大黄鱼抗肿瘤肽piscidin5like及其制备方法与应用与流程

大黄鱼抗肿瘤肽piscidin 5 like及其制备方法与应用
技术领域
[0001]
本发明涉及大黄鱼抗菌肽，尤其是涉及大黄鱼抗肿瘤肽piscidin 5 like及其制备方法与应用。


背景技术：

[0002]
随着对抗菌肽(antimicrobial peptides)研究的发展，学者发现抗菌肽是一类最有希望能完全或部分替代抗生素的候选物。抗菌肽靶向细胞膜的独特作用方式几乎不会引起抗性的产生。因此，在过去的若干年里，大量的工作和努力致力于对抗菌肽的研究
[1-3]
，并且越来越多的抗菌肽被从细菌、动物、植物中分离出来。其中生物多样性较高的海洋生物是丰富的抗菌肽的重要来源。
[0003]
研究发现一些抗菌肽具有很强的抗肿瘤活性
[4]
，且具有很大的潜力发展成为一种药物。我们都知道，癌细胞细胞膜上的能量依赖型转运蛋白，如p-葡糖蛋白，使一些已经存在的抗癌药物(如阿霉素或vinca alkaloids)变得无效，因为获得抗性的p-葡糖蛋白能够降低细胞内药物浓度
[5]
。尤其耐药性的产生逐渐在世界范围内都引发了对肿瘤或炎症治疗失败的担忧。以前的研究发现肿瘤细胞或细菌的细胞膜携带有更多的净负电荷，如磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，ps)
[6]
、o-糖基化粘蛋白(o-glycosylated mucins)
[7]
、脂多糖(lipopolysaccharides，lps)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid，lta)。大部分的抗菌肽、或称之为抗肿瘤肽(anticancer peptides，acps)拥有两亲性结构、有限结合并插入到带负电的细胞膜以破坏细胞或线粒体膜
[8-9]
，因此，不难理解为什么阳性肽更容易靶向并破坏肿瘤细胞、病原菌细胞膜。类似于抗菌机制，acps的抗肿瘤作用机制也是多样的。比如cs5931能够激活hct-8细胞的caspase 9and 3表现出显著的抗增殖、促凋亡活性
[10]
；pleurocidin家族的nrc-03、nrc-07成员能够裂解乳腺癌细胞的细胞膜
[11]
；kahalalide f通过消耗乳腺癌细胞系skbr3的erbb3(human epidermal growth factor receptor 3)和抑制akt(protein kinase b)信号引起细胞的坏死样死亡
[12]
；magainin 2或tachyplesin能够通过线粒体通路激活caspase-9/3诱导凋亡
[13-14]
；a9k可穿透进入hela细胞影响f-actin的重建，进而引起线粒体的功能紊乱
[15]
。
[0004]
piscidins拥有多样的抗性活性，包括抗菌、抗寄生虫、抗病毒、抗肿瘤活性。大黄鱼piscidin-like(lc-pis)能够结合到hela细胞上并引起其死亡，lc-pis主要聚集在核膜的周围，人工修饰lc-pis的正电荷增强了该效应，然而，负电荷消除了聚集效应，因此lc-pis具有抗肿瘤活性
[16]
。体外重组表达大黄鱼piscidin 5 like的抗肿瘤活性的检测对于丰富海洋生物源抗肿瘤候选肽提供基础参考依据。
[0005]
参考文献：
[0006]
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–
373.


技术实现要素：

[0022]
本发明的第一目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5 like基因的编码序列。
[0023]
本发明的第二目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5 like的氨基酸序列。
[0024]
本发明的第三目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5 like的制备方法。
[0025]
本发明的第四目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5 like的应用。
[0026]
所述大黄鱼抗菌肽piscidin 5 like命名为lc-p5l。
[0027]
lc-p5l基因的编码序列为：
[0028][0029]
lc-p5l的氨基酸序列为：
[0030][0031][0032]
所述重组piscidin 5 like(rlc-p5l)的制备方法包括以下步骤：
[0033]
1)构建lc-p5l重组表达载体；
[0034]
2)将步骤1)所得的重组表达载体转化宿主细胞，并对宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；
[0035]
3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得重组蛋白rlc-p5l。
[0036]
在步骤1)中，所述表达载体可选用pet-28a。
[0037]
在步骤2)中，所述宿主细胞可选用e.coli bl21(de3)。
[0038]
在步骤3)中，可先将步骤2)所得的表达产物进行变性亲和层析，再进行透析复性。
[0039]
所述rlc-p5l对肿瘤细胞具有明显的抑杀活性，因此所述大黄鱼抗菌肽piscidin 5 like在海洋生物源的抗肿瘤候选药物中具有潜在的应用价值。
[0040]
rlc-p5l可在制备抗肿瘤候选药物中的应用。
[0041]
rlc-p5l可在制备大黄鱼源抗肿瘤候选药物中的应用。
[0042]
本发明在分离得到lc-p5l的基础上，根据lc-p5l基因序列特征成功构建重组表达
载体并在大肠杆菌系统中表达并纯化获得重组rlc-p5l蛋白，该重组蛋白具有一定的抗肿瘤活性。研究结果对于丰富海洋生物源抗肿瘤药物数据库提供了重要的理论支撑。
[0043]
本发明构建了lc-p5l的pet-28a重组表达载体，并转化至宿主细胞e.coli bl21(de3)中，在宿主细胞中进行诱导表达，得到表达产物，并对表达产物进行分离纯化，从而得到重组蛋白rlc-p5l。本发明具有表达产量较高，生物活性强，表达系统简单，生产成本低，无毒害物质等优点，适用于大规模发酵生产，可为人工修饰成为更具高抗肿瘤活性的物质提供理论数据和支撑。
附图说明
[0044]
图1为pet-28a原核表达载体构建图。
[0045]
图2为sds-page分析pet-28a-lc-p5l重组大肠杆菌不同iptg浓度诱导表达的电泳图。在图2中，m为sds-page标准蛋白质marker，blank为未诱导菌体，其他泳道不同iptg浓度诱导后菌体，可见约10kda的诱导表达蛋白条带。
[0046]
图3为sds-page分析pet-28a-lc-p5l重组大肠杆菌iptg诱导表达菌体超生破碎后分离上清与沉淀的电泳图。在图3中，m为sds-page标准蛋白质marker，blank为未诱导菌体，1为菌体超生破碎后上清，2为菌体超生破碎后沉淀，3为纯化后纯化产物调条带。
[0047]
图4为sds-page分析纯化过程中不同浓度咪唑洗脱峰下收集的洗脱液。在图4中，m为sds-page标准蛋白质marker。
[0048]
图5为纯化产物的western blot图。在图5中，m为sds-page标准蛋白质marker，1为western blot图。
[0049]
图6为rlc-p5l对几种肿瘤细胞的抗肿瘤活性观察图。
[0050]
图7为rlc-p5l对l929细胞破坏的扫描电子显微镜图。
具体实施方式
[0051]
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
[0052]
实施例1大黄鱼lc-p5l原核重组表达载体的构建
[0053]
根据pet-28a载体多克隆位点，设计带有限制性内切酶位点的特异性引物f1/r1扩增编码大黄鱼piscidin 5 like基因orf中去除编码信号肽的序列。正向引物f1的5
′
端添加ecor i酶切位点；在下游引物r1的5
′
端添加xho i酶切位点。
[0054]
上游引物f1：5
′-
ccggaattcggagacaactacggtactttc-3
′
；
[0055]
下游引物r1：5
′-
ccgctcgagtttgctgccgtcgtcct-3
′
。
[0056]
扩增lc-p5l的编码区片段。pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃
[0057]
退火45s，72℃延伸45s，重复35个循环；72℃延伸10min。
[0058]
利用琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收pcr产物，回收的pcr产物经ecor i和xho i酶切后纯化回收，与ecor i和xhoi双酶切线性化的pet-28a载体连接，构建好大肠杆菌表达重组载体pet-28a-lc-p5l，测序鉴定读码框准确无误。
[0059]
pet-28a-lc-p5l载体构建图参见图1。
[0060]
实施例2 pet-28a-lc-p5l重组质粒在e.coli bl21(de3)中的诱导表达：测序正确的质粒pet-28a-lc-p5l经热激法转化至e.coli bl21(de3)大肠杆菌中，并用iptg诱导表
达。
[0061]
结果显示，与诱导前相比，pet-28a-lc-p5l重组质粒转化的e.colibl21(de3)有明显的重组蛋白的诱导表达，蛋白条带在10kda左右(参见图2)。
[0062]
实施例3 pet-28a-lc-p5l重组质粒转化的e.coli bl21(de3)中iptg诱导后的表达产物纯化
[0063]
利用亲和层析法纯化rlc-p5l重组蛋白，大量诱导表达的阳性重组e.colibl21(de3)后，经4℃12000rpm离心10min去除上清，加入适量的超声波破碎液(50mmtris-hcl、0.5m nacl、1mm edta，ph8.0)，经高压超生破碎后，4℃12000rpm离心30min收集沉淀。沉淀中加入适量包涵体洗涤液(50mmtris-hcl、0.5m nacl、2m尿素、1％triton x-100，ph7.8)重悬菌体，清洗包涵体3次后，加入包涵体裂解液(100mmtris-hcl，500mmnacl，8m尿素，20mm咪唑，ph 7.4；0.3mg/ml和2％triton-x 100(用时加入))，上清经0.22μm滤膜过滤得到上柱样品。随后采用亲和层析柱上清亲和层析。收集洗脱组分，经sds-page电泳分析，可见约10kda的单一条带(参见图3)。
[0064]
实施例4纯化产物的western blot分析
[0065]
经western blot分析，所获取的纯化产物为大黄鱼piscidin 5 like蛋白。
[0066]
实施例5纯化产物的质谱鉴定
[0067]
将纯化的rlc-p5l蛋白sds-page电泳、考马斯亮蓝染色后，切割条带进行质谱鉴定。
[0068]
实施例6rlc-p5l的肿瘤活性鉴定
[0069]
生长状况良好的hela、hek293、l929肿瘤细胞中加入终浓度为20-100μm的rlc-p5l，细胞继续在37℃、5％co2的恒温培养箱中培养24h，分别用regfp-his-tag、培养基代替rlc-p5l的作为阴性、空白对照。在倒置显微镜下观察不同浓度rlc-p5l处理3株肿瘤细胞的生长及形态变化情况。
[0070]
生长状况良好的l929肿瘤细胞中加入终浓度为80μm的rlc-p5l，细胞继续在37℃、5％co2的恒温培养箱中分别培养6、12、24h，分别用regfp-his-tag、培养基代替rlc-p5l的作为阴性、空白对照。处理结束后的细胞用4％的多聚甲醛固定、pbs清洗、梯度乙醇脱水、临界点干燥、喷金后扫描显微镜观察。
[0071]
图4为sds-page分析纯化过程中不同浓度咪唑洗脱峰下收集的洗脱液。在图4中，m为sds-page标准蛋白质marker。图5为纯化产物的western blot图。在图5中，m为sds-page标准蛋白质marker，1为western blot图。图6为rlc-p5l对几种肿瘤细胞的抗肿瘤活性观察图。图7为rlc-p5l对l929细胞破坏的扫描电子显微镜图。
[0072]
本发明根据大黄鱼抗虫肽piscidin 5 like基因序列特征，构建原核表达载体、转化大肠杆菌iptg诱导表达并纯化获得rlc-p5l重组蛋白，从而鉴定重组蛋白抗肿瘤的活性。

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