粘性生物样本消化剂及其制备方法与流程

[0001]
本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种粘性生物样本消化剂及其制备方法。


背景技术：

[0002]
多种临床样本如痰、子宫颈样本等都有粘性。这些样本中，无临床意义的正常菌群多分布在粘液块表面，有临床意义的病原菌则多包裹在粘液块内部。这类样本直接涂片时，细菌、细胞等有形成分呈多层重叠，难于染色观察；直接划线分离接种时，粘液块内部的病原菌无法分散，难于取得满意的分离效果。因此，在对这类标本进行涂片检查、分离培养检查前，必须使样本液化及匀化，临床简称样本消化。
[0003]
粘性样本消化有还原剂法和酶法两种，目前都通过商品化试剂实现。
[0004]
还原剂法使用的试剂有二硫苏糖醇类和n-乙酰半胱氨酸类两种，通过破坏二硫键(-s-s-)而发挥解粘作用。二硫苏糖醇类多用于普通菌分离培养时的样本消化，n-乙酰半胱氨酸类则用于分枝杆菌分离培养时的样本消化。因还原剂溶解后不稳定，试剂都以双组份提供，其中还原剂以干粉形式提供，溶剂以液体形式提供，用户需在使用前自行将两种组分混合溶解(复配)；试剂在常温下不稳定，需冷冻(-20℃)保存；复配后需在48小时内用完，否则氧化失效；用于样本消化时易使病原菌(特别是流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌等苛养菌)菌体损伤，导致培养检测失败。
[0005]
酶法又称胰酶法，使用的试剂为胰蛋白酶，属肽链内切酶，通过选择性切断赖氨酸或精氨酸羧基参与形成的肽键而发挥解粘作用。因胰蛋白酶在酸性环境中稳定但无活性，在碱性环境中有活性但不稳定，试剂都以双组份提供，其中胰蛋白酶以干粉形式提供，溶剂以液体形式提供，需用户在使用前自行复配；试剂在常温下不稳定，需冷冻(-20℃)保存；复配后需在48小时内用完，否则酶活性丧失；胰蛋白酶最适ph值为7.8-8.5，偏碱，对病原菌可造成轻微损伤，消化时间过长时会对培养检测有影响。
[0006]
综上所述，目前常用的样本消化试剂需低温保存、需用户复配、液态不稳定、损伤病原菌、在不同检测项目间不通用。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是针对上述问题，提供一种稳定的粘性生物样本消化剂组合物。
[0008]
本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：
[0009]
一种粘性生物样本的消化剂组合物，包括蛋白酶、稳定剂、和增效剂；
[0010]
所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、组织蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或者蛋白酶k；
[0011]
所述稳定剂包括糖类、环糊精和生物缓冲剂；
[0012]
所述增效剂为焦磷酸钠、三乙醇胺、乙二胺四乙酸钠、酒石酸或者柠檬酸钠，优选乙二胺四乙酸钠。
[0013]
所述组织蛋白酶为组织蛋白酶b；所述糖类选自蔗糖、海藻糖、甘露醇中的一种或多种，优选海藻糖。
[0014]
所述环糊精选自α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精中的一种或多种，优选β-环糊精。
[0015]
所述生物缓冲剂选自2-(n-吗啉)乙磺酸、二(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷、2-[(2-氨基乙基)氨基]乙磺酸钠、哌嗪-n,n
’-
二(2-乙磺酸)、3-(n-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、3-(n-吗啉)丙磺酸、n-(2-羟乙基)哌嗪-n
’-
(2-乙磺酸)中的一种或多种，优选n-(2-羟乙基)哌嗪-n
’-
(2-乙磺酸)。
[0016]
所述消化剂组合物还包括高渗剂。
[0017]
优选地，所述高渗剂为中性盐，可选硫酸钠、氯化钠或者硫酸镁，优选氯化钠。
[0018]
本发明还提供了一种粘性生物样本的消化剂，包含前面任一项所述的消化剂组合物，还包含去离子水。
[0019]
所述消化剂中各组分的浓度为：蛋白酶的质量体积比浓度为0.1-1％，糖类的质量体积比浓度为0.5-1.5％，环糊精的质量体积比浓度为0.5-1.5％，生物缓冲剂的浓度为10-50mmol/l，增效剂的质量体积比浓度为0.1-0.5％，所述高渗剂在消化剂水溶液中的质量体积比浓度为0-6％。
[0020]
优选地，所述高渗剂在消化剂中的质量体积比浓度为3-6％。高渗剂并不是本发明消化剂的必要组分，可以进一步添加高渗剂保障启封后不因空气中杂菌落入而污染失效。
[0021]
本发明还提供了前述的粘性生物样本的消化剂的制备方法：取稳定剂、增效剂和高渗剂溶于去离子水中，调节ph值至7.2-7.4，然后加入蛋白酶，搅拌至全部溶解，即得。
[0022]
本发明的有益效果是：
[0023]
本发明采用新的蛋白酶取代传统消化剂中的胰蛋白酶，采用的新酶的作用位点与胰蛋白酶相似、ph适应范围更广、液体中常温下稳定、可商购直接获得且成本可接受；通过稳定剂增强酶液的稳定性；通过增效剂增强消化效果，增效剂能络合黏蛋白间的金属离子，保障了本发明消化剂优良的消化效果。进一步地，添加高渗剂，保障启封后不因空气中杂菌落入而污染失效。
[0024]
本发明的消化剂制备为水溶液后，液态稳定、不需用户使用前复配、不损伤病原菌、可常温保存、在病原菌最适ph范围内起效、可通用于不同检测项目，并在启封后能抵御环境微生物对试剂的污染。
附图说明
[0025]
图1是本发明的消化剂溶液对粘性样本消化的肉眼观察结果，其中，a为生理盐水处理的痰块，b为消化剂溶液消化的痰块。
[0026]
图2是本发明的消化剂溶液对粘性样本消化效果的显微观察结果，其中，a为未消化的痰涂片，b为消化后的痰涂片。
[0027]
图3是本发明的消化剂溶液处理粘性样本对苛养菌的培养检测结果，其中，a为生理盐水对照组培养，b为酶共育试验组培养。
具体实施方式
[0028]
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
[0029]
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0030]
主要试剂来源
[0031]
木瓜蛋白酶：cas号9001-73-4
[0032]
胰蛋白酶：cas号9002-07-7
[0033]
组织蛋白酶b：cas号9047-22-7
[0034]
枯草杆菌蛋白酶：cas号9014-01-1
[0035]
蛋白酶k:cas号：39450-01-6
[0036]
海藻糖：cas号99-20-7
[0037]
β-环糊精：cas号7585-39-9
[0038]
α-环糊精：cas号10016-20-3
[0039]
γ-环糊精：cas号17465-86-0
[0040]
n-(2-羟乙基)哌嗪-n
’-
(2-乙磺酸)：cas号7365-45-9
[0041]
2-(n-吗啉)乙磺酸：cas号145224-94-8
[0042]
二(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷：cas号6976-37-0
[0043]
3-(n-吗啉)丙磺酸：cas号1132-61-2
[0044]
乙二胺四乙酸二钠：cas号139-33-3
[0045]
以上试剂均为本领域常规试剂，可商购获得。
[0046]
流感嗜血杆菌：atcc10211，商购获得。
[0047]
其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，也可商购获得。
[0048]
实施例1配制实验样品
[0049]
一、配制本发明的消化剂溶液，取如下质量或体积的组分进行配制：
[0050][0051]
先将木瓜蛋白酶外的溶质溶解定容，调节ph值至7.2-7.4，再加入木瓜蛋白酶，搅拌至全部溶解，0.22um孔径的微孔滤膜过滤除菌，当日使用或2-8℃冷藏备用。
[0052]
二、对照样品胰蛋白酶液的配制，其各组分及用量如下：
[0053][0054]
先将胰蛋白酶外的溶质溶解定容，测ph值应为7.8
±
0.1，再加入胰蛋白酶，搅拌至
全部溶解，0.22um孔径的微孔滤膜过滤除菌，当日使用或2-8℃冷藏备用。
[0055]
三、对照样品生理盐水的配制
[0056]
氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀ
8.5g
[0057]
去离子水
ꢀꢀꢀ
1000ml
[0058]
将氯化钠溶解后定容，0.22um的微孔滤膜过滤除菌，当日使用或2-8℃冷藏备用。
[0059]
实施例2实验样品对粘性样本消化性能试验
[0060]
一、痰消化试验
[0061]
1)取临床痰液标本，加5ml的无菌生理盐水，摇晃数次，吸走痰块周边的所有液体；
[0062]
2)重复步骤1)两次，得到实验用痰块；
[0063]
3)将痰块分为3等份，用实施例1的3种实验样品(本发明的消化剂、对照样品胰蛋白酶液、对照样品生理盐水)分别进行消化实验，实验样品加入量如表1所示(痰块和消化液等体积加入)；
[0064]
表1
[0065][0066]
4)消化，不断振荡，并分别在测试液加入后10min、20min、30min肉眼观察痰块消化效果。
[0067]
结果：1-2号管的消化效果随着共育时间延长而逐渐明显，3号管则一直未见变化。表2为共育30min的消化结果，处理效果对比如图1所示。结果表明，消化剂溶液与胰蛋白酶液的消化效果相同，生理盐水没有消化效果。
[0068]
表2
[0069]
管号123消化效果好好无
[0070]
消化效果判断标准如下：
[0071]
好：搅拌后液体均匀浑浊，无肉眼可见痰团块
[0072]
中：搅拌后液体浑浊，见少量痰团块
[0073]
差：搅拌后液体微浊，见大量痰团块
[0074]
无：搅拌后液体清亮，痰团块无分散迹象
[0075]
二、痰消化前后涂片显微观察试验
[0076]
按照如下步骤操作：
[0077]
1)接种环挑取消化处理30min后的痰液在载玻片上涂抹成硬币大小的区域；
[0078]
2)自然干燥
[0079]
3)火焰固定
[0080]
4)吖啶橙染液染色2min，水洗，自然干燥；
[0081]
5)生物荧光显微镜高倍镜观察。
[0082]
结果：如图2所示，消化前、生理盐水对照组可见大量网状粘液丝，细胞重叠；胰蛋白酶液对照组、本发明的消化剂溶液组均未见网状粘液丝，细胞单个分散。
[0083]
实施例3对苛养菌培养检测的影响试验
[0084]
按照如下步骤操作：
[0085]
1.流感嗜血杆菌菌种复苏生长至对数生长期；
[0086]
2.用无菌生理盐水调整到0.5mcf浊度；
[0087]
3.再用无菌生理盐水做1:1000稀释，然后分成2等份，一份加等体积本发明的消化剂溶液做为试验组，另一份加等体积生理盐水做对照组，37℃恒温共育；
[0088]
4.分别在共育10min、30min、60min的时间点，取样用无菌生理盐水做1:10稀释后，加10ul至巧克力平板培养基上，接种环不分区划线，使其均匀分散在整个平板表面，每组每个时间点均重复做3块平板；
[0089]
5.培养观察菌落数：37℃恒温培养48-72小时，观察计算菌落数。
[0090]
上述试验重复进行三次。
[0091]
结果：如图3、表3所示。与流感嗜血杆菌共育长达60min，试验组的菌落数与生理盐水对照组无明显差异，说明本发明的消化剂溶液对流感嗜血杆菌的生长活性无影响。
[0092]
表3
[0093][0094]
实施例4稳定性试验
[0095]
1.按实施例1配制本发明的消化剂溶液和对照胰蛋白酶液各1000ml；
[0096]
2.将消化剂溶液和对照胰蛋白酶液分别无菌分成各2份；
[0097]
3.4℃、室温(25℃)放置，在放置满1天、2天、3天、4天、5天、10天、20天、30天、45天时分别取本发明的消化剂溶液和对照胰蛋白酶液按实施例2进行试验。
[0098]
实验结果如表4所示，消化剂溶液4℃和室温放置45天，消化效果与新配无异。对照胰蛋白酶液4℃放置72小时，消化效果开始下降，放置5天完全无消化效果；胰蛋白酶液25℃放置48小时，消化效果开始下降，放置4天完全无消化效果。
[0099]
表4
[0100]
[0101][0102]
消化效果判断标准如下：
[0103]
好：表明搅拌后无肉眼可见痰团块，液体均匀浑浊，涂片观察未见粘液丝，细胞分散；
[0104]
中：表明搅拌后仍有肉眼可见痰团块，液体浑浊，涂片观察可见部分粘液丝，细胞多数分散，部分重叠。
[0105]
差：表明痰团块无消化迹象，痰团块与液体界限清晰，液体清亮，涂片见大量粘液丝，细胞重叠。
[0106]
实施例5
[0107]
配制消化剂溶液样品1-4，每个样品的具体组成如表5所示：
[0108]
表5
[0109][0110]
采用样品1-4按照实施例2方法进行“对粘性样本消化性能试验”，结果发现：样品1-4在消化痰液标本30min后，痰消化效果好，涂片染色观察未见粘液丝，细胞分散成单个，着色清晰，结果无差异。表明在有效浓度范围内，消化剂溶液对粘性样本消化性能一致。
[0111]
采用样品1-4按照实施例3进行“对苛养菌检测的影响试验”，结果发现，与流感嗜血杆菌共育长达60min，菌落数与生理盐水对照组均无明显差异，表明在有效浓度范围内，消化剂溶液对流感嗜血杆菌的生长活性无影响。
[0112]
采用样品1-4按照实施例4进行稳定性试验，室温放置45天，对粘性样本的消化性能与新配者无差别。结果表明，在有效浓度范围内，不同组合的样品的稳定性优良。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除