二苯并[a,c]吩嗪类荧光探针及其在检测苯硫酚中的应用的制作方法

[0001]
本发明属于分析技术领域，具体地说，涉及分子荧光探针的设计合成以及对于苯硫酚化合物的识别与响应。该探针分子可以用于实验条件下对苯硫酚化合物的识别，并且可以在不同来源水样中检测低浓度条件下的苯硫酚化合物，具有实际的应用价值。


背景技术：

[0002]
苯硫酚是一种有窒息性气味的高毒性无色液体，在医药、农药、化工及高分子材料等领域有着广泛的应用，如制取医用药剂，农药，工业添加剂等。在自然界中，剧毒性的苯硫酚危害着水生生物和动物的生存环境。苯硫酚对鱼类的半致死浓度(lc
50
)范围为0.01～0.4mm，对小鼠的半致死剂量(ld
50
)为46.2mg/kg.因此苯硫酚已被美国环境保护局列入最重要的污染物类别(epa waste code p014)中。
[0003]
苯硫酚类化合物的结构通式为(其中r基团可为烷基，氨基，甲氧基，氟，氯等基团)：
[0004][0005]
我国水域生态系统复杂，蕴藏了非常庞大数量的淡水和海洋资源。沿海地区经济发展较快，在发展中也产生了大量的工业和环境的污水，有大量的污水未经处理或者经过简易的处理就排入到河流和海洋之中，严重的污染了水体及生物资源。因此设计得到一种专一性可检测苯硫酚化合物的分子探针具有实际的应用价值。
[0006]
有机荧光染料因其容易获得，价格低廉，多功能性等优点，在荧光检测中是最常用的。本发明涉及“关-开”型二苯并[a,c]吩嗪类荧光探针probe-dp1的设计合成，在实验条件下以及在实际水样中对低浓度苯硫酚的识别检测。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于设计合成得到一种“关-开”型二苯并[a,c]吩嗪类荧光探针probe-dp1并应用于水样中苯硫酚化合物的识别与检测；
[0008]
本发明所得到的“关-开”型二苯并[a,c]吩嗪类荧光探针probe-dp1是化学合成所得，其化学结构式如下：
[0009][0010]
所述荧光探针由11-氨基二苯并[a,c]吩嗪通过其11位的氨基与2，4-二硝基苯磺酰基键联而成，
(0.025g/l),(9)nano3(0.11g/l),(10)na2sio3(0.15g/l),(11)kbr(0.695g/l),(12)kcl(0.695g/l),(13)glu(5μm),(14)asp(5μm),(15)asn(5μm),(16)ser(5μm),(17)his(5μm),(18)gly(5μm),(19)thr(5μm),(20)arg(5μm),(21)ala(5μm),(22)tyr(5μm),(23)val(5μm),(24)try(5μm),(25)met(5μm),(26)ile(5μm),(27)leu(5μm),(28)lys(5μm),(29)空白.每个数据在dmso/pbs buffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液中测得。37℃培养30min后，记录数据变化。激发波长为450nm，发射波长为570nm.
[0022]
图5为探针分子probe-dp1在不同水样中的荧光强度随4-甲氧基苯硫酚的浓度变化线性响应曲线。(a)在不同水样中测得探针分子probe-dp1的荧光强度随4-甲氧基苯硫酚(0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,15.0,20.0μm)的浓度变化；(b)自来水样；(c)水库水样；(d)海水样.每个数据在dmso/pbs buffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液中测得。37℃培养30min后，记录数据变化。激发波长为450nm，发射波长为570nm.
具体实施方式：
[0023]
实施例1探针分子probe-dp1的设计合成
[0024]
冰浴下，往11-氨基二苯并[a,c]吩嗪(0.2mmol)的吡啶(10ml)溶液中滴加2,4-二硝基苯磺酰氯(0.3mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液；室温搅拌过夜，抽干溶剂，硅胶柱层析，用石油醚：氯仿(v:v＝1:3)洗脱，减压蒸干溶剂后得到黄色粉末状固体。产率为：45％.probe-dp1:1h nmr(500mhz,dmso)δ9.21(d,j＝8.2hz,1h),9.18(d,j＝8.2hz,1h),8.92(d,j＝2.1hz,1h),8.77(d,j＝7.2hz,2h),8.60(dd,j＝8.8,2.1hz,1h),8.40(d,j＝8.8hz,1h),8.31(d,j＝9.1hz,1h),7.95(d,j＝2.1hz,1h),7.88(d,j＝8.1hz,1h),7.85(d,j＝8.1hz,1h),7.79(m,3h),5.74(s,1h)ppm；
13
c nmr(126mhz,dmso)δ150.73,148.36,142.62,142.24,141.45,139.43,136.36,132.13,132.04,131.78,131.51,131.20,129.74,129.53,128.77,128.74,128.03,126.18,125.84,125.05,124.10,121.05,116.18ppm.hrms(esi)m/z calcd for c
26
h
16
n5o6s([m+h]):526.0816,found 526.0810.
[0025]
注：11-氨基二苯并[a,c]吩嗪由实验室自己合成并通过核磁及质谱确认结构。
[0026]
实施例2探针分子probe-dp1的光谱性质
[0027]
实验方法为：将实施例1得到的探针分子probe-dp1溶解于二甲亚砜中得到5mm的探针母液，4℃保存。实验测定中用dmso/pbs buffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成5μm的标准溶液。4-甲氧基苯硫酚溶解于dmso溶剂中，配成5mm的母液，4℃保存，实验测定中用dmso/pbs buffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成0-50μm的标准溶液，设定每2.5μm为一个浓度梯度。向96孔黑板中加入100μl的探针溶液与不同浓度苯硫酚待测液混合摇匀，37℃培养静置30min后测定其光谱，结果如图1与图2所示：probe-dp1溶液中加入苯硫酚，其荧光强度增强了50倍。荧光强度随苯硫酚的浓度的增加而增大，当苯硫酚的浓度为50μμ时，增加到最大值并保持稳定。苯硫酚的浓度为0-20μμ时，荧光强度与苯硫酚的浓度呈现出良好的线性关系(r2＝0.99545),检测下限为：0.040μμ.如图2所示在苯硫酚的浓度为0-50μμ之间，probe-dp1的荧光强度与硫酚的浓度响应曲线的r2＝0.9998.
[0028]
苯硫酚的浓度为0-20μμ,荧光强度与浓度的线性响应公式为:
[0029]
y＝136.17
×
x+89.19
[0030]
苯硫酚的浓度为0-50μμ，荧光强度与浓度的线性响应公式为:
[0031]
v＝-1.3705
×
x2+156.64
×
x+75.491注：dmso/pbs buffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液是二甲亚砜与磷酸盐缓冲液(pbs buffer)的等体积混合液，磷酸盐缓冲液的浓度为20mm,检测时混合溶剂的ph为7.4。
[0032]
实施例3探针分子probe-dp1的选择性实验
[0033]
实验方法为：将实施例1得到的探针分子probe-dp1溶解于dmso中得到5mm的探针母液，4℃保存。实验测定中用dmso/pbs buffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成5μm的标准溶液。4-甲氧基苯硫酚，4-氟苯硫酚，4-甲基苯硫酚溶解于dmso溶剂中，配成2.5mm的母液，4℃保存，实验测定中用dmso/pbs buffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成50μm的标准溶液。氨基酸如：gsh,cys,hcy,ala,gly,thr和ser等；一般干扰物质如：ph-nh2,ph-oh,nash和c2h5sh；常见无机盐如：ki,nahso3,sncl2,fecl3,cuso4,pb(aco)2,cui,cacl2,nacl,mgso4,feso4等溶于去离子水中，配置成5mm的母液，4℃保存，实验测定中用dmso/pbs buffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成100μm的标准溶液。向96孔黑板中分别加入100μl的探针溶液与100μl分析物，37℃培养静置30min后测定其光谱，结果如图3所示：探针对其他分析物几乎无响应，对4-甲氧基苯硫酚，4-氟苯硫酚，4-甲基苯硫酚等苯硫酚类化合物具有选择专一性，可适用于对苯硫酚类化合物的识别与检测。(这个是添加33个物质，4-甲氧基苯硫酚，4-氟苯硫酚，4-甲基苯硫酚这三个是好的。
[0034]
实验说明探针只对硫酚类化合物有响应，对其他物质没有响应。
[0035]
实施例4海水中不同离子对探针分子probe-dp1荧光强度的影响
[0036]
实验方法为：将实施例1得到的探针分子probe-dp1溶解于dmso中得到5mm的探针母液，4℃保存。实验测定中用dmso/pbs buffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成5μm的标准溶液。4-甲氧基苯硫酚溶解于dmso溶剂中，配成2.5mm的母液，4℃保存，实验测定中用dmso/pbs buffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成50μm的标准溶液。海水中主要无机盐按照national standard gb/t17848-1999的要求分别配置成不同浓度的溶液，4℃保存。主要无机盐如nacl,mgcl2,naf,nahco3,na2so4,h3bo3,srcl2,na2sio3,nano3,kcl,cacl2,kbr等；氨基酸如glu,asn,gly,ala,ser等。向96孔黑板中分别加入100μl的探针溶液与100μl分析物，37℃培养静置30min后测定其光谱；向上述反应液中继续加入50μm的4-甲氧基苯硫酚100μl，混匀后37℃培养静置30min后测定其光谱。结果如图4所示：海水中存在的无机盐和氨基酸对probe-dp1检测苯硫酚的实验结果几乎无影响，说明该探针可以在海水样本中检测苯硫酚化合物。
[0037]
实施例5探针分子probe-dp1在环境水样中检测苯硫酚实验。
[0038]
实验方法为：将实施例1得到的探针分子probe-dp1溶解于dmso中得到5mm的探针母液，4℃保存。实验测定中用dmso/pbs buffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成5μm的标准溶液。4-甲氧基苯硫酚溶解于dmso溶剂中，配成2.5mm的母液，4℃保存。环境水样分别采用青岛市政自来水、青岛北九水水库水及青岛小麦岛附近海域海水，水样过滤后4℃保存待用。使用外标法，向自来水、水库水及海水样本中加入适量4-甲氧基苯硫酚溶液，将其配成2.0μm,4.0μm,6.0μm,8.0μm,10.0μm,15μm,20μm,不同浓度的水样-苯硫酚待测液。向96孔黑板中分别加入100μl的探针溶液与100μl水样-苯硫酚待测液，混匀后37℃培养静置30min后测定其光谱。结果如图5所示：当苯硫酚的浓度在0-20μμ范围时，probe-dp1的荧光强度与苯硫酚的浓度呈现出良好的线性关系，即该探针分子可以应用于环境水样中来检
测低浓度条件下的苯硫酚化合物。
[0039]
以上实施例表明，本发明所述的“关-开”型探针probe-dp1对于苯硫酚类化合物具有良好的选择性和较高的检测灵敏度，可以用于多种环境水样中苯硫酚类化合物的检测，且不受环境水样中其它盐类和氨基酸的影响，实验方法简便快速准确，具有实际的应用价值。
[0040]
通过实施例5可知在苯硫酚的浓度在0-20μμ时，荧光强度与苯硫酚的浓度呈现出良好的线性关系(r2＝0.99545),检测下限为：0.040μμ.以青岛市政自来水、青岛北九水水库水和青岛海域海水样为对象，将其分别配成0,2,4,6,8,10,15,20μμ的苯硫酚的溶液,并利用探针probe-dp1进行了苯硫酚的检测。向探针分子probe-dp1溶液中加入苯硫酚，其荧光强度增强了50倍。实验结果表明：在苯硫酚的浓度在0
–
20μμ时，probe-dp1检测体系的荧光强度与苯硫酚的浓度呈现出良好的线性关系，即该探针分子可以应用于水样中来检测低浓度条件下的苯硫酚化合物，具有实际的应用价值。
[0041]
所述的“关-开”型探针probe-dp1可以作为一种新型的分子探针，用于水样中对苯硫酚化合物的检测。本发明提供了一种用于水样中快速准确检测苯硫酚类有毒物质的方法，具有良好的应用前景。

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