一株哈茨木霉SQ-18菌株及其在防治草坪草病害中的应用的制作方法

一株哈茨木霉sq-18菌株及其在防治草坪草病害中的应用
技术领域
[0001]
本发明属于生物防治技术领域。更具体地，涉及一株哈茨木霉sq-18菌株及其在防治草坪草病害中的应用。


背景技术：

[0002]
近年来，植物病原菌多样性和致病性均呈现不断增加的趋势，其原因不仅与气候变化引起的极端天气有关，还与大量除草剂、杀菌剂等农药的长期广泛使用有关，严重地影响着植物的生长、产量以及环境和生态安全。因此，国内外利用拮抗微生物防治植物病害的发生和危害已成为目前研究的重点和热点之一。
[0003]
木霉菌(trichoderma spp.)是真菌界，半知菌门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，木霉属真菌。它是自然界中普遍存在、且资源丰富的拮抗微生物，通过产生抗生素、细胞壁分解酵素等生物活性物质，或通过营养竞争、微寄生、以及诱导植物产生抗性等途径对植物病原真菌和细菌产生拮抗作用，从而达到防治植物病害的效果。自weindling于20世纪30年代首次发现木霉菌对植物病原菌具有拮抗作用以来，木霉菌作为生防因子逐渐被越来越广泛应用于植物病原菌的生物防治；例如，利用哈茨木霉防治大豆核盘菌，利用深绿木霉防治番茄根腐病菌等。现已有多种木霉菌生防产品登记注册，如美国的t22(哈茨木霉)和以色列的t39(哈茨木霉)等。因此，木霉菌在植物病害的生物防治和环境保护等领域展现了巨大的应用前景。
[0004]
草坪作为一种重要的绿地在美化环境、净化空气、保持水土以及提供户外活动和体育运动方面发挥着不可替代的重要作用，但草坪草病害是影响草坪各方面功能和可持续发展的重要因素，而目前仍以化学防治方法为主的草坪病害管理和防治措施是限制其健康发展的主要因素之一。草坪草病害的生物防治是当今草坪管理技术的研究热点，以菌治病其优越性在于资源丰富、选择性强、无残留、无污染、成本低、兼防兼治、对保持生态平衡起到长效的作用；但是，国内外研究木霉菌在草坪草病害防治方面的研究相对较少，仅有报道哈茨木霉在防治草坪镰刀枯萎病(公开号为cn103952320a、公开日为2014年7月30日的中国发明专利)和草坪褐斑病(公开号为cn103952321a、公开日为2014年7月30日的中国发明专利)中的应用。因此，继续挖掘与探索对草坪草病原菌具有生防效果的木霉菌资源，对于草坪草病害的防治具有重要意义。


技术实现要素：

[0005]
本发明要解决的技术问题是克服现有草坪草病害防治方法的缺陷和不足，提供一株哈茨木霉sq-18菌株及其在防治草坪草病害中的应用。
[0006]
本发明的目的是提供一株哈茨木霉sq-18菌株。
[0007]
本发明另一目的是提供所述哈茨木霉sq-18菌株在防治由草坪草病原菌引起的病害或制备草坪草病害防治制剂中的应用。
[0008]
本发明另一目的是提供所述哈茨木霉sq-18菌株的次生代谢产物在防治由草坪草
病原菌引起的病害或制备草坪草病害防治制剂中的应用。
[0009]
本发明另一目的是提供所述哈茨木霉sq-18菌株的菌液粗体物在防治由草坪草病原菌引起的病害或制备草坪草病害防治制剂中的应用。
[0010]
本发明另一目的是提供一种草坪草病害防治制剂。
[0011]
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0012]
本发明提供了一株哈茨木霉sq-18菌株，该菌株已于2018年7月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为gdmcc no：60422，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0013]
本发明研究发现，哈茨木霉sq-18菌株对玉蜀黍丝核菌和地衣状伏革菌的抑制率高达100％，对灰葡萄孢菌、地毯草炭疽菌和立枯丝核菌的抑制率大于80％，对供试病原菌的平均抑制率高达72.8％；哈茨木霉sq-18菌株的次生代谢产物对草坪草币斑病菌、球黑孢霉和地衣状伏革菌拮抗作用较强；哈茨木霉sq-18菌株的菌液粗体物对草坪草币斑病菌和佩立金平脐蠕孢的抑制率相对较高；因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：
[0014]
所述哈茨木霉sq-18菌株在防治由草坪草病原菌引起的病害或制备草坪草病害防治制剂中的应用。
[0015]
优选地，所述草坪草病原菌为玉蜀黍丝核菌、地衣状伏革菌、灰葡萄孢菌、地毯草炭疽菌或立枯丝核菌中的任意一种或几种。
[0016]
所述哈茨木霉sq-18菌株的次生代谢产物在防治由草坪草病原菌引起的病害或制备草坪草病害防治制剂中的应用。
[0017]
优选地，所述草坪草病原菌为草坪草币斑病菌、球黑孢霉或地衣状伏革菌中的任意一种或几种。
[0018]
所述哈茨木霉sq-18菌株的菌液粗体物在防治由草坪草病原菌引起的病害或制备草坪草病害防治制剂中的应用。
[0019]
优选地，所述草坪草病原菌为草坪草币斑病菌或佩立金平脐蠕孢。
[0020]
本发明还提供了一种草坪草病害防治制剂，包括所述哈茨木霉sq-18菌株、或其次生代谢产物、或其菌液粗体物。
[0021]
优选地，所述草坪草病害为由玉蜀黍丝核菌、地衣状伏革菌、灰葡萄孢菌、地毯草炭疽菌、立枯丝核菌、草坪草币斑病菌、球黑孢霉或佩立金平脐蠕孢引起的病害。
[0022]
本发明具有以下有益效果：
[0023]
本发明提供了一株哈茨木霉sq-18菌株及其在防治草坪草病害中的应用。本发明发现哈茨木霉sq-18菌株可通过产生抑菌圈侵占草坪草病原菌的生长空间，覆盖和深入病原菌内部与其相互缠绕使得病原菌菌丝变细、缢缩甚至断裂，亦或是直接穿入病原菌菌丝内部吸取营养致使菌丝细胞溶解；该哈茨木霉sq-18菌株对玉蜀黍丝核菌和地衣状伏革菌的抑制率高达100％，对灰葡萄孢菌、地毯草炭疽菌和立枯丝核菌的抑制率大于80％，对供试病原菌的平均抑制率高达72.8％；哈茨木霉sq-18菌株的次生代谢产物对草坪草币斑病菌、球黑孢霉和地衣状伏革菌拮抗作用较强；哈茨木霉sq-18菌株的菌液粗体物对草坪草币斑病菌和佩立金平脐蠕孢的抑制率相对较高；因此，所述哈茨木霉sq-18菌株、或其次生代谢产物、或其菌液粗体物在防治由草坪草病原菌引起的病害或制备草坪草病害防治制剂中，均具有广泛的应用前景。
附图说明
[0024]
图1是4株木霉菌对14株草坪草病原菌的拮抗效果图；其中，(a)图为对峙培养第5d时4种木霉菌与14种草坪草病原菌平板生长状况；(b)图为对峙培养第5d时4种木霉菌对14种草坪草病原菌的抑制率，图中数字表示标准差，同列不同小写字母表示同一木霉菌株下不同病原菌株间差异显著(p<0.05)；(c)图为4种木霉菌对14种草坪草病原菌的总体抑制率，*表示平均值。
[0025]
图2是sq-18菌株的形态图；其中，(a)图为产孢细胞的形态图；(b)图为分子孢子的形态图；图中标尺为10μm。
[0026]
图3是哈茨木霉sq-18菌株对草坪草病原菌菌丝的作用方式图；其中，(a)图为哈茨木霉sq-18菌株菌丝缠绕在病原菌菌丝体上的状态图；(b)图为哈茨木霉sq-18菌株使得病原菌菌丝变细、缢缩的状态图；(c)图为哈茨木霉sq-18菌株导致病原菌菌丝断裂的状态图；(d)图为哈茨木霉sq-18菌株穿入病原菌菌丝体内的状态图；(e)图为哈茨木霉sq-18菌株寄生在病原菌菌丝表面的状态图；(f)图为哈茨木霉sq-18菌株使得病原菌菌丝细胞降解的状态图；图中标尺为20μm。
[0027]
图4是哈茨木霉sq-18菌株的次生代谢产物与其菌液粗提物对草坪草病原菌的拮抗效果图；其中，(a)图为哈茨木霉sq-18菌株的次生代谢产物对草坪草病原菌的拮抗效果图；(b)图为哈茨木霉sq-18菌株的菌液粗提物对草坪草病原菌的拮抗效果图。
具体实施方式
[0028]
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0029]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0030]
实施例1哈茨木霉(trichoderma harzianum)sq-18菌株的筛选和鉴定
[0031]
1、实验方法
[0032]
供试4株木霉菌株编号为：sq-18(海南，三亚，神泉国际高尔夫球场)、sq-1q-15(海南，三亚，神泉国际高尔夫球场)、bd-1f-1(海南，万宁，神州半岛高尔夫球场)、bd-2q-12(海南，万宁，神州半岛高尔夫球场)，供试草坪草病原菌信息如表1所示。
[0033]
表1供试草坪草病原菌信息
[0034]
[0035][0036]
(1)菌种活化
[0037]
将4℃低温保存于斜面的4株木霉菌和14株草坪草病原菌分别接种于pda培养基进行活化，置于25℃恒温培养箱中培养培养5天后备用。
[0038]
(2)对峙培养法测定抑菌活性
[0039]
用记号笔在pda培养基平板背面分别标示对峙培养木霉菌和病原菌所处具体位置(木霉菌和病原菌以培养皿中线相对称，间隔3cm)，然后在无菌条件下，用灭菌打孔器(d＝5mm)分别对生长良好的4株木霉菌和14种病原菌进行打孔取样，用接种针挑取菌饼并分别接种于已标示好位置的pda培养基表面进行对峙培养，每个平板上接种一种木霉和一种病原菌。对照只在病原菌位置接种病原菌菌饼，每个对峙实验及其对照均设4个重复。置于25℃恒温培养箱中培养，每天观察并记录木霉菌和病原菌的对峙生长情况，并于第3d开始采用“十字交叉法”测量各处理组和对照菌落半径并拍照，每天测定1次，连续测定4d，根据以下生长抑制率公式计算生长抑制率。
[0040]
式中gi为生长抑制率(％)，d0为对照菌落半径，d
t
为处理菌落半径。
[0041]
(3)sq-18菌株鉴定
[0042]
形态学鉴定：sq-18菌株活化后，在25℃条件下培养7d后，观察菌株生长速度、菌落颜色及表面特征等，在显微镜下观察菌丝、产孢细胞、孢子等菌株的形态特征。
[0043]
分子生物学鉴定：将sq-18菌株活化后于25℃培养箱培养1周，用无菌载玻片将菌丝刮下，充分研磨后，用ctab法提取病原菌基因组dna并保存于-20℃冰箱内。利用rdna-its区通用引物its-1(5
′-
tccgtaggtgaacctgcgg-3
′
)和its-4(5
′-
tcctccgcttattgatatgc-3
′
)，以4株木霉菌真菌基因组为模板进行pcr扩增。pcr扩增体系：10
×
pcr buffer 5μl，dntp mixture 4μl，20μmol/l引物各1μl，5u/μl taq酶0.25μl，模板dna 1μl，加灭菌双蒸水至50μl。pcr反应条件：94℃预热4min；94℃30s，62℃30s，72℃1min，共34个循环；72℃延伸5min。将所有pcr产物分别加入1.0％的琼脂糖凝胶中进行电泳，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像仪检测。将pcr产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行dna测序。将测得的its序列，提交至ncbi核酸数据库中获得genbank登录号，同时利用genebank数据库中的blastn软件进行比对和同源性分析。最后将分析结果结合形态学特征对木霉菌进行鉴定。
[0044]
2、实验结果
[0045]
4株木霉菌对14株草坪草病原菌的拮抗效果如图1所示，其中，(a)图为对峙培养第5d时4种木霉菌与14种草坪草病原菌平板生长状况，(b)图为对峙培养第5d时4种木霉菌对14种草坪草病原菌的抑制率，(c)图为4种木霉菌对14种草坪草病原菌的总体抑制率；可以看出，对峙培养第2d时，4株木霉菌菌丝开始与病原菌菌丝相互接触；第5d时，与对照相比，4株木霉菌株对14种供试病原真菌均具有不同程度的拮抗效果；其中，sq-18菌株的拮抗作用最明显。4株木霉菌对地衣状伏革菌(laetisaria fuciformis,lf)的抑制作用最强，均高达100％；其次是对玉蜀黍丝核菌(rhizoctonia zeae,rz)有较强抑制作用，其中sq-18菌株和菌株bd-1f-1对玉蜀黍丝核菌的抑制率均高达100％。
[0046]
另外，除了地衣状伏革菌和玉蜀黍丝核菌外，4株木霉菌对其余12种供试病原菌抑制效果也较为明显，sq-18菌株对立枯丝核菌(r.solani,rs)、地毯草炭疽菌(colletotrichum hainanese,ch)、雀稗微座孢(microdochium paspali,mp)、球黑孢霉(nigrospora sphaerica,ns)和佩立金平脐蠕孢(bipolaris peregianensis,bp)的抑制作用最强，抑制率分别为95.5％、88.5％、78.0％、61.6％和59.0％；sq-18菌株q-15对草坪草币斑病病原菌(sclerotinia homoeocarpa,sh)的抑制作用最强，抑制率为79.4％；菌株bd-1f-1对草坪墨斑病菌(curvularia malina,cm)、草茎点霉(phoma herbarum,ph)、新月弯孢霉(cu.lunata,cl)的抑制作用最强，抑制率分别为70.0％，55.4％和44.0％；菌株bd-2q-12对灰葡萄孢菌(botrytis cinerea,bc)、禾顶囊壳禾谷变种(gaeumannomyces graminis var.graminis,gg)和木贼镰刀菌(fusarium equiseti,fe)的抑制作用最强，抑制率分别为92.15％，81.9％和69.2％。
[0047]
以上结果表明：sq-18菌株对供试14种病原菌的平均抑制效果最强，其对玉蜀黍丝核菌和地衣状伏革菌的抑制率高达100％，对灰葡萄孢菌、地毯草炭疽菌和立枯丝核菌的抑制率大于80％，对供试病原菌的平均抑制率高达72.8％，且均值离散度适中，分布密度相对均一。
[0048]
sq-18菌株的形态图如图2所示，其中，(a)图为产孢细胞的形态图；(b)图为分子孢子的形态图；可以看出，sq-18菌株在pda培养基上活化后，气生菌丝生长迅速。菌落初期为白色，毡状，后期孢子簇大量形成，变为浅绿色，致密地平铺在培养基平板上，背面黄绿色或金黄色。分生孢子梗排列呈典型的金字塔形结构，初级分枝间隔分布，成对且大量再分枝。瓶梗细胞单生或2～5个轮生，烧瓶形至安瓿形。分生孢子近球形或椭球形，表面光滑，淡绿色，老熟后呈深绿色，根据以上形态特征，初步将该sq-18菌株鉴定为哈茨木霉(trichoderma harzianum)。
[0049]
sq-18菌株测序所得its片段长度为595bp，序列经genbank网站blastn比对分析，发现与多个哈茨木霉(trichoderma harzianum)序列(mk738145,mn658589,mn602615)相似度很高，结合形态学特征进一步将其鉴定为哈茨木霉(trichoderma harzianum)，命名为哈茨木霉(trichoderma harzianum)sq-18菌株，并于2018年7月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为gdmcc no：60422，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0050]
实施例2哈茨木霉sq-18菌株的抑菌效果测定
[0051]
1、实验方法
[0052]
(1)拮抗等级测定
[0053]
木霉菌菌落完全占据整个培养皿，即占据面积＝100％，等级为ⅰ；3/4<木霉菌菌落占据培养皿面积<1，等级为ⅱ；2/3<木霉菌菌落占据培养皿面积<3/4，等级为ⅲ；1/3<木霉菌菌落占据培养皿面积<2/3，等级为ⅳ；0<木霉菌菌落占据培养皿面积<1/3，等级为
ⅴ
；病原菌菌落占据培养皿面积为100％，等级为
ⅵ
。
[0054]
(2)抑菌作用机理显微观察
[0055]
在无菌条件下，用移液器吸取1ml无菌pda培养基，均匀涂抹于载玻片上，制成一层pda培养基薄膜。待载玻片上的培养基凝固后，在载玻片两端分别接种哈茨木霉sq-18菌株和14种草坪草病原菌，木霉与病原菌相距3cm，然后将载玻片置于无菌培养皿中，封膜后于25℃恒温培养箱中培养，每处理3个重复。培养3d后，当两菌落相互交接时，将载玻片置于光学显微镜下观察木霉菌与14种病原菌相互作用后菌落的形态特征，记录并拍照。
[0056]
(3)玻璃纸法测定抑菌活性
[0057]
将玻璃纸剪成直径大小9cm的圆片，经高压蒸汽灭菌后贴于pda培养基中央(直径＝9cm)。将哈茨木霉sq-18菌株菌饼接种于含有玻璃纸的培养基中央，25℃黑暗条件下培养。待木霉菌落接近玻璃纸边缘时，移除玻璃纸及整个菌落，并在培养皿中央接种各病原菌的菌饼。将病原菌接种于未经处理的pda培养基作为对照。每个处理及对照设置3次重复。每天观察各病原菌的生长状况，第三天开始测量病原菌的直径并拍照，根据生长抑制率公式计算抑菌效果。
[0058]
(4)木霉菌菌液粗提液测定抑菌活性
[0059]
用已灭菌的打孔器(d＝5mm)在活化的pda平板上取木霉菌饼，用接种针挑取菌饼并接种于含有150ml马铃薯葡萄糖液体培养基(pdb)的500ml三角瓶中，共接种10瓶，置于28℃、150r/min摇床振荡培养5d后，用无菌脱脂棉滤去菌丝，再用无菌滤纸过滤。在得到的菌液中加入等体积的乙酸乙酯浸泡24h后进行萃取，每瓶萃取3次后合并萃取液，并通过旋转蒸发仪在45℃进行浓缩，获得发酵液粗提物。用丙酮溶解粗提物，制备成溶液(10mg
·
ml-1
)，用移液枪在含有pda培养基的培养皿上均匀涂布10μl粗提取物溶液，然后在培养皿中心接种病原菌菌饼，用相同体积的丙酮溶液作为对照，置于恒温培养箱中，25℃黑暗条件下培养，每个处理重复3次。每天记录病原菌菌丝生长情况，第三天开始测量病原菌的直径并拍照，根据生长抑制率公式计算抑菌效果。
[0060]
2、实验结果
[0061]
(1)哈茨木霉sq-18菌株对14株草坪草病原菌的对峙培养拮抗作用观察及分析
[0062]
哈茨木霉sq-18菌株对14种病原菌生长的拮抗效果及等级如表2所示，可以看出，哈茨木霉sq-18菌株对供试的14种草坪草病原菌生长均有明显的抑制作用，但哈茨木霉sq-18菌株对不同的病原菌拮抗等级存在较大差异；其中，哈茨木霉sq-18菌株对地衣状伏革菌和玉蜀黍丝核菌的拮抗等级均为i级，即拮抗作用最强；对草坪草墨斑病菌、佩立金平脐蠕孢、立枯丝核菌、地毯草炭疽菌、灰葡萄孢菌、禾顶囊壳禾谷变种、雀稗微座孢的拮抗等级为ⅱ级；对木贼镰刀菌和核盘菌的拮抗等级为ⅲ级；对新月弯孢霉、球黑孢霉、草茎点霉的拮抗等级为ⅳ级。
[0063]
表2哈茨木霉sq-18菌株对14种病原菌生长的拮抗效果及等级
[0064]
[0065][0066]
(2)哈茨木霉sq-18菌株对草坪草病原菌抑菌作用机理的显微观察
[0067]
哈茨木霉sq-18菌株对草坪草病原菌菌丝的作用方式如图3所示，其中，(a)图为哈茨木霉sq-18菌株菌丝缠绕在病原菌菌丝体上的状态图；(b)图为哈茨木霉sq-18菌株使得病原菌菌丝变细、缢缩的状态图；(c)图为哈茨木霉sq-18菌株导致病原菌菌丝断裂的状态图；(d)图为哈茨木霉sq-18菌株穿入病原菌菌丝体内的状态图；(e)图为哈茨木霉sq-18菌
株寄生在病原菌菌丝表面的状态图；(f)图为哈茨木霉sq-18菌株使得病原菌菌丝细胞降解的状态图；可以看出，哈茨木霉sq-18菌株对14种病原菌的抑制作用方式相似，主要是在两种真菌相互接触后，哈茨木霉sq-18菌株迅速侵入病原菌生长空间，而后哈茨木霉sq-18菌株菌丝通过缠绕在病原菌菌丝体上，与病原菌交错在一起，使病原菌菌丝变细、缢缩；严重时甚至导致病原菌菌丝断裂、或穿入病原菌菌丝体内或寄生在菌丝表面，使病原菌菌丝细胞原生质浓缩，直至最后病原菌菌丝细胞降解。
[0068]
以上结果表明：哈茨木霉sq-18菌株可通过产生抑菌圈侵占草坪草病原菌的生长空间，覆盖和深入病原菌内部与其相互缠绕使得病原菌菌丝变细、缢缩甚至断裂，亦或是直接穿入病原菌菌丝内部吸取营养致使菌丝细胞溶解。
[0069]
(3)哈茨木霉sq-18菌株的次生代谢产物与其菌液粗提物对草坪草病原菌的拮抗效果
[0070]
哈茨木霉sq-18菌株的次生代谢产物与其菌液粗提物对草坪草病原菌的拮抗效果图如图4所示，其中，(a)图为哈茨木霉sq-18菌株的次生代谢产物对草坪草病原菌的拮抗效果图；可以看出，与对照相比，哈茨木霉sq-18菌株的次生代谢产物对除立枯丝核菌外的13个病原菌的生长均有拮抗效果，表明哈茨木霉sq-18菌株生长过程中透过玻璃纸产生的次生代谢产物对立枯丝核菌无拮抗作用，对其它13种病原菌均有不同程度的抑制作用，且对同一病原菌的抑制率随着培养时间而发生变化。病原菌培养3天后，哈茨木霉sq-18菌株对草坪草币斑病病原菌、球黑孢霉的拮抗作用较强，其相对抑制率最高时分别高达91.77％、89.80％；当培养到第5d时，抑制率分别为89.63％、76.83％；其中，在第3d时对玉蜀黍丝核菌的抑制率为37.8％，而在第4天和第5天时其抑制率则降为0％。
[0071]
另外，哈茨木霉sq-18菌株的菌液粗提物对草坪草病原菌的拮抗效果图如图3中的(b)图所示，可以看出，由乙酸乙酯萃取、旋转蒸发仪浓缩蒸干得到的哈茨木霉sq-18菌株的菌液粗提物对14种草坪草病原菌的抑制效果不明显，抑制率均在50％以下；对各病原菌抑制效果也存在差异，其中，对草坪草币斑病菌和佩立金平脐蠕孢的抑制率相对较高，分别为43.60％和42.91％；对新月弯孢霉、草茎点霉和球黑孢霉的抑制率较低，均小于5％；而对立枯丝核菌和玉蜀黍丝核菌无抑制效果。
[0072]
以上结果表明：哈茨木霉sq-18菌株能产生对草坪草病原菌有抑制活性的拮抗化合物，其中玻璃纸法产生的哈茨木霉sq-18菌株的次生代谢产物(拮抗物质)对草坪草币斑病菌、球黑孢霉和地衣状伏革菌拮抗作用较强，接种3d后，其相对抑制率分别高达91.77％、89.80％和79.59％；哈茨木霉sq-18菌株的菌液粗体物对草坪草币斑病菌和佩立金平脐蠕孢的抑制率相对较高，分别为43.60％和42.91％。
[0073]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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