一种用于鉴定龙眼品种的SSR分子标记引物组及其应用的制作方法

一种用于鉴定龙眼品种的ssr分子标记引物组及其应用
技术领域
[0001]
本发明属于分子生物学的技术领域，具体涉及一种用于鉴定龙眼品种的ssr分子标记引物组及其应用。


背景技术：

[0002]
龙眼是我国南亚热带地区重要的经济果树之一，原产于我国南部和越南北部，栽培历史长达约2000年之久。世界上大约有400个龙眼栽培品种，其中我国有300个左右。我国在龙眼品种资源、产区分布、栽培面积和产量等方面都居世界首位，据国家龙眼龙眼产业技术体系统计，2018年，中国大陆龙眼栽培面积约413.97万亩，产量约157.21万吨，约占世界总产量的50％左右。
[0003]
龙眼被人们称为岭南四大名果之一，其果实不仅香甜可口，而且营养价值很高，桂圆富含丰富的葡萄糖、蔗糖、蛋白质、多种维生素和矿物质，其中烟酸和维生素k的含量之高是其他水果罕有的。龙眼除了可以鲜食之外，还可以加工制成食品，比如龙眼干、龙眼罐头、龙眼酒、龙眼汁等。另外，龙眼果肉的药用价值也是出了名的，不仅可以治疗贫血、心悸、失眠健忘等症状，而且还有抗衰老、抗癌等功效，自古被人们视为滋补及保健药品。
[0004]
然而，长期以来，我国龙眼品种市场的监管处于空缺状态，修饰性、模仿性和低水平重复品种多，“一品多名”、“多品一名”以及假冒侵权等现象时有发生，因此加强龙眼植物新品种保护，维护公平竞争的市场环境，是解决上述难题激励龙眼育种创新的关键一招。而准确、快速进行农作物品种的鉴定，对于农作物品种保护、真假品种辨别、品种的产权纠纷等方面均有重要作用。传统的品种鉴定方法是田间种植鉴定，是将鉴定品种种植在相同的生长条件下，在生长发育的各个阶段对多个质量性状、数量性状及抗病性等做出观察记载，并进行品种比较，鉴定品种的异同。传统品种鉴定方法存在鉴定周期长、易受环境影响、测试性状多、工作量大等问题，无法适应大量品种的鉴定需求。
[0005]
dna分子标记是根据生物个体间基因组dna序列丰富的变异为基础的遗传标记，可以直接反映生物个体在dna水平上的遗传多态性，也是继形态学标记、细胞学标记和生化标记之后的最为可靠的遗传标记技术。分子标记检测技术具有测试周期短、不受环境影响和季节限制、没有组织特异性、供选择的标记数量多、可以进行高通量测试分析等优势，已逐步用于品种鉴定、种子纯度及品种真实性检测中。利用rapd、aflp、issr标记，可以将不同生态类型的龙眼品种区别开。但是，rapd重复性较差；aflp操作较复杂，稳定性较差；issr标记大多是显性标记，不能有效区分显性纯合基因型和杂合基因型。ssr(simple sequence repeats)是以1-6个核苷酸为单位、呈串联重复的dna序列，广泛分布于真核生物基因组中。


技术实现要素：

[0006]
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于鉴定龙眼品种的ssr分子标记引物组及其应用，所述用于鉴定龙眼品种的ssr分子标记引物组具有扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富的优点，可有效用于龙眼遗传多样性分析、品种鉴定、dna指纹图谱构建等研
究。
[0007]
本发明的技术内容如下：
[0008]
本发明提供了一种用于鉴定龙眼品种的ssr分子标记引物组，所述ssr分子标记引物组包括24对龙眼ssr引物，所述24对龙眼ssr引物中的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如序列表中seq id no.1～seq id no.48所示。
[0009]
所述用于鉴定龙眼品种的ssr分子标记引物组应用于龙眼品种区分鉴定以及dna指纹图谱构建；
[0010]
所述用于鉴定龙眼品种的ssr分子标记引物组应用于龙眼遗传多样性分析。
[0011]
本发明还提供了一种所述ssr分子标记引物组用于鉴定龙眼品种的方法，包括如下步骤：
[0012]
1)提取龙眼品种的dna；
[0013]
2)以步骤1)提取的dna为模板，选取表型差异最大的10种龙眼品种，选取多态性最丰富的且带型清晰的引物，筛选出24组ssr分子标记引物；
[0014]
3)利用24组ssr分子标记引物对龙眼品种进行pcr扩增以及毛细管电泳，进行树状分析判定，品种间差异位点数≥3为不同品种，品种间差异位点数＜3为近似品种或者相同品种。
[0015]
步骤1)所述提取龙眼品种的dna的方法包括：
[0016]
a)预热ctab抽提液和β-巯基乙醇的混合物；
[0017]
b)取龙眼的嫩绿叶片，置于预冷过的研钵中，加入pvp进行快速研磨得粉末；
[0018]
c)将研磨得到的粉末加入到步骤a)的混合物中，混匀，吸取上清液，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合物，离心；
[0019]
d)吸取步骤c)离心后的上清液加入苯酚、氯仿和异戊醇的混合物，离心；
[0020]
e)吸取步骤d)离心后的上清液加入醋酸钠和无水乙醇，离心，收集沉淀；
[0021]
f)洗涤沉淀，溶解，离心，获取沉淀，备用。
[0022]
步骤a)所述ctab抽提液的配方成分包括十六烷基三乙基溴化铵、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠盐溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液以及聚乙烯吡咯烷酮。
[0023]
本发明的有益效果如下：
[0024]
本发明通过筛选出的24对ssr核心引物用于区分龙眼品种，所得ssr引物在龙眼中扩增的带型清晰容易判读，同时适合普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测平台和毛细管荧光检测平台检测，所述ssr引物的多态性高且扩增重复性好；
[0025]
本发明的ssr引物应用于龙眼遗传多样性分析、品种区分鉴定、dna指纹图谱构建等领域，有利于保护育种者、生产者和消费者的合法权益，促进龙眼遗传育种水平的提高和龙眼产业的发展。
附图说明
[0026]
图1为引物在龙眼中检测的多态性；
[0027]
图2为24组引物对63个品种的聚类图。
具体实施方式
[0028]
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
[0029]
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
[0030]
实施例
[0031]
一种用于鉴定龙眼品种的方法：
[0032]
1)龙眼基因组dna的提取
[0033]
a)63份龙眼品种材料
[0034]
表1 63份龙眼品种
[0035]
[0036][0037]
b)ctab法提取基因组dna
[0038]
(1)先提前加热水浴锅到65℃，加入1.5ml 3％的ctab抽提液和48ulβ-巯基乙醇，混匀后放入水浴锅中预热。
[0039]
(2)称取0.5g叶片，放入提前用液氮预冷过的研钵中，快速少量pvp，然后加入液氮快速研磨，直至样品呈粉末状。
[0040]
(3)将磨好的样品快速倒入装有提前预热过的ctab抽提液，上下颠倒摇匀，放入65℃的水浴锅中水浴1h，中间每隔5min轻轻摇匀1次，4℃，8000rpm离心6min，剩余步骤均在冰上进行。
[0041]
(4)吸取1ml上清液小心地转入新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，颠倒混匀，在4℃条件下，12000rmp离心10min。
[0042]
(5)吸取800ul上清液转入新的2ml离心管中，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，在4℃条件下，12000rmp离心10min。
[0043]
(6)吸取600ul上清液转入新的2ml离心管中，加入1/10体积3m醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，放到-20℃。2h以上(也可以过夜)，6000rmp离心3min收集沉淀。
[0044]
(7)用70％的乙醇洗涤2-3次(洗一次要离心一次，再洗，再离)，风干30min，溶于50ul dd水(含10ng/ul rnasea，用1000ul的dd水+2ul rnasea配置)中，55℃水浴30min，离心，将沉淀转入1.5ml离心管中，-20℃保存备用。
[0045]
其中，dna提取液(ctab抽提液)的配方为：分别称取20.0g十六烷基三乙基溴化铵
和81.82g氯化钠放入烧杯中，然后加入40ml乙二胺四乙酸二钠盐溶液(ph8.0)、100ml 1mol/l三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(ph8.0)和10.0g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，再加入800ml去离子水，65℃水浴中加热溶解，冷却后定容至1000ml。在103.4kpa(121℃)条件下灭菌20min，于4℃保存。
[0046]
2)龙眼基因组ssr引物的筛选
[0047]
根据表型差异，在63份龙眼中选择出表型差异最大的10份龙眼品种，用于检测龙眼基因组ssr标记的扩增情况及多态性。
[0048]
采用合成查阅得到的300对引物，以上述10份龙眼材料的基因组dna进行扩增，根据扩增结果，筛选可稳定扩增、带型清晰且多态性丰富的引物。
[0049]
根据筛选结果，选取多态性最丰富且带型清晰的引物，如图1所示，其中a、b图分别为引物ly24、ly58在龙眼中检测的多态性，从图中可以看出：引物的多态性丰富且带型清晰；
[0050]
所得ssr引物共24对，如表2以及序列表所示。
[0051]
表2 24组引物对及其序列
[0052]
[0053][0054]
3)利用24组ssr引物对对63份龙眼品种进行pcr扩增以及毛细管电泳
[0055]
a)pcr扩增反应体系共10μl，其中包括10ng/μl dna模板1μl，2
×
power taq pcr master mix 5μl，4μmol/l ssr上下游引物各1μl和2μl超纯水；
[0056]
pcr程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-65℃退火30s，72℃30s，35个循环；
72℃延伸10min，4℃保存。
[0057]
b)毛细管电泳按照以下步骤进行：将每个品种的pcr产物用1xte buffer稀释12倍，然后吸取24μl加入到毛细管电泳仪的95个专用深孔板孔中，板中第96个孔分别加入24μl liz500分子量内标，最后将板放入fragment analyzer全自动毛细管电泳仪中(fsv2-ce，aati，usa)进行检测。除待测样品外，每个ssr位点还应同时包括3～4个参照品种的扩增产物。
[0058]
分析毛细管电泳结果。根据参照品种的扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小。纯合位点的等位变异记录为x/x，杂合位点的等位变异记录为x/y，其中x、y为该位点上两个不同的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后，缺失记录为-/-，多个位点的数据整合在一起形成不同龙眼品种的ssr指纹图谱，如表3所示。
[0059]
表3-1不同龙眼品种的ssr指纹图谱
[0060]
[0061]
[0062][0063]
表3-2不同龙眼品种的ssr指纹图谱
[0064]
[0065][0066]
依据24对ssr引物的检测结果进行判定：品种间差异位点数≥3为不同品种；品种
间差异位点数<3为近似品种，形成鉴定结果。比较63份品种的指纹数据，发现只有两个品种差异位点数小于3，其他任两个品种间的差异位点数都大于3，说明这24对核心引物可以有效的把这些品种鉴别开。
[0067]
利用popgen32软件计算引物的等位基因数(na)、基因多样性指数(he)、多态性信息量(pic)。利用ntsys-pc v2.10e软件计算品种间的遗传相似系数，用upgma法进行聚类分析，绘制树状图(图2)；
[0068]
从图2中可以看出：大多数品种的遗传相似性系数小于0.92，可以把所有品种区别开，即表明本发明所述ssr分子标记引物能够有效用于龙眼的品种鉴定。

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