一种多吡啶钌配合物及其制备方法与应用与流程

[0001]
本发明涉及细胞成像探针和抗癌药用钌类配合物技术领域，特别涉及一种多吡啶钌配合物及其制备方法与应用。


背景技术：

[0002]
癌症是威胁人类健康和生命的主要疾病之一，迫切需要寻找能够有效治疗癌症的新的药物和方法。光动力治疗是通过特定波长的光激发光敏剂(photosensitizer，ps)使得氧气转变成活性氧物质(ros)，氧化细胞内的生物分子而杀伤癌细胞，因光动力治疗具有选择性好、毒副作用小、创伤小、无耐药性、可清除隐形病灶等优点在癌症治疗中受到越来越多的关注。
[0003]
多吡啶钌配合物因其优异的荧光性质和光动力活性，被广泛用于细胞成像和光动力治疗，但因其细胞摄取效率低而极大限制其应用，目前商用的细胞膜染料有dio、dil等，溶酶体染料有lyso-tracker red、green等，这些染料因其脂溶性强，且有机染料容易光漂白，在染色中使用不方便，而且价格昂贵，所以合成荧光稳定、水溶性的钌配合物染料具有极大价值；钌配合物在光动力治疗中主要产生单线态氧(1o2)，而1o2的寿命只有4μs，其氧化作用范围只有150nm，所以多吡啶钌配合物定位在细胞的哪个细胞器中对其光动力治疗效果有显著影响。
[0004]
因此，现有技术还有待于改进和发展。


技术实现要素：

[0005]
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于细胞膜和溶酶体成像以及光动力治疗的多吡啶钌配合物及其制备方法及其应用。
[0006]
本发明的技术方案如下：
[0007]
一种多吡啶钌配合物，其中，包括多吡啶钌化合物以及通过中间体与所述多吡啶钌化合物共价连接的胆固醇分子。
[0008]
所述的多吡啶钌配合物，其中，所述中间体为丁二酰基、戊二酰基或邻苯二甲酰基中的一种。
[0009]
所述的多吡啶钌配合物，其中，其化学通式为：
[0010]
其中， l1为
2，2-联吡啶、1，10-菲罗啉或2，2-联喹啉中的一种，l2为含有一个氨基的2，2-联吡啶、为含有一个氨基的1，10-菲罗啉或为含有一个氨基的2-(4-氨基苯基)-1h-咪唑并[4,5-f][1,10]-菲咯啉中的一种，linker 为丁二酰基、戊二酰基或邻苯二甲酰基中的一种。
[0011]
所述的多吡啶钌配合物，其中，所述含有一个氨基的2，2-联吡啶为含有一个氨基的1，10-菲罗啉为含有一个氨基的2
-ꢀ
(4-氨基苯基)-1h-咪唑并[4,5-f][1,10]-菲咯啉为
[0012]
所述多吡啶钌配合物的制备方法，其中，包括步骤：
[0013]
在惰性气氛下，将[ru(l1)2(l2)]cl2溶液与酸酐以及无水吡啶或三乙胺混合，并在50-120℃反应12-48小时，制得羧基化[ru(l1)2(l2-cooh)]cl2产物；
[0014]
在惰性气氛下，将所述羧基化[ru(l1)2(l2-cooh)]cl2产物与胆固醇-乙二胺、n-羟基琥珀酰亚胺、无水三乙胺以及二环己基碳二亚胺或苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯混合，并在50-100℃反应12-48小时，制得 [ru(l1)2(l2)-chol]cl2，即所述多吡啶钌配合物。
[0015]
所述多吡啶钌配合物的制备方法，其中，所述酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐或邻苯二甲酸酐中的一种。
[0016]
所述多吡啶钌配合物的制备方法，其中，所述惰性气氛为氮气气氛、氩气气氛、氦气气氛或氖气气氛中的一种。
[0017]
一种多吡啶钌配合物的应用，其中，将所述多吡啶钌配合物用作细胞膜和溶酶体成像探针。
[0018]
一种多吡啶钌配合物的应用，其中，将所述多吡啶钌配合物用作治疗癌症的光动力试剂。
[0019]
有益效果：本发明提供了一种多吡啶钌配合物，通过在多吡啶钌化合物上通过中间体共价键结合一个胆固醇分子，利用所述胆固醇分子的疏水作用和高效结合细胞膜特性，使得该多吡啶钌配合物可高效结合到细胞膜上，再利用多吡啶钌化合物的荧光成像和光动力治疗作用，得到可以用于细胞膜和溶酶体成像探针及光动力治疗的多吡啶钌配合物。
附图说明
[0020]
图1为本发明一种多吡啶钌配合物的制备方法较佳实施例的流程图。
[0021]
图2a为ru1-chol配合物的核磁共振氢谱谱图。
[0022]
图2b为ru2-chol配合物的核磁共振氢谱谱图。
[0023]
图2c为ru3-chol配合物的核磁共振氢谱谱图。
[0024]
图3a为激光共聚焦原位拍摄ru1-chol配合物在hepg2细胞上的荧光成像。
[0025]
图3b为激光共聚焦原位拍摄ru2-chol配合物在hepg2细胞上的荧光成像。
[0026]
图3c为激光共聚焦原位拍摄ru3-chol配合物在hepg2细胞上的荧光成像。
[0027]
图4a为激光共聚焦拍摄ru1-chol配合物与溶酶体绿色荧光染料green以及线粒体绿色荧光染料green的共定位实验。
[0028]
图4b为激光共聚焦拍摄ru2-chol配合物与溶酶体绿色荧光染料green以及线粒体绿色荧光染料green的共定位实验。
[0029]
图4c为激光共聚焦拍摄ru3-chol配合物与溶酶体绿色荧光染料green以及线粒体绿色荧光染料green的共定位实验。
[0030]
图5a为mtt法检测ru1和ru1-chol的光动力治疗效果。
[0031]
图5b为mtt法检测ru2和ru2-chol的光动力治疗效果。
[0032]
图5c为mtt法检测ru3和ru3-chol的光动力治疗效果。
[0033]
图6为ru1、ru1-chol、ru2、ru2-chol、ru3和ru3-chol配合物在黑暗和光照下对hepg2细胞的ic
50
值及光毒性指数。
具体实施方式
[0034]
本发明提供一种多吡啶钌配合物及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0035]
本发明提供了一种多吡啶钌配合物，其包括多吡啶钌化合物以及通过中间体与所述多吡啶钌化合物共价连接的胆固醇分子。本实施例通过在亲水性好的多吡啶钌化合物上通过中间体共价键结合一个胆固醇分子，利用胆固醇分子的亲脂性和高效结合细胞膜能力，把细胞摄取效率低的多吡啶钌化合物高效结合到细胞膜上，利用所述多吡啶钌配合物优异的荧光特性和光动力治疗活性，可以作为细胞膜和溶酶体成像探针和治疗癌症的光动力试剂。本实施例提供的多吡啶钌配合物可以快速结合到细胞膜上(5min
ꢀ–
4h)，在激发光(450
±
20nm)激发下，产生红色荧光(580
±
20nm) 可用于细胞膜成像，而随着孵育时间延长(>6h)，结合在细胞膜上的多吡啶钌配合物形成溶酶体进入细胞中，具有高效的溶酶体定位作用，可用于溶酶体成像，所以该类化合物可以根据孵育时间来得到细胞膜和溶酶体的成像探针，而且该类化合物具有很低的暗毒性(>100μm)，是理想的成像探针。而在450
±
20nm光激发下，所述多吡啶钌配合物的光动力治疗效果相对于单独的多吡啶钌化合物提高约100倍左右，产生优异的光动力治疗效果，可作为高效的光动力治疗试剂。
[0036]
在一些具体的实施方式中，所述中间体为丁二酰基、戊二酰基或邻苯二甲酰基中的一种，但不限于此。
[0037]
在一些具体的实施方式中，所述多吡啶钌配合物的化学通式为：
[0038]
其中， l1为2，2-联吡啶、1，10-菲罗啉或2，2-联喹啉中的一种，l2为含有一个氨基的2，2-联吡啶、为含有一个氨基的1，10-菲罗啉或为含有一个氨基的2-(4-氨基苯基)-1h-咪唑并[4,5-f][1,10]-菲咯啉中的一种，linker 为丁二酰基、戊二酰基或邻苯二甲酰基中的一种。作为举例，所述2，2
-ꢀ
联吡啶为所述1，10-菲罗啉为所述2，2-联喹啉为所述含有一个氨基的2，2-联吡啶为含有一个氨基的1，10-菲罗啉为含有一个氨基的2-(4-氨基苯基)-1h-咪唑并[4,5-f] [1,10]-菲咯啉为
[0039]
在一些实施方式中，还提供一种多吡啶钌配合物的制备方法，如图1 所示，其包括步骤：
[0040]
s10、在惰性气氛下，将[ru(l1)2(l2)]cl2溶液与酸酐以及无水吡啶或三乙胺混合，并在50-120℃反应12-48小时，制得羧基化 [ru(l1)2(l2-cooh)]cl2产物；
[0041]
s20、在惰性气氛下，将所述羧基化[ru(l1)2(l2-cooh)]cl2产物与胆固醇-乙二胺、n-羟基琥珀酰亚胺、无水三乙胺以及二环己基碳二亚胺或苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯混合，并在50-100℃反应12-48小时，制得 [ru(l1)2(l2)-chol]cl2，即所述多吡啶钌配合物。
[0042]
本实施例提供的多吡啶钌配合物的制备方法简单易操作，其成本低廉，适合工业化生产，其制得的多吡啶钌配合物包括多吡啶钌化合物以及通过中间体与所述多吡啶钌化合物共价连接的胆固醇分子。本实施例通过利用胆固醇分子的亲脂性和高效结合细胞膜能力，把细胞摄取效率低的多吡啶钌配合物高效结合到细胞膜上，利用多吡啶钌配合物优异的荧光特性和光动力治疗活性，可以用于细胞成像探针和光动力治疗试剂，该类胆固醇-钌配合物可以快速结合到细胞膜上(5min
–
4h)，在激发光(450
±
20nm) 激发下，产生红色荧光(580
±
20nm)可用于细胞膜成像，而随着孵育时间延长(>6h)，结合在细胞膜上的胆固醇-钌配合物形成溶酶体进入细胞中，具有高效的溶酶体定位作用，可用于溶酶体成像，所以该类
化合物可以根据孵育时间来得到细胞膜和溶酶体的成像探针，而且该类化合物具有很低的暗毒性(>100μm)，是理想的成像探针。而在450
±
20nm光激发下，胆固醇-钌配合物的光动力治疗效果相对于单独的钌配合物提高约 100倍左右，产生优异的光动力治疗效果，可作为高效的光动力治疗试剂。
[0043]
在一些具体的实施方式中，提供一种多吡啶钌配合物的制备方法，其包括步骤：
[0044]
按每1mmol钌配合物([ru(l1)2(l2)]cl2)溶解在5-50ml无水dmf或 dmso中，与2－50mmol的丁二酸酐(或戊二酸酐、邻苯二甲酸酐)和2-50mmol 无水吡啶或三乙胺，氮气或氩气保护下，在50－120℃反应12－48小时；冷冻干燥去除溶剂，产物溶于5-50ml水，抽滤去除不溶物，收集水溶液，加入2-20mmol的六氟磷酸胺或六氟磷酸钾，搅拌产生红色沉淀，离心收集产物，用5-20ml水洗涤两次，干燥得到红色固体。固体溶于5-20ml丙酮或乙腈，10000rpm离心，去除不溶物，收集红色溶液，加入2-20mmol的四丁基氯化铵，搅拌产生红色固体，离心收集，用2-10ml丙酮或乙腈洗涤，干燥得到羧基化[ru(l1)2(l2-cooh)]cl2产物；
[0045]
将1mmol[ru(l1)2(l2-cooh)]cl2溶于10-50ml无水dmf/氯仿(1/1)或 dmso/氯仿(1/1)混合溶剂中，与1.1-10mmol的胆固醇-乙二胺，1.1-20mmol 的二环己基碳二亚胺或苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯,1.1-20mmol的n
-ꢀ
羟基琥珀酰亚胺,1.1-20mmol的无水三乙胺，氮气或氩气保护下，在50－ 100℃反应12－48小时；冷冻干燥去除溶剂，产物溶于20-100ml水，抽滤去除不溶物，收集水溶液，加入2-20mmol的六氟磷酸胺或六氟磷酸钾，搅拌产生红色沉淀，离心收集产物，用5-20ml水洗涤两次，干燥得到红色固体。固体溶于5-20ml丙酮或乙腈，10000rpm离心，去除不溶物，收集红色溶液，加入2-20mmol的四丁基氯化铵，搅拌产生红色固体，离心收集，用2-10ml丙酮或乙腈洗涤，干燥得到最终产物[ru(l1)2(l2)-chol]cl2。
[0046]
下面通过具体实施例对本发明一种多吡啶钌配合物的制备方法及其应用做进一步的解释说明：
[0047]
实施例1
[0048]
[ru(bpy)2(phen)-chol]cl2(ru1-chol)的制备，其包括以下步骤：
[0049]
将1mmol钌配合物([ru(bpy)2(phen-nh2)]cl2，ru1)溶解在20ml无水 dmf中，与10mmol的丁二酸酐和10mmol无水吡啶，氩气保护下，在100 ℃反应24小时；冷冻干燥去除溶剂，产物溶于20ml水，抽滤去除不溶物，收集水溶液，加入5mmol的六氟磷酸胺，搅拌产生红色沉淀，离心收集产物，用15ml水洗涤两次，干燥得到红色固体。固体溶于10ml丙酮，10000rpm 离心，去除不溶物，收集红色溶液，加入5mmol的四丁基氯化铵，搅拌产生红色固体，离心收集，用5ml丙酮洗涤，干燥得到羧基化 [ru(bpy)2(phen-nh-coch2ch2cooh)]cl2产物；
[0050]
1mmol的[ru(bpy)2(phen-nh-coch2ch2cooh)]cl2溶于25ml无水dmf/氯仿(1/1)混合溶剂中，与2mmol的胆固醇-乙二胺(制备方法参考“chem. commun,2015,51(99):17536-17539.”)，2mmol的二环己基碳二亚胺， 2mmol的n-羟基琥珀酰亚胺，2mmol的无水三乙胺，氩气保护下，在100 ℃反应24小时；冷冻干燥去除溶剂，产物溶于25ml水，抽滤去除不溶物，收集水溶液，加入10mmol的六氟磷酸胺，搅拌产生红色沉淀，离心收集产物，用10ml水洗涤两次，干燥得到红色固体。固体溶于10ml丙酮， 10000rpm离心，去除不溶物，收集红色溶液，加入5mmol的四丁基氯化铵，搅拌产生红色固体，离心收集，用5ml丙酮洗涤，干燥得到最终
产物 [ru(bpy)2(phen)-chol]cl2，结构如下所示：
[0051][0052]
实施例2
[0053]
[ru(bpy)2(phen)-chol]cl2(ru1-chol)的制备，其包括以下步骤：将1mmol钌配合物([ru(bpy)2(phen-nh2)]cl2)溶解在10ml无水dmso中，与20mmol的丁二酸酐和20mmol无水吡啶，氩气保护下，在100℃反应48 小时；冷冻干燥去除溶剂，产物溶于15ml水，抽滤去除不溶物，收集水溶液，加入10mmol的六氟磷酸胺，搅拌产生红色沉淀，离心收集产物，用20ml 水洗涤两次，干燥得到红色固体。固体溶于15ml丙酮，10000rpm离心，去除不溶物，收集红色溶液，加入10mmol的四丁基氯化铵，搅拌产生红色固体，离心收集，用10ml丙酮洗涤，干燥得到羧基化 [ru(bpy)2(phen-nh-coch2ch2cooh)]cl2产物；
[0054]
1mmol的[ru(bpy)2(phen-nh-coch2ch2cooh)]cl2溶于50ml无水dmf/氯仿(1/1)混合溶剂中，与5mmol的胆固醇-乙二胺，5mmol的苯并三氮唑
-ꢀ
四甲基脲六氟磷酸酯，5mmol的n-羟基琥珀酰亚胺，5mmol的无水三乙胺，氩气保护下，在80℃反应24小时；冷冻干燥去除溶剂，产物溶于40ml 水，抽滤去除不溶物，收集水溶液，加入5mmol的六氟磷酸胺，搅拌产生红色沉淀，离心收集产物，用10ml水洗涤两次，干燥得到红色固体。固体溶于10ml丙酮，10000rpm离心，去除不溶物，收集红色溶液，加入5mmol 的四丁基氯化铵，搅拌产生红色固体，离心收集，用5ml丙酮洗涤，干燥得到最终产物[ru(bpy)2(phen)-chol]cl2。
[0055]
实施例3
[0056]
[ru(phen)2(phen)-chol]cl2(ru2-chol)的制备，其包括以下步骤：将1mmol钌配合物([ru(phen)2(phen-nh2)]cl2)溶解在20ml无水dmf中，与10mmol的丁二酸酐和10mmol无水吡啶，氩气保护下，在100℃反应24 小时；冷冻干燥去除溶剂，产物溶于20ml水，抽滤去除不溶物，收集水溶液，加入5mmol的六氟磷酸胺，搅拌产生红色沉淀，离心收集产物，用15ml 水洗涤两次，干燥得到红色固体。固体溶于10ml丙酮，10000rpm离心，去除不溶物，收集红色溶液，加入5mmol的四丁基氯化铵，搅拌产生红色固体，离心收集，用5ml丙酮洗涤，干燥得到羧基化 [ru(phen)2(phen-nh-coch2ch2cooh)]cl2产物；
[0057]
1mmol的[ru(phen)2(phen-nh-coch2ch2cooh)]cl2溶于25ml无水dmf/氯仿(1/1)混合溶剂中，与2mmol的胆固醇-乙二胺，2mmol的二环己基碳二亚胺，2mmol的n-羟基琥珀酰亚胺，2mmol的无水三乙胺，氩气保护下，在 100℃反应24小时；冷冻干燥去除溶剂，产物溶于25ml水，抽滤去除不溶物，收集水溶液，加入10mmol的六氟磷酸胺，搅拌产生红色沉淀，离心收集产物，用10ml水洗涤两次，干燥得到红色固体。固体溶于10ml丙酮，10000rpm离心，去除不溶物，收集红色溶液，加入5mmol的四丁基氯化铵，搅拌产生红色固体，离心收集，用5ml丙酮洗涤，干燥得到最终产物[ru(phen)2(phen)-chol]cl2，结构如下所示：
[0058][0059]
实施例4
[0060]
[ru(phen)2(phen)-chol]cl2(ru2-chol)的制备，其包括以下步骤：将1mmol钌配合物([ru(phen)2(phen-nh2)]cl2)溶解在10ml无水dmso中，与20mmol的丁二酸酐和20mmol无水吡啶，氩气保护下，在100℃反应48 小时；冷冻干燥去除溶剂，产物溶于15ml水，抽滤去除不溶物，收集水溶液，加入10mmol的六氟磷酸胺，搅拌产生红色沉淀，离心收集产物，用20ml 水洗涤两次，干燥得到红色固体。固体溶于15ml丙酮，10000rpm离心，去除不溶物，收集红色溶液，加入10mmol的四丁基氯化铵，搅拌产生红色固体，离心收集，用10ml丙酮洗涤，干燥得到羧基化 [ru(phen)2(phen-nh-coch2ch2cooh)]cl2产物；
[0061]
1mmol的[ru(phen)2(phen-nh-coch2ch2cooh)]cl2溶于50ml无水dmf/氯仿(1/1)混合溶剂中，与5mmol的胆固醇-乙二胺，5mmol的苯并三氮唑
-ꢀ
四甲基脲六氟磷酸酯，5mmol的n-羟基琥珀酰亚胺，5mmol的无水三乙胺，氩气保护下，在80℃反应24小时；冷冻干燥去除溶剂，产物溶于40ml 水，抽滤去除不溶物，收集水溶液，加入5mmol的六氟磷酸胺，搅拌产生红色沉淀，离心收集产物，用10ml水洗涤两次，干燥得到红色固体。固体溶于10ml丙酮，10000rpm离心，去除不溶物，收集红色溶液，加入5mmol 的四丁基氯化铵，搅拌产生红色固体，离心收集，用5ml丙酮洗涤，干燥得到最终产物[ru(phen)2(phen)-chol]cl2。
[0062]
实施例5
[0063]
[ru(bpy)2(phen-iman)-chol]cl2(ru3-chol)的制备，其包括以下步骤：
[0064]
将1mmol钌配合物([ru(bpy)2(phen-iman-nh2)]cl2)(制备方法参考“j.am. chem.soc.2017,139,6,2512
–
2519.”、“j.mater.chem.b,2016, 4(27):4746-4753.”)溶解在20ml无水dmf中，与10mmol的丁二酸酐和 10mmol无水吡啶，氩气保护下，在100℃反应24小时；冷冻干燥去除溶剂，产物溶于20ml水，抽滤去除不溶物，收集水溶液，加入5mmol的六氟磷酸胺，搅拌产生红色沉淀，离心收集产物，用15ml水洗涤两次，干燥得到红色固体。固体溶于10ml丙酮，10000rpm离心，去除不溶物，收集红色溶液，加入5mmol的四丁基氯化铵，搅拌产生红色固体，离心收集，用5ml 丙酮洗涤，干燥得到羧基化[ru(bpy)2(phen-iman-nh-coch2ch2cooh)]cl2产物；
[0065]
1mmol的[ru(bpy)2(phen-iman-nh-coch2ch2cooh)]cl2溶于25ml无水 dmf/氯仿(1/1)混合溶剂中，与2mmol的胆固醇-乙二胺，2mmol的二环己基碳二亚胺，2mmol的n-羟基琥珀酰亚胺，2mmol的无水三乙胺，氩气保护下，在100℃反应24小时；冷冻干燥去除溶剂，产物溶于25ml水，抽滤去除不溶物，收集水溶液，加入10mmol的六氟磷酸胺，搅拌产生红色沉淀，离心收集产物，用10ml水洗涤两次，干燥得到红色固体。固体溶于10ml 丙酮，10000rpm离心，去除不溶物，收集红色溶液，加入5mmol的四丁基氯化铵，搅拌产生红色固体，离心收集，用5ml丙酮洗涤，干燥得到最终产物[ru(bpy)2(phen-iman)-chol]cl2，结构如下所示：
[0066][0067]
实施例6
[0068]
[ru(bpy)2(phen-iman)-chol]cl2(ru3-chol)的制备，其包括以下步骤：
[0069]
将1mmol钌配合物([ru(bpy)2(phen-iman-nh2)]cl2)溶解在10ml无水 dmso中，与20mmol的丁二酸酐和20mmol无水吡啶，氩气保护下，在100 ℃反应48小时；冷冻干燥去除溶剂，产物溶于15ml水，抽滤去除不溶物，收集水溶液，加入10mmol的六氟磷酸胺，搅拌产生红色沉淀，离心收集产物，用20ml水洗涤两次，干燥得到红色固体。固体溶于15ml丙酮，10000rpm 离心，去除不溶物，收集红色溶液，加入10mmol的四丁基氯化铵，搅拌产生红色固体，离心收集，用10ml丙酮洗涤，干燥得到羧基化 [ru(bpy)2(phen-iman-nh-coch2ch2cooh)]cl2产物；
[0070]
1mmol的[ru(bpy)2(phen-iman-nh-coch2ch2cooh)]cl2溶于50ml无水 dmf/氯仿(1/1)混合溶剂中，与5mmol的胆固醇-乙二胺，5mmol的苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯，5mmol的n-羟基琥珀酰亚胺，5mmol的无水三乙胺，氩气保护下，在80℃反应24小时；冷冻干燥去除溶剂，产物溶于 40ml水，抽滤去除不溶物，收集水溶液，加入5mmol的六氟磷酸胺，搅拌产生红色沉淀，离心收集产物，用10ml水洗涤两次，干燥得到红色固体。固体溶于10ml丙酮，10000rpm离心，去除不溶物，收集红色溶液，加入 5mmol的四丁基氯化铵，搅拌产生红色固体，离心收集，用5ml丙酮洗涤，干燥得到最终产物[ru(bpy)2(phen-iman)-chol]cl2。
[0071]
实施例7
[0072]
根据上述实施例所制备得到的胆固醇-钌配合物进行细胞成像和光动力治疗效果试验
[0073]
一、细胞培养
[0074]
将人肝癌细胞(hepg2)在含有10％的胎牛血清的dmem高糖培养基中于 37℃、5％co2的培养箱中培养，选用对数生长期细胞用于实验。
[0075]
二、激光共聚焦检测胆固醇-钌配合物的细胞成像
[0076]
细胞膜成像：取对数生长期细胞2
×
105个/ml接种在激光共聚焦皿上，每孔1ml，培养24h待细胞贴壁后，加入胆固醇-钌配合物溶液(钌浓度为 25μm)到细胞中，不同时间(1、5、10、20、30min)原位拍摄细胞膜成像效果，em＝488，ex＝580
±
20nm。
[0077]
溶酶体成像：取对数生长期细胞2
×
105个/ml接种在激光共聚焦皿上，每孔1ml，培养24h待细胞贴壁后，加入胆固醇-钌配合物溶液(钌浓度为 25μm)到细胞中孵育1h，去除药物加入新鲜培养基继续孵育12h，加入green染料，进行共定位实验。
[0078]
三、mtt法检测胆固醇-钌配合的光动力治疗效果
[0079]
取对数生长期细胞8000个/孔接种在96孔板上，培养24h待细胞贴壁后，加入不同浓度的胆固醇-钌配合物溶液到细胞中，孵育30min，去除药物，用460nm光(10mw/cm2)30min，继续孵育24h，加入25μl，5mg/ml 的mtt试剂，继续孵育4h，去除培养基，加入150μl的
dmso，摇匀30min，用酶标仪读取490nm处吸收值，存活率(％)＝[实验组(s)的a值-空白(b)a 值]/[对照组(c)的a值-空白(b)的a值]，通过graphpad prism 5软件计算半抑制率浓度-ic
50
值。
[0080]
本发明制备合成了一种可用于细胞膜和溶酶体成像探针及光动力治疗的多吡啶钌配合物，对实施例中合成的胆固醇-钌配合物进行核磁共振氢谱表征其纯度和正确性、通过激光共聚焦细胞原位荧光成像、激光共聚焦共定位实验和mtt实验对其细胞膜和溶酶体成像及光动力治疗效果进行评估，结果如图2a-2c，图3a-3c，图4a-4c，图5a-5c以及图6所示。
[0081]
具体而言，图2a-2c是实施例1-6中合成的三个胆固醇-钌配合物 (ru1-chol、ru2-chol、ru3-chol)，通过对其核磁结果分析，谱图中具有多吡啶钌配合物、丁二酸酰基、胆固醇-乙二胺的氢谱信号，而且积分比例正确，氢原子个数符合结构式，即得到的三个胆固醇-钌配合物结构正确，纯度高。图3a-3c是激光共聚焦拍摄ru1-chol、ru2-chol、ru3-chol(25 μm)在hepg2细胞上原位细胞膜成像，从图中可以看到在1min分钟时就能在细胞膜上看到明显红色荧光，随着时间增加到30min，荧光逐渐增加，该实验说明该类胆固醇-钌配合可以快速结合到细胞膜上用于细胞膜红色荧光成像染料。结合到细胞膜上的胆固醇-钌配合物随着孵育时间延长会逐渐进入细胞中，通过使用商用溶酶体绿色荧光染料green和线粒体绿色荧光染料green来进行共定位实验，从图4a-4c 结果可以得到ru1-chol、ru2-chol、ru3-chol和溶酶体染料的共定位系数分别为0.82、0.82、0.84，而和线粒体染料的共定位系数分别为0.38、0.35、 0.22，从这结果可以得到通过长时间孵育，胆固醇-钌配合物会富集在溶酶体中，可以作为溶酶体成像染料。通过mtt法检测配合物对hepg2细胞的光动力治疗效果，结果如图5a-5c以及图6所示，结合胆固醇后，显著提高了多吡啶钌配合物的光动力治疗效果，特别对于ru1-chol，相对于ru1 其光动力效果提高了327倍，而且通过结合胆固醇，钌配合物的光毒性指数显著提高，都能达到200倍以上，mtt实验结果说明本发明合成的胆固醇
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钌配合物可以作为高效的光动力治疗试剂。
[0082]
综上所述，本发明通过在多吡啶钌化合物上通过中间体共价键结合一个胆固醇分子，制得多吡啶钌配合物，利用所述胆固醇分子的疏水作用和高效结合细胞膜特性，使得该多吡啶钌配合物可高效结合到细胞膜上，再利用多吡啶钌化合物的荧光成像和光动力治疗作用，得到可以用于细胞膜和溶酶体成像探针及光动力治疗的多吡啶钌配合物。
[0083]
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

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