提高枯草芽孢杆菌GlcNAc产量的方法及一种重组枯草芽孢杆菌与流程

提高枯草芽孢杆菌glcnac产量的方法及一种重组枯草芽孢杆菌
技术领域
[0001]
本发明涉及一种提高枯草芽孢杆菌glcnac产量的方法及一种重组枯草芽孢杆菌，属于基因工程技术领域。


背景技术：

[0002]
氨基葡萄糖(glucosamine)是一种重要的功能单糖，其衍生物n-乙酰氨基葡萄糖(n-acetylglucosamine)，也称2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-葡萄糖，是葡萄糖2位羟基被乙酰氨基(ch3conh-)取代后的单糖衍生物。作为自然界中仅次于纤维素的第二大碳水化合物甲壳素的单体，乙酰氨基葡萄糖大量存在于原核、真核、植物的细胞壁以及动物的骨骼之中。
[0003]
研究表明，氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖具有一些特殊的生理活性功能，如消炎镇痛，修复软骨损伤，治疗风湿性关节炎；强化白细胞增值和分化，促进细胞因子分泌，改善免疫调节、抗肿瘤；恢复线粒体内酶表达，提高线粒体谷胱甘肽抗氧化能力，增强免疫功能；促进内质网相关蛋白降解，强化蛋白酶活性，改善蛋白稳态水平，延长细胞寿命等。因此，其被广泛应用于医药、食品营养、健康保健及化妆品等领域。据报道，2019年全球氨基葡萄糖市场总额约为50亿美元。随着生活质量的进一步提高以及人口老龄化问题的加剧，氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖类医药、食品营养保健品的全球需求会持续增加。预计在2019到2022年之间，氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的全球市场规模会以 5％的复合年均增长率(compound annual growth rate，cagr)上升。
[0004]
用于微生物发酵法生产glcnac的工程菌株主要包括大肠杆菌(escherichiacoli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。以e.coli作为glcnac生产宿主，通过代谢工程手段改造优化后产量能达到110g
·
l-1
。然而，e.coli是非食品安全级菌株，分泌的内毒素导致其生产的glcnac无法应用于食品、医药等领域。c.glutamicum和s.cerevisiae是食品安全级菌株，但目前两者报道的 glcnac产量皆较低，分别为2.1和6.9g
·
l-1
。而且，c.glutamicum属于非模式菌株，基因组gc含量较高，且遗传背景和分子操作技术尚不成熟，导致基因操作较难。相比之下，b.subtilis具有遗传背景清晰，分子操作技术成熟的特点。
[0005]
针对b.subtilis合成乙酰氨基葡萄糖国内外已开展了大量的代谢工程改造工作，但是b.subtilis合成乙酰氨基葡萄糖胞内代谢网络及调控机制仍未清晰理解，比如乙酰氨基葡萄糖的转运蛋白。b.subtilis合成乙酰氨基葡萄糖的产量有待进一步提高。


技术实现要素：

[0006]
为解决上述问题，本发明提供一种提高枯草芽孢杆菌glcnac产量的方法，通过在枯草芽孢杆菌中过表达二氢脂酰胺乙酰转移酶编码基因acoc，能够提高乙酰氨基葡萄糖产量，在代谢工程上具有良好的应用前景。
[0007]
本发明的第一个目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌glcnac产量的方法，所述方法
是通过在生产乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌中过表达二氢脂酰胺乙酰转移酶编码基因acoc。
[0008]
进一步地，所述的二氢脂酰胺乙酰转移酶编码基因acoc通过强组成型导型启动子p
43
调控表达。
[0009]
进一步地，所述的二氢脂酰胺乙酰转移酶编码基因acoc序列如seq idno.1所示。
[0010]
进一步地，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌b.subtilis 168 δnagp δgamp δgama δnaga δnagb δldh p
xyla-glms δglck δpyk δkdga δpcka p
43-pfkap
43-fbaa p
43-pcka δmela δmals δywka δytsj p
43-bacpyca p
43-glms p
43-glnap
43-gltc p
43-ecglna p
43-bmqo p
43-porab p
43-gor p
43-nifh::lox72(枯草芽孢杆菌 bp18)。
[0011]
枯草芽孢杆菌bp18的构建方法可参阅文献“synthetic redesign of centralcarbon and redox metabolism for high yield production of n-acetylglucosamine inbacillus subtilis(metabolic engineering，51(2019)p59-69)”，在此不作进一步描述。
[0012]
本发明的第二个目的是提供采用所述的方法构建得到的重组枯草芽孢杆菌。
[0013]
进一步地，所述的重组枯草芽孢杆菌是以强组成型启动子p
43
调控枯草芽孢杆菌中二氢脂酰胺乙酰转移酶编码基因acoc的表达得到。
[0014]
本发明的第三个目的是提供所述的重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：将重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化，然后将活化后的种子转入发酵培养基，加入诱导剂进行发酵培养，得到乙酰氨基葡萄糖。
[0015]
进一步地，所述的种子培养基包括以下成分：8-12g/l胰蛋白胨、4-6g/l 酵母粉和8-12g/l氯化钠。
[0016]
进一步地，所述的发酵培养基包括以下成分：18-22g/l葡萄糖、5-7g/l蛋白胨、10-14g/l酵母粉、5-7g/l硫酸铵、10-14g/l磷酸氢二钾、2-3g/l磷酸二氢钾、4-6g/l碳酸钙和8-12ml/l微量元素溶液。
[0017]
进一步地，所述的微量元素溶液包括以下成分：0.8-1.2g/l硫酸锰、0.3-0.5 g/l氯化钴、0.1-0.3g/l钼酸钠、0.1-0.3g/l硫酸锌、0.05-0.15g/l氯化铝、 0.05-0.15g/l氯化铜、0.04-0.06g/l硼酸和4-6mol/l盐酸。
[0018]
本发明的有益效果：
[0019]
本发明以枯草芽孢杆菌作为出发菌株，通过基于gibson组装技术，以强组成型启动子p
43
调控二氢脂酰胺乙酰转移酶编码基因acoc表达，从而能够提高枯草芽孢杆菌中乙酰氨基葡萄糖产量，重组枯草芽孢杆菌bp18-gna1-acoc的乙酰氨基葡萄糖产量达到26.8g
·
l-1
，较对照菌bp18-gna1(24.5g
·
l-1
)提高9.4％。本发明加强乙酰氨基葡萄糖合成途径，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有良好的应用前景。
附图说明
[0020]
图1为表达碳水化合物代谢通路和膜运输蛋白中转录上调基因的摇瓶发酵结果。
具体实施方式
[0021]
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0022]
种子培养基的成分包括：10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉和10g/l氯化钠。
[0023]
发酵培养基的成分包括：20g/l葡萄糖、6g/l蛋白胨、12g/l酵母粉、6g/l 硫酸铵、12.5g/l磷酸氢二钾、2.5g/l磷酸二氢钾、5g/l碳酸钙和10ml/l微量元素溶液。
[0024]
其中微量元素溶液以其重量为基准包括如下组份：1.0g/l硫酸锰、0.4g/l 氯化钴、0.2g/l钼酸钠、0.2g/l硫酸锌、0.1g/l氯化铝、0.1g/l氯化铜、0.05 g/l硼酸和5mol/l盐酸。
[0025]
实施例1：
[0026]
将保藏于-80℃冰箱中的工程重组工程菌bsgn6-p
xyla-glms、 bsgn6-p
xyla-glms-gna1、bp18和bp18-gna1菌株甘油管划线于无抗lb或卡那霉素lb固体琼脂平板，37℃培养12h后；挑取单菌落接种至装有25ml 液体lb培养基的250ml摇瓶中，37℃条件下220rpm振荡培养6-8h作为种子液；以5％的接种量将种子液转接至装有75ml发酵培养基的500ml带挡板三角摇瓶中。37℃培养16h后，在4℃、10000g条件下，离心10min收集菌体，并迅速将菌体(2个平行样品)置于液氮中阻断代谢。使用干冰保持低温，将菌体送至华大基因(武汉)进行基因转录水平分析。
[0027]
实施例2：
[0028]
bsgn6-p
xyla-glms-gna1和bp18-gna1分别是乙酰氨基葡萄糖的低产和高产菌株，因此选择bsgn6-p
xyla-glms-gna1_vs_bp18-gna1的结果分析膜运输蛋白转录水平差异，以鉴定乙酰氨基葡萄糖的转运蛋白。但是工程菌 bsgn6-p
xyla-glms和bp18在改造背景上存在差异，为避免因代谢工程改造，导致重组工程菌bsgn6-p
xyla-glms-gna1和bp18-gna1在膜运输蛋白方面产生转录差异，本研究同时使用bsgn6-p
xyla-glms_vs_bp18作为参照(表1)。表2为在bsgn6-p
xyla-glms-gna1_vs_bp18-gna1中膜运输蛋白转录上调，但 bsgn6-p
xyla-glms_vs_bp18中未上调的基因，包括：bsu_32580、bsu_32600、 bsu_32590、bsu_35930、bsu_02350、bsu_05820、bsu_32550、bsu_05830、 bsu_24960、bsu_24970、bsu_24950、bsu_12930、bsu_24980、bsu_24990、 bsu_12940、bsu_12950、bsu_12960、bsu_33820、bsu_30280、bsu_33810、 bsu_33800、bsu_07490、bsu_30290、bsu_30270、bsu_34150、bsu_07500 和bsu_34140，详细功能和基因注释见表2。
[0029]
表1膜运输蛋白基因转录差异
[0030][0031]
表2 bp18-gna1_vs_bsgn6-p
xyla-glms-gna1膜运输蛋白中转录上调的有效基因及功能
[0032][0033]1表示log2(bp18-gna1/bsgn6-p
xyla-glms-gna1)；2表示log2(bp18/bsgn6-p
xyla-glms)。
[0034]
表3为重组工程菌bsgn6-p
xyla-glms-gna1和bp18-gna1碳水化合物代谢通路基因转录的差异情况。表4为在bsgn6-p
xyla-glms-gna1_vs_bp18-gna1 中碳水化合物代谢通路转录上调，但bsgn6-p
xyla-glms_vs_bp18中未上调的基因，包括：bsu_02350、bsu_08090、bsu_05820、bsu_08080、bsu_05830、 bsu_28790、bsu_12160、bsu_05870、bsu_39920、bsu_22110、bsu_04340、 bsu_04000、bsu_40110、bsu_19310、bsu_02840、bsu_28690、bsu_39050、 bsu_02830、bsu_34130、bsu_38190、bsu_02470和bsu_05880，详细功能和基因注释见表4。
[0035]
表3碳水化合物代谢通路的基因转录差异
[0036]
[0037][0038]
表4 bp18-gna1_vs_bsgn6-p
xyla-glms-gna1碳水化合物代谢通路中转录上调的有效基因及功能
[0039][0040]1表示log2(bp18-gna1/bsgn6-p
xyla-glms-gna1)；2表示log2(bp18/bsgn6-p
xyla-glms)。
[0041]
实施例3：
[0042]
基于gibson组装技术，共构建16个重组质粒，分别为pp43nmk-gna1-f rlm、pp43nmk-gna1-frlo、pp43nmk-gna1-frln、pp43nmk-gna1-rbsd、p p43nmk-gna1-gamp、pp43nmk-gna1-gmua、pp43nmk-gna1-frlp、pp43n mk-gna1-gmuc、pp43nmk-gna1-pstba、
pp43nmk-gna1-psta、p43nmk
-ꢀ
gna1-acol、pp43nmk-gna1-acoc、pp43nmk-gna1-arab、pp43nmk-gna1
ꢀ-
yjgc、pp43nmk-gna1-gmuf和pp43nmk-gna1-asnh。
[0043]
引物表见表5，质粒pp43nmk-gna1-p
43-acoc构建为例：以质粒pp43nm k-gna1和b.subtilis 168基因组为模板，使用引物acoc-f/acoc-r和pp43nm k_f/pp43nmk_r扩增获得pp43nmk-gna1骨架序列和b.subtilis来源的aco c序列，通过gibson组装将pp43nmk-gna1骨架和acoc序列组装为重组质粒pp43nmk-gna1-acoc。
[0044]
表5引物表
[0045]
[0046]
下划线表示gibson组装的同源序列。
[0047]
实施例4：
[0048]
为了鉴定碳水化合物代谢通路中影响乙酰氨基葡萄糖合成的关键点，选择该通路中转录上调倍数较大的基因进行表达验证，包括gamp、acol、gmua、 acoc、gmuc、arab、yjgc、gmuf和asnh。同时，为了鉴定乙酰氨基葡萄糖膜转运蛋白，选择膜运输蛋白中转录上调倍数较大基因frlm、frlo、frln、rbsd、gamp、gmua、frlp、gmuc、pstba和psta进行验证。值得一提的是，基因gamp、 gmuc和guma为碳水化合物代谢通路和膜运输蛋白共同转录上调基因。
[0049]
将基因acol、acoc、arab、yjgc、gmuf、asnh、frlm、frlo、frln、rbsd、 gamp、gmua、frlp、gmuc、pstba和psta与gna1基因通过质粒pp43nmk进行串联表达，获得一系列重组质粒(见实施3)。随后，将重组质粒转化至工程菌bp18中，获得16株重组工程菌。如图1所示，摇瓶发酵结果显示表达碳水化合物代谢通路基因acoc(编码二氢脂酰胺乙酰转移酶)能显著促进乙酰氨基葡萄糖的合成，重组工程菌bp18-gna1-acoc的乙酰氨基葡萄糖产量达到26.8 g
·
l-1
，较对照菌bp18-gna1(24.5g
·
l-1
)提高9.4％。但是，表达其他碳水化合物代谢通路和膜运输蛋白基因均对乙酰氨基葡萄糖合成均产生负向影响。
[0050]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

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