。结果显示，osmapkk4基因超量表达水稻株系在孕穗期接种不同白叶枯病菌致病小种(pxo71、 pxo341、pxo347、zhe173、t1和gd1358，所有白叶枯病菌由国际水稻研究所赠送)，与野生型相比， osmapkk4基因超量表达水稻家系35和家系66阳性单株发病病斑面积均显著性变小(p<0.01)，见图6。以上结果表明，超量表达osmapkk4基因增强了水稻对不同白叶枯病菌的广谱抗病性。
[0044]
(3)osmapkk4基因超量表达水稻株系分蘖期抗细菌性条斑病表型分析
[0045]
在中国，湖北，武汉冬季温室对osmapkk4基因超量表达水稻株系及野生型对照进行细菌性条斑病菌接种实验。结果显示，osmapkk4基因超量表达水稻株系在分蘖期接种细菌性条斑病菌致病小种rh3(由上海交通大学陈功友教授赠送)，与野生型相比，osmapkk4基因超量表达水稻家系35和家系66阳性单株发病长度均显著性变短(p<0.01)。见图7。以上结果表明，超量表达osmapkk4基因增强了水稻对细菌性条斑病菌的抗病性。
[0046]
(4)osmapkk4基因超量表达水稻株系中白叶枯病菌数量分析
[0047]
在中国，湖北，武汉夏季田间对osmapkk4基因超量表达水稻株系在孕穗期接种白叶枯病菌致病小种 pxo341后分析叶片中白叶枯病菌生长情况。在孕穗期于田间对osmapkk4基因超量表达水稻株系和野生型对照分别接种白叶枯病菌致病小种pxo341(由国际水稻研究所赠送)，接种后在不同时间取叶片材料 (接种剪口下3cm的叶片)，同一份材料取三片叶(代表三个实验重复)。根据已报道的方法处理叶片材料，分析细菌的生长数量。主要分析步骤如下：用75％酒精消毒叶片表面1分钟，晾干，置于研钵中加1ml 灭菌蒸馏水研磨成匀浆，然后加倍灭菌水稀释成不同浓度梯度，每个浓度梯度重复涂三个psa培养皿(马铃薯200g，琼脂20g，蔗糖20g，去离子水定容至1000ul)，22～25℃黑暗下生长2-3天后统计细菌菌落数。以每片叶上白叶枯病菌菌落数的log值绘制细菌生长曲线。白叶枯病菌生长分析表明，在接种白叶枯病菌致病小种pxo341后，osmapkk4基因超量表达水稻株系叶片中白叶枯病菌数量显著低于野生型对照。见图8。
[0048]
(5)osmapkk4基因超量表达水稻株系中细菌性条斑病菌数量分析
[0049]
在中国，湖北，武汉冬季温室对osmapkk4基因超量表达水稻株系在分蘖期接种细菌性条斑病菌致病小种rh3(由上海交通大学陈功友教授赠送)后分析叶片中细菌性条斑病菌生长情况。在分蘖期于温室对 osmapkk4基因超量表达水稻株系和野生型对照分别接种细菌性条斑病菌致病小种rh3，接种后在不同时间取叶片材料(接种部位上下3cm的叶片)，同一份材料取三片叶(代表三个实验重复)。根据已报道的方法处理叶片材料，分析细菌的生长数量。主要分析步骤如下：用75％酒精消毒叶片表面1分钟，晾干，置于研钵中加1ml灭菌蒸馏水研磨成匀浆，然后加倍灭菌水稀释成不同浓度梯队；根据已报道的方法处理叶片材料，分析细菌性条斑病菌的生长数量。主要分析步骤如下：用75％酒精消毒叶片表面1分钟，晾干，置于研钵中加1ml灭菌蒸馏水研磨成匀浆，然后加倍灭菌水稀释成不同浓度梯队，每个浓度梯度重复涂三个 psa培养皿，在22～25c黑暗下生长2-3天后统计细菌性条斑病菌菌落数。以每片叶上细菌菌落数的log值绘制细菌生长曲线。细菌性条斑病菌生长分析表明，在接种细菌性条斑病菌致病小种rh3后，osmapkk4 基因超量表达水稻株系叶片中细菌性条斑病菌数量显著低于野生型对照(见图9)。

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