特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠的构建方法及其应用与流程

特异性表达hmrgprx4的转基因大鼠的构建方法及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种特异性表达hmrgprx4的转基因大鼠的构建方法及其应用。


背景技术：

[0002]
慢性肝病患者常伴有难以忍受的瘙痒，高达60％的原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,pbc)患者有慢性瘙痒的症状，严重影响患者的生活质量。但目前仍然缺乏缓解或治疗该瘙痒的有效药物。最近研究表明，人源mrgprx4介导胆酸引起的胆汁淤积性瘙痒。胆酸(cholic acid,ca)及其衍生物可以激活hmrgprx4；患有瘙痒症状的慢性肝病患者血清中胆酸含量显著高于正常人；胆酸以及hmrgprx4的激动剂可以在健康人皮肤中引起明显的瘙痒。因此，hmrgprx4是治疗人胆汁淤积性瘙痒的药物靶点，hmrgprx4的拮抗剂将是治疗这类瘙痒的备选药物。
[0003]
目前开发治疗瘙痒药物面临的技术瓶颈主要在于，人与模式动物的痒觉感受存在分子机制的差异，使其缺乏有效的动物模型。因此，动物实验中应用有效的药物在转向临床用于人类时往往无效。这种药物疗效的差异导致昂贵的临床前和临床研究失败。因此，特异性靶向人源蛋白/受体开发治疗疾病的药物将是今后药物开发的趋势。此外，对于开发治疗人胆汁淤积性瘙痒的药物，由于mrgprx4是灵长类特有的受体，在小鼠和大鼠中均没有功能同源的基因2，因此无法通过传统的遗传学方法，比如基因敲除，在模式动物中研究此基因的功能，以及在体筛选备选药物。
[0004]
因此，亟需建立合适的动物模型用于在体研究hmrgprx4的功能，筛选和验证hmrgprx4拮抗剂对瘙痒的抑制作用，鉴定引起瘙痒的胆酸类似物，以及筛选降低瘙痒副作用的胆酸衍生物。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种特异性表达hmrgprx4(人源mrgprx4)的转基因大鼠的构建方法及其应用。
[0006]
本发明的技术原理：人源胆酸受体mrgprx4可以介导胆汁淤积性瘙痒；大鼠的mrga受体标记大鼠drg痒觉神经元；通过mrgprx4激活大鼠drg痒觉神经元可以引起瘙痒。本发明利用crispr-cas9基因敲入技术，构建特异性表达hmrgprx4的转基因大鼠模型。此模型可以用于研究hmrgprx4介导痒觉感受的功能，筛选并验证hmrgprx4的拮抗剂，开发用于治疗胆汁淤积性瘙痒的药物。
[0007]
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种特异性表达hmrgprx4的转基因大鼠的构建方法，包括：
[0008]
a、构建crispr-cas9系统介导的大鼠mrga基因敲除且定点整合外源基因
①
的转基因大鼠品系i；其中，所述外源基因
①
是hmrgprx4基因和重组酶基因之间通过p2a自切割肽段序列(5
′-
gccaccaacttcagcctgctcaagcaggccggagatgtggaagagaaccccggccct-3
′
)连接而
成，且所述crispr-cas9系统靶向mrga阳性的大鼠drg神经元细胞；
[0009]
b、构建crispr-cas9系统介导的大鼠rosa26基因敲除且定点整合外源基因
②
的转基因大鼠品系ii；其中，所述外源基因
②
是hmrgprx4基因和荧光报告基因之间通过ip2a自切割肽段序列(5
′-
gcgacgaattttagtctactgaaacaagcgggagacgtggaggaaaaccctggacct-3
′
)连接而成，所述外源基因
②
由cag启动子驱动，且在所述cag或cmv启动子(也可以使用其它强启动子)启动子与外源基因之间包含一段受步骤a中所述重组酶条件性控制的stop序列；其中，cag启动子的序列如seq id no:4所示。
[0010]
c、将品系i与品系ii大鼠进行交配，得到特异性表达hmrgprx4的转基因大鼠。
[0011]
本发明中，所述hmrgprx4基因(seq id no:2)编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no:1所示。所述stop序列如seq id no:3所示。
[0012]
优选地，步骤a中grna作用位点的dna序列为5
′-
tccggttaggagtaaattcc-3
′
和5
′-
tgagacagcggaaaacacgg-3
′
。
[0013]
优选地，步骤b中grna作用位点的dna序列为5
′-
gactccagttgcagatcacg-3
′
。
[0014]
前述的方法，所述重组酶可以是cre或flp，优选cre重组酶。
[0015]
可选地，步骤b中所述荧光报告基因编码红色荧光蛋白mscarlet，其序列如seq id no:5所示(也可以使用其它荧光蛋白)。
[0016]
前述的方法，步骤a包括：根据大鼠mrga基因序列，构建基于crispr-cas9系统的grna和cas9表达载体，分别体外转录得到grna和cas9 mrna，并根据grna作用位点构建含有外源基因
①
的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将体外转录得到的cas9 mrna、grna和供体质粒共同转入野生型大鼠的受精卵中，然后将克隆胚胎通过非手术法移入大鼠子宫内进行妊娠，获得转基因大鼠。
[0017]
前述的方法，步骤b包括：根据大鼠rosa26基因序列，构建基于crispr-cas9系统的grna和cas9表达载体，分别体外转录得到grna和cas9 mrna，并根据grna作用位点构建含有外源基因
②
的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将体外转录得到的cas9 mrna、grna和供体质粒共同转入野生型大鼠受精卵中，然后将克隆胚胎通过非手术法移入大鼠子宫内进行妊娠，获得转基因大鼠。
[0018]
优选地，步骤a和b中所述hmrgprx4基因的3
’
端带有3
×
flag标签序列。
[0019]
优选地，所述大鼠为sd大鼠。
[0020]
第二方面，本发明提供按照上述方法构建的转基因大鼠的以下任一应用：
[0021]
(1)用作筛选治疗或缓解人胆汁淤积性瘙痒症药物的动物模型；
[0022]
(2)用于筛选治疗或缓解人胆汁淤积性瘙痒症的药物；
[0023]
(3)用于检测引起人胆汁淤积性瘙痒症的物质；
[0024]
(4)用于筛选hmrgprx4受体的激动剂或抑制剂；
[0025]
(5)用于hmrgprx4基因功能的研究。
[0026]
第三方面，本发明提供一种提高hmrgprx4基因在大鼠mrga阳性神经元表达量的方法，包括：将转基因大鼠品系i与转基因大鼠品系ii进行交配。
[0027]
本发明利用crispr-cas9技术，构建了两个大鼠转基因品系，分别命名为hmrgprx4-cre和lsl-hmrgprx4-mscarlet。在hmrgprx4-cre大鼠品系中，本发明用包含hmrgprx4和cre重组酶的基因序列取代大鼠的mrga基因，其中hmrgprx4和cre重组酶之间用
p2a自切割肽段序列连接，使其在翻译的过程中断裂成两个功能完整的蛋白。此外，本发明在hmrgprx4基因的3
’
端插入3
×
flag标签序列，可以在后期通过抗体染色确定受体的表达。在此品系中，hmrgprx4将利用mrga的启动子进行转录和翻译表达在mrga阳性的大鼠drg神经元中；由于cre重组酶的表达，此品系与报告品系交配，可以将多种工具基因表达在mrga阳性的大鼠drg神经元中，用于mrga阳性的大鼠drg神经元的标记和操作。在lsl-hmrgprx4-mscarlet大鼠品系中，本发明构建了条件性表达的hmrgprx4转基因大鼠，将包含hmrgprx4的重组核酸插入到大鼠的rosa26的基因座，该重组核酸包含一段cag启动子序列，并在cag启动子之后hmrgprx4起始密码子之前包含一段cre重组酶或flp重组酶条件性控制的stop序列。此外，本发明在hmrgprx4基因的3
’
端插入3
×
flag标签序列，这样可以在后期通过抗体染色确定受体的表达。为了后期可以直接观察到表达hmrgprx4的神经元，本发明在hmrgprx4的下游通过p2a自切割肽段序列连接红色荧光蛋白mscarlet基因序列。因此，此品系通过与重组酶驱动大鼠系交配可以实现hmrgprx4在特定细胞的高表达和标记。
[0028]
将hmrgprx4-cre大鼠与lsl-hmrgprx4-mscarlet大鼠交配得到hmrgprx4-cre；lsl-hmrgprx4-mscarlet双阳性的大鼠，可以实现hmrgprx4在mrga阳性的大鼠drg神经元的高表达。提取和培养该大鼠的drg神经元，超过80％的神经元有红色荧光，表明mrgprx4的表达；钙成像结果显示，对脱氧胆酸(deoxycholic acid,dca)有反应的drg神经元比例为7％左右；行为学实验结果显示，皮下注射hmrgprx4配体dca后，相对于注射前，大鼠抓挠次数显著增加。
[0029]
本发明首次构建出一种用于筛选治疗人胆汁淤积性瘙痒药物分子的转基因大鼠模型。通过构建两个转基因大鼠品系，本发明实现了将hmrgprx4特异性表达在大鼠痒觉相关的drg神经元中。免疫荧光染色和体外细胞培养证明了hmrgprx4功能性地表达在大鼠drg痒觉神经元中。在体皮下注射dca证明了hmrgprx4可以介导痒觉感受。该人源化大鼠模型可用于筛选特异且有效治疗人胆汁淤积性瘙痒的药物分子，为后续开展临床实验提供理论基础和实验依据。
附图说明
[0030]
图1为本发明较佳实施例中hmrgprx4-cre；lsl-hmrgprx4-mscarlet转基因大鼠的基因型鉴定结果；其中，a：hmrgprx4-cre转基因大鼠基因信息模式图；b：hmrgprx4-cre转基因大鼠的基因型鉴定结果，如图所示，利用f1/r1引物，hmrgprx4-cre等位基因的条带大小为301bp，对应的野生型大鼠等位基因条带大小为505bp；可见编号为5的大鼠为纯和子，编号1、2、4和6的大鼠为杂合子，编号3的大鼠为野生型；c：lsl-hmrgprx4-mscarlet转基因大鼠基因信息模式图；d：lsl-hmrgprx4-mscarlet转基因大鼠的基因型鉴定结果，如图所示，利用f2/r2引物，lsl-hmrgprx4-mscarlet等位基因的条带大小为385bp，对应的野生型大鼠等位基因没有条带；利用f3/r3引物，lsl-hmrgprx4-mscarlet等位基因的条带大小为6712bp，对应的野生型大鼠等位基因的条带大小为646bp；可见编号为2、3和5的大鼠为纯和子，编号6的大鼠为杂合子，编号4的大鼠为野生型。从图1可知各大鼠的基因型，例如6号大鼠的基因型为hx4-cre/wt；lsl-hmrgprx4-mscarlet/wt，即双杂合。
[0031]
图2为本发明较佳实施例中hmrgprx4-cre；lsl-hmrgprx4-mscarlet转基因大鼠的细胞水平验证结果；其中，a：培养的6号转基因大鼠的drg神经元在荧光共聚焦显微镜下的
成像结果，红色荧光表示mscarlet的表达，如红色虚线标出的细胞所示；白色虚线标出的细胞是未表达mscarlet的细胞。fluo-8 am是钙离子指示剂；比例尺为50μm；b：a中mscarlet阳性和阴性神经元的钙成像结果代表性曲线，红色曲线为a中红色虚线标出的神经元的反应，黑色曲线为a中白色虚线标出的神经元的反应；c：杂合6号转基因大鼠的drg神经元钙成像统计结果；d：免疫荧光的结果。d1-d4为孵育兔抗hmrgrpx4实验组；d5-d8为没有一抗孵育的对照组。d1和d5为细胞核染色结果，d2和d6为mscarlet的荧光结果，d3和d7为hmrgprx4的染色结果，d4和d8为明场。
[0032]
图3为本发明较佳实施例中dca可以引起hmrgprx4-cre；lsl-hmrgprx4-mscarlet转基因大鼠抓挠行为；其中，a：痒觉行为学实验的流程图；注射药物之前(pre)，记录大鼠1小时内的左侧颈部抓挠次数，作为本底水平；然后，在大鼠左侧颈部皮下注射500μg/50μl的dca；统计注射后(post)1小时内大鼠左侧颈部的抓挠次数；b：dca在杂合不同基因型大鼠中引起的抓挠次数统计结果。hx4-cre是指hmrgprx4-cre大鼠，lsl-hx4是指lsl-hmrgprx4-mscarlet大鼠，hx4-cre；lsl-hx4大鼠是指hmrgprx4-cre；lsl-hmrgprx4-mscarlet双杂合大鼠。
[0033]
图4为本发明较佳实施例中dca不能激活hmrgprx4-cre转基因大鼠的感觉神经元，说明将hmrgprx4-cre转基因大鼠感觉神经元中的hmrgprx4表达量不足以介导胆酸引起的激活；其中，a：将hmrgprx4-cre转基因大鼠与一种报告大鼠杂交，该报告大鼠是一种条件性表达红色荧光蛋白tdtomato的转基因大鼠，在cre重组酶的作用下，stop序列被切除，从而tdtomato会成功表达。因此，可根据tdtomato的红色荧光判断表达cre的细胞；b：hmrgprx4-cre；reporter双杂和大鼠的drg神经元成像结果；箭头所指是有tdtomato红色荧光的细胞，即表达cre的细胞，也就是表达hmrgprx4的细胞；c：b图中红色荧光drg神经元的钙成像结果。
具体实施方式
[0034]
本发明提供一种特异性表达hmrgprx4受体的转基因大鼠，并首次证明dca可以通过激活hmrgprx4在大鼠体内引起痒觉。该大鼠模型可以用于研究hmrgprx4介导痒觉感受的功能，筛选并验证hmrgprx4的拮抗剂，开发用于治疗胆汁淤积性瘙痒的药物。
[0035]
本发明的理论基础是基于人体内的mrgprx4，其特异性地表达在人体痒觉相关的背根神经节神经元中，这一特性对于反应化合物致痒特性紧密相关。本发明最终得到在drg神经元中成功表达hmrgprx4的人源化大鼠，并首次证明人体内源胆酸分子dca通过激活hmrgprx4在该人源化大鼠体内引起痒觉，而该活性是这一药物具有瘙痒副作用的分子机制。
[0036]
用人源mrgprx4替换大鼠mrga得到转基因大鼠hmrgprx4-cre，其中hmrgprx4的表达是依赖于大鼠内源mrga的启动子。但由于人源与鼠源受体的差别，尽管大鼠mrga正常表达，但hmrgrpx4表达量较低，这是构建模型前所未知的。本发明巧妙地构建了lsl-hmrgprx4-mscarlet大鼠，通过外源引入的cag启动子，来驱动mrgrpx4的高表达。
[0037]
本发明提供一种利用表达hmrgprx4的转基因大鼠来鉴定导致瘙痒化合物的方法。为了达到该目的，本发明将hmrgprx4表达在大鼠的痒觉神经元——mrga阳性神经元中。同时为进一步增加hmrgprx4的表达量，本发明又构建了条件性表达的hmrgprx4转基因大鼠。
hmrgprx4-3xflag-ip2a-mscarlet-f-wpre-pa(seq id no:7)，sgrna设计在插入位置周围。基于sgrna的设计原则，在靶位点区域共设计多条sgrna。将sgrna(5
′-
gactccagttgcagatcacg-3
′
)和cas9基因连入带t7启动子的质粒载体pcs上并进行体外转录，得到进行显微注射的grna和cas9mrna。
[0052]
根据靶基因序列，分别设计并合成5
’
、3
’
同源臂片段(seq id no:10和11)，然后将5
’
同源臂片段、目的基因(cag-loxp-frt-stop-loxp-frt-hmrgprx4-3xflag-ip2a-mscarlet-f-wpre-pa)片段和3
’
同源臂片段依次连接到puc57载体上，即为供体质粒。
[0053]
将cas9 mrna、grna和供体质粒按等摩尔比混合，显微注射到大鼠受精卵中，注射后至出生得到f0大鼠。由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的f0大鼠为嵌合体。故以f0大鼠鼠尾进行鉴定得到的f0基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待f1大鼠鼠尾检测后确定。
[0054]
(三)hmrgprx4-cre；lsl-hmrgprx4-mscarlet转基因大鼠的构建
[0055]
将hmrgprx4-cre大鼠和lsl-hmrgrpx4-mscarlet大鼠进行交配，得到具有高表达量且特异性表达hmrgprx4的转基因大鼠(hmrgprx4-cre；lsl-hmrgprx4-mscarlet)。
[0056]
1、hmrgprx4-cre；lsl-hmrgprx4-mscarlet转基因大鼠的基因型鉴定结果
[0057]
1)采用一步裂解法提取大鼠组织(脚趾)的基因组：含有0.1mg/ml的蛋白酶k的一步裂解液。
[0058]
2)将200ul上述裂解液加到组织中，56℃孵育10小时；然后80℃孵育10分钟。
[0059]
3)按照正常pcr程序扩增目的片段用于鉴定大鼠基因型。
[0060]
4)用于鉴定hmrgprx4-cre等位基因的引物为(5
′-3′
)：
[0061]
f1：accttaacgacggggagctagatgg
[0062]
r1：caaggtcccaggacctagaggga
[0063]
利用上述引物，wt等位基因片段大小为301bp，hmrgprx4-cre等位基因片段大小为505bp。
[0064]
5)用于鉴定lsl-hmrgprx4等位基因的引物为(5
′-3′
)：
[0065]
f1：ttgtattggagacaagaagcacttgctc
[0066]
r1：ttgatagggctgcagaagtgggag
[0067]
f2：cagtagtgccaaccccatcatttact
[0068]
r2：gatctcgaactcgtggccgttcat
[0069]
利用引物f1和r1，wt等位基因片段大小为646bp，lsl-hmrgprx4等位基因片段大小为6712bp。利用引物f2和r2，lsl-hmrgprx4等位基因片段大小为385bp，wt等位基因没有条带。
[0070]
hmrgprx4-cre；lsl-hmrgprx4-mscarlet转基因大鼠的基因型鉴定结果见图1。
[0071]
2、hmrgprx4-cre；lsl-hmrgprx4-mscarlet转基因大鼠的细胞水平验证结果
[0072]
1)利用钙成像溶液将dca配制成100um的溶液；
[0073]
2)按照文献(yu et al.,2019elife,8,e48431)中的方法提取大鼠的drg神经元；
[0074]
3)用钙成像溶液稀释fluo-8 am到5um；将稀释好的fluo-8 am加入到细胞中，500ul/孔，室温静置40分钟；
[0075]
4)在共聚焦显微镜下观察细胞，灌流上述溶液，记录细胞内钙信号的变化。
[0076]
hmrgprx4-cre；lsl-hmrgprx4-mscarlet转基因大鼠的细胞水平验证结果见图2。
[0077]
3、hmrgprx4-cre；lsl-hmrgprx4-mscarlet转基因大鼠的行为学水平鉴定结果
[0078]
1)将dca配制成500ug/50ul的浓度；
[0079]
2)将hmrgprx4-cre；lsl-hmrgprx4-mscarlet转基因大鼠在行为学箱中适应5天，30分钟/天；
[0080]
3)实验当天，注射前拍摄录制1小时用于统计大鼠本底的抓挠水平；
[0081]
4)将上述dca溶液50ul注射到大鼠的颈部；
[0082]
5)注射后，持续拍摄录制1小时。
[0083]
图3结果显示，dca可以引起hmrgprx4-cre；lsl-hmrgprx4-mscarlet转基因大鼠抓挠行为。
[0084]
实施例2
[0085]
图4进一步证明了hmrgprx4-cre；lsl-hmrgprx4-mscarlet转基因大鼠作为动物模型更具优势。如图4a所示，将hmrgprx4-cre的纯合大鼠与一种报告大鼠交配，在cre重组酶的作用下，子代大鼠cre阳性的细胞中会表达一种红色荧光蛋白tdtomato。提取并培养该子代大鼠的drg神经元，如图4b所示，箭头所示为表达tdtomato的drg神经元，说明cre重组酶是表达且有功能的，同时理论上也说明hmrgprx4表达的；如图4c所示，钙成像结果显示，加入dca并不能在这些神经元引起明显的钙信号，说明hmrgprx4虽然表达了，但是可能由于表达量比较低，不能介导dca在drg神经元引起的反应。这也说明通过将hmrgprx4-cre大鼠与lsl-hmrgprx4-mscarlet大鼠交配，增加mrgprx4的表达量是必须的。
[0086]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0087]
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