一种检测多重耐药质粒水平转移的方法与流程

2021-02-02 08:02:38|

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本发明涉及利用携带luxcdabe基因簇的受体菌验证多重耐药质粒是否具有水平转移能力，属于生物技术领域。

背景技术：

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luxab基因编码荧光素酶，luxcde基因编码反应底物合成酶合成底物。若在该基因簇上游引入一个外源启动子，则表达的荧光素酶催化底物发出荧光，使受体菌具有荧光特性。质粒根据能否移动可分为：不可移动性质粒、可移动性质粒和可接合性质粒。可移动性质粒由于缺少四型分泌系统（type-iv secretion system，t4ss）基因簇，只有在辅助质粒的协助下才能够进行水平转移。可接合性质粒携带着自我转移所需的所有基因，可自主进行水平转移。质粒能够通过接合作用驱动抗生素抗性基因的水平转移(horizontal gene transfer，hgt)，耐药质粒的水平转移在耐药基因的传播和多重耐药病原菌的出现方面起着关键作用。耐药质粒的水平转移给病原菌临床治疗带来很多困难，对临床致病菌所携带耐药质粒水平转移的研究将有助于理解多重耐药细菌传播路径及机理。
[0003]
目前用于检测质粒水平转移的细菌接合实验中，主要利用抗生素的敏感性区分接合后的供体菌和接合子。然而对一些耐药性细菌之间的接合实验，有时很难找到合适的抗生素杀死接合后混合菌中的供体菌，因此也就很难辨认质粒是否转移到受体菌中。

技术实现要素：

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本发明提供了一种利用携带luxcdabe基因簇的受体菌检测多重耐药质粒水平转移能力的方法，以区分供体菌和接合子，有利于研究耐药质粒的水平转移特性。
[0005]
本发明实现过程如下：一种利用携带luxcdabe基因簇的受体菌检测多重耐药质粒水平转移能力的方法，包括以下步骤：（1）融合载体构建以铜绿假单胞菌pao1基因组为模板pcr 扩增pa1863基因的启动子，将其克隆到pms402载体，此质粒标记为pkd-pa1863；（2）整合载体构建质粒ctx-6.1与质粒pkd-pa1863通过paci单酶切后连接，得到的整合重组质粒，标记为ctx-pa1863-lux；（3）荧光受体菌构建蔗糖法制备铜绿假单胞菌pao1感受态细胞。将ctx-pa1863-lux质粒电转化至感受态细胞，筛选出的受体菌，标记为pao1-lux，作为受体菌；（4）供体菌和受体菌的接合含有耐药质粒的供体菌和pao1-lux受体菌分别培养至对数生长期后，将供体菌和受体菌按重量1∶3比例混合均匀后共培养，得到含有供体菌、受体菌和接合子的混合菌；
（5）接合子的筛选将混合菌液涂布在含庆大霉素的lb琼脂平板上培养，将平板置于全自动化学发光图像分析系统检测发光情况，耐药且发光的细菌则为接合子，说明多重耐药质粒具有水平转移能力。
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（6）耐药性和发光性的检测及验证分析检测和验证供体菌、受体菌和接合子的庆大霉素耐药性和荧光性。
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上述步骤（4）中，将供体菌和受体菌分别在37℃和42℃条件下，培养至对数生长期。一般来说，供体菌和受体菌的培养温度在37℃下进行，本发明供体菌和受体菌的培养温度的培养温度分别在37℃和42℃条件下，更有助于供体菌和受体菌的接合转移。
[0008]
上述步骤（4）中，供体菌和受体菌共培养过程中，加入了16 mg/l氯霉素。本发明供体菌和受体菌共培养过程中，加入16 mg/l氯霉素后有助于提高接合转移效率。
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上述步骤（5）中，将混合菌液涂布在含100 mg/l庆大霉素的lb琼脂平板上于37℃培养24h。前期对质粒的耐药基因分析时，发现质粒携带庆大霉素耐药基因，并且受体菌对庆大霉素敏感，故本发明选用庆大霉素作为抗性标记。本发明供体菌和受体菌共培养过程中，延长共培养时间有助于提高接合转移效率。
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本发明的创新点和积极效果：（1）本发明为多重耐药质粒水平转移检测时对于受体菌的筛选提供了一种新的方法；（2）传统方法利用细菌对抗生素的敏感性去筛选接合子，难以解决供体菌中多重耐药质粒对多种抗生素耐药的问题，从而无法区分出供体菌和接合子。结合受体菌的荧光性和多重耐药质粒的耐药性，可以区分供体菌、受体菌和接合子，从而检测多重耐药质粒水平转移的能力。
附图说明
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图1 供体菌和受体菌的混合菌在含有16 mg/l氯霉素的mh琼脂平板的照片；图2 接合转移后的供体菌和接合子在含有100 mg/l庆大霉素的lb琼脂平板上的照片；图3 接合转移后的供体菌和接合子在含有100 mg/l庆大霉素的lb琼脂平板照片（图2同一平板在全自动化学发光图像分析系统下照片）；图4 供体菌、受体菌和接合子在含有100 mg/l庆大霉素的lb琼脂平板的照片；图5 供体菌、受体菌和接合子在含有100 mg/l庆大霉素的lb琼脂平板的照片（与图4同一平板在全自动化学发光图像分析系统下照片）；图6 供体菌、受体菌和接合子在lb琼脂平板的照片；图7 供体菌、受体菌和接合子在lb琼脂平板的照片（与图6同一平板在全自动化学发光图像分析系统下照片）。
具体实施方式
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本发明以铜绿假单胞菌为例，说明该发明的内容。所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。实验使用的仪器为电热恒温培养箱，tanon2500全自动数码凝胶图像分析系统，tanon5200全自动化学发光图像分析系统，bio-rad梯度pcr仪，bio-rad电转仪，nanodrop 2000，佳能数码相机eos 750d。
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荧光受体细菌的构建
（1）融合载体构建以铜绿假单胞菌pao1基因组为模板pcr 扩增pa1863基因的启动子，将其克隆到pms402载体，此质粒标记为pkd-pa1863；（2）整合载体构建源自于整合质粒mini-ctx-lux的质粒ctx-6.1，携带有噬菌体结合位点核心序列attp，能借助位点专一性重组整合到铜绿假单胞菌基因组attb位点。质粒ctx-6.1与质粒pkd-pa1863通过paci单酶切后连接，将连接产物化转到dh5α感受态细胞中，涂布到含有10 mg/l四环素的lb平板，37℃培养24h，挑取单菌落扩大培养，提取质粒进行pcr验证和酶切验证，得到的整合重组质粒标记为ctx-pa1863-lux。
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（3）荧光受体菌构建用0.3m蔗糖溶液制备铜绿假单胞菌pao1感受态细胞，50 μl感受态细胞与3 μl整合质粒混合放入电转仪，进行电转化，涂布到含有100 mg/l四环素的lb平板，37℃培养24h，筛选出的受体菌，标记为pao1-lux，作为受体菌。
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检测耐药质粒水平转移（1）供体菌和受体菌的接合供体菌和受体菌的单菌落接种到5ml新鲜的lb培养基溶液中，分别在37℃和42℃条件下，培养至对数生长期（od
600
为0.6~1.0），将供体菌和受体菌按重量1∶3比例混合均匀后离心，舍弃上清溶液，吸取100μl新鲜lb培养基溶液，将混合菌体重悬。吸取80μl悬浮的菌液小心滴加在含有16 mg/l氯霉素的0.45μm滤膜的m-h（mueller-hinton）琼脂平板的中心，置于37℃培养箱，培养24h。收集滤膜上的细菌，用100μl lb液体培养基将其重悬，连续稀释400倍(图1)。
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（2）接合子的筛选将稀释后的混合菌液涂布在含有100 mg/l庆大霉素的lb琼脂平板上，放37℃培养24h(图2)，将平板置于全自动化学发光图像分析系统检测发光情况(图3)，耐药且发光的细菌则为接合子，说明多重耐药质粒具有水平转移能力。
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（3）耐药性和发光性的检测及验证分析检测和验证供体菌、受体菌和接合子的庆大霉素耐药性(图4和图5)和荧光性(图6和图7)，利用庆大霉素耐药性区分受体菌和接合子，利用荧光性区分供体菌和接合子。

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