细胞培养容器及原代细胞的培养方法与流程

[0001]
本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种细胞培养容器及原代细胞的培养方法。


背景技术：

[0002]
原代培养是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。最常用的原代培养有组织块培养法和分散细胞培养法。组织块培养法是将剪碎的组织块直接移植在培养容器中，然后加入培养基后进行培养。分散细胞培养法则是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和胶原酶)消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂(如edta)除去细胞互相粘着所依赖的ca
2+
，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞，然后加入培养基后进行培养。
[0003]
在临床应用中，组织块培养法由于不使用异源的蛋白水解酶处理细胞，具有更高的安全性，然而，采用组织块培养法进行原代培养时，原代细胞的产量较低。


技术实现要素：

[0004]
基于此，有必要提供一种能提高原代培养的细胞产量的培养细胞容器。
[0005]
此外，还提供一种能够提高原代培养的细胞产量的原代细胞的培养方法。
[0006]
一种细胞培养容器，包括至少一个培养单元，所述培养单元包括：
[0007]
培养槽，所述培养槽用于承装细胞培养液；
[0008]
固定件，所述固定件固定于所述培养槽的槽底上，所述固定件用于固定组织块，以使所述组织块贴附于所述培养槽的槽底；及
[0009]
盖板，所述盖板能够收容于所述培养槽中，所述盖板与所述固定件活动连接。
[0010]
上述细胞培养容器通过固定件将组织块固定于培养槽的槽底，使得组织块更容易贴向培养槽的槽底，减少培养液对组织块贴壁的影响，并且通过与固定件活动连接的盖板的压制，进一步提高了组织块的贴壁率，促进从细胞爬出的细胞贴向培养槽的槽底生长，进而提高原代培养的细胞产量。
[0011]
在其中一个实施例中，所述固定件为多个，多个所述固定件相互平行且间隔地固定于所述培养槽的槽底上。
[0012]
在其中一个实施例中，所述固定件具有连接部和与所述连接部连接的穿刺部，所述连接部与所述培养槽的槽底固接，所述穿刺部向远离所述培养槽的槽底的方向延伸，所述穿刺部的横截面积从靠近所述连接部的一端向远离所述连接部的一端逐渐减小。
[0013]
在其中一个实施例中，所述固定件为圆柱状，所述固定件的长度小于所述培养槽的深度，所述固定件的长度为5mm～20mm，所述固定件的直径为1mm～2mm。
[0014]
在其中一个实施例中，所述盖板上设置有固定孔，所述盖板通过所述固定孔套设于所述固定件上，所述固定孔在所述培养槽的槽底上的正投影的面积小于所述组织块的与所述盖板接触的面的面积。
[0015]
在其中一个实施例中，所述盖板上开设有透气孔，所述透气孔靠近所述盖板的中心。
[0016]
在其中一个实施例中，所述盖板为玻璃盖板或塑料盖板。
[0017]
在其中一个实施例中，所述培养单元有多个，多个所述培养单元间隔设置。
[0018]
在其中一个实施例中，所述细胞培养容器还包括盖体，所述盖体用于遮蔽所述培养槽的槽口。
[0019]
一种原代细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0020]
将组织块固定在上述的细胞培养容器的固定件上，并使所述组织块的一面贴覆于所述细胞培养容器的培养槽的槽底；
[0021]
将所述细胞培养容器的盖体套设于所述固定件上，且所述盖体压在所述组织块上；及
[0022]
向所述细胞培养容器中添加培养液。
附图说明
[0023]
图1为一实施方式的细胞培养容器；
[0024]
图2为另一实施例的盖板；
[0025]
图3为另一实施方式的细胞培养容器的俯视图。
[0026]
附图标记：10、细胞培养容器；100、培养单元；110、培养槽；120、固定件；130、盖板；131、固定孔；132、透气孔。
具体实施方式
[0027]
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
[0028]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0029]
请参阅图1，本发明一实施方式提供了一种细胞培养容器10，该细胞培养容器10上设有培养单元100，该培养单元100包括培养槽110、固定件120和盖板130。
[0030]
具体地，培养槽110用于承装细胞培养液，为细胞从组织块中爬出和生长提供场所。在其中一个实施例中，培养槽110的材料为塑料(例如聚苯乙烯)或玻璃。当然，在其他一些实施例中，培养槽110的材料还可以是其他的材料，只要不妨碍细胞从组织块中爬出即可。
[0031]
在图1所示的实施方式中，培养槽110呈圆柱形。当然，在其他实施例中，培养槽110的形状不限于圆柱形，还可以是其他形状，例如锥形、方形等。
[0032]
在其中一个实施例中，培养槽110的底为平底。在另一个实施例中，培养槽110的底为圆底。
[0033]
在其中一个实施例中，培养槽110的呈圆柱形，培养槽110的槽口直径为35mm～150mm；培养槽110的深度为10mm～25mm。进一步地，培养槽110的槽口直径为60mm～150mm；
培养槽110的深度为10mm～20mm。当然，在其他一些实施例中，培养槽110的尺寸不限于上述，还可以更加实际需求(例如培养量)进行调整。
[0034]
固定件120固定于培养槽110的槽底上，用于固定组织块，以使组织块贴附于培养槽110的槽底，便于从组织块中爬出的细胞贴壁。具体地，固定件120呈柱状，例如圆柱、三棱柱、四棱柱等。进一步地，固定件120呈倒钩状或者倒刺状。将固定件120设置为倒钩状或倒刺状便于组织块的固定。在图1所示的实施方式中，固定件120呈圆柱状。进一步地，固定件120具有连接部和与连接部连接的穿刺部，连接部与培养槽110的槽底连接，穿刺部向远离培养槽110的槽底的方向延伸，穿刺部的横截面积从靠近连接部的一端向远离连接部的一端逐渐减小。穿刺部按照上述设置可以便于固定件120刺破组织块，便于将组织块贴向槽底。在一个可选地具体示例中，穿刺部呈锥形。
[0035]
具体地，固定件120为多个，多个固定件120间隔地设于培养槽110的槽底。在图1所示的实施方式中，固定件120有9个，9个固定件120呈矩阵排列于培养槽110的槽底。当然，在其他实施例中，固定件120的数量不限于9个，还可以其他任意大于0的整数。例如2、4、8、12等。当然，在一些实施例中，固定件120也可以是一个。
[0036]
在其中一个实施例中，固定件120与培养槽110一体成型。固定件120与培养槽110一体成型便于培养槽110的清洗，避免固定件120与培养槽110的槽底之间存在缝隙而难于清洗。
[0037]
盖板130与固定件120活动连接，能够收容于培养槽110中。在培养过程中，盖板130用于压制组织块，减少组织块的上浮或漂移，提高组织块的贴壁率。
[0038]
具体地，盖板130上设置有固定孔131，盖板130能够通过固定孔131套设于固定件120上。可以理解的是，固定孔131在培养槽110的槽底上的正投影的面积小于组织块与盖板130接触的面的面积，以防止盖板130不压制组织块而直接滑落至培养槽110的槽底。在图1所示的实施方式中，盖板130上有4个圆形的固定孔131，4个固定孔131间隔设置，4个固定孔131位于矩形的四个顶点上。当然，在其他实施例中，固定孔131的个数不限于4个，还可以是其他任意大于0的整数，固定孔131的形状也不限于圆形，还可以是其他形状，例如方形、三角形等。
[0039]
在其中一个实施例中，固定件120为圆柱状，固定件120的直径为1mm～2mm；固定件120的长度为1mm～20mm。在一个可选地具体实施例中，固定件120的长度为1mm、3mm、5mm、8mm、10mm、15mm、18mm或20mm。进一步地，固定件120的长度为5mm～20mm。此时，固定孔131的直径与固定件120的直径匹配，为1.1mm～2.1mm。当然，固定件120的长度小于培养槽110的深度。可以理解的是，在其他实施例中，固定件120和固定孔131的尺寸不限于上述，还可以根据实际需求进行调整。
[0040]
进一步地，请参阅图2，盖板130上还开设有透气孔132。透气孔132的设置，一方面可以在向有组织块的培养槽110中加入培养液时，通过透气孔132可以加速盖板130的下沉，另一方面也便于赶走因加培养液而产生的气泡。在图2所示的实施方式中，透气孔132靠近盖板130的中心。在图2所示的实施方式中，固定孔131为圆孔，固定孔131为4个，透气孔132为8个，4个固定孔131的连线呈正方形，透气孔132间隔分布于整个盖板130上。
[0041]
可以理解的是，在一些实施方式中，盖板130的数量为多个。在使用时，培养槽110内可容纳多个盖板130平铺。当然，在盖板130的数量为多个时，也可以是多个盖板130层叠
铺设。
[0042]
在本实施方式中，盖板130为塑料盖板，例如，聚苯乙烯盖板。当然，在其他实施例中，盖板130不限于塑料盖板，还可以是其他材料的盖板130，例如玻璃盖板。
[0043]
在一个可选地具体示例中，盖板130为圆形，盖板130的直径为20mm～100mm。透气孔132为圆孔，透气孔132的直径为0.2mm～0.8mm。当然，在其他实施例中，盖板130和透气孔132的形状和尺寸不限于上述，可以根据实际情况进行调整。
[0044]
可以理解的是，在一些实施方式中，盖板130可以省略。
[0045]
在一些实施例中，细胞培养容器10还包括盖体，盖体用于遮蔽培养槽110的槽口。在一个可选地具体示例中，盖体呈平板状。在另一个可选地具体示例中，盖体包括遮挡部和与遮挡部的边缘连接的限位部。在使用时，遮挡部用于遮蔽培养槽110的槽口的遮挡部；限位部用于限制盖体，左右晃动，避免盖体滑落。进一步地，限位部包括多根限位柱，通过多根限位柱限定盖体的位移范围。或者限位部为两端开口的中空结构，限位部的其中一端与遮蔽部固接。
[0046]
可以理解的是，上述的细胞培养容器10对于培养的组织块没有特别的限制，例如可以是脐带组织，也可以是皮肤组织，适用于组织块培养法培养原代细胞。
[0047]
上述细胞培养容器10至少具有以下优点：
[0048]
(1)通过固定件120将组织块固定于培养槽110的槽底，提高了组织块的贴壁率，促进从细胞爬出的细胞贴向培养槽110的槽底生长，进而提高原代培养的细胞产量。
[0049]
(2)通过设置盖板130，进一步提高组织块的贴壁率，进一步提高原代培养的细胞产量。
[0050]
(3)通过设置透气孔132，便于组织块贴壁，也便于消除气泡，利于细胞生长。
[0051]
请参阅图3，另一实施方式的细胞培养容器20，该细胞培养容器20上有多个培养单元200，多个培养单元200间隔设置。在图3所示的实施方式中，细胞培养容器20上设有6个间隔设置的培养单元200。通过将多个培养单元200设置在一个细胞培养容器20上，便于同批次操作，利于规模化生产。
[0052]
本发明一实施方式还提供了一种原代细胞的培养方法，该原代细胞的培养方法包括以下步骤：将组织块固定在上述任一实施方式的细胞培养容器的固定件上，并使组织块的一面贴覆于细胞培养容器的培养槽的槽底；将细胞培养容器的盖体套设于所述固定件上，且所述盖体压在所述组织块上；及向细胞培养容器中添加培养液。
[0053]
在一个可选地具体示例中，固定件有四个，组织块呈方块状。此时，将组织块的穿插在固定件上，组织块的四个角对应四个固定件，组织块的一面贴覆于培养槽的槽底。当然，在其他实施例中，可根据具体的固定件的个数进行操作，使得组织块固定于固定件上并平整地贴覆于培养槽的槽底即可。
[0054]
具体实施例
[0055]
以下结合具体实施例进行详细说明。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
[0056]
实施例1
[0057]
实施例1中用于原代培养的细胞培养容器的结构如图1所示。实施例1中的细胞培
养容器的培养单元为一个，培养槽的材料为聚苯乙烯，培养槽的直径为100mm，培养槽的深度为20mm，固定件的长度为10mm，固定件的直径为1mm，盖板的直径为92mm，透气孔的直径为0.6mm，固定孔的直径为1.1mm。
[0058]
实施例1的原代培养的步骤具体如下：
[0059]
(1)脐带收集：收集足月健康剖宫产胎儿脐带(直径为1.5厘米)，浸没于含1％(m/v)的青霉素和1％(m/v)链霉素的pbs中，置于冰上。
[0060]
(2)组织分离：在超净台中将脐带剪裁为长4cm的小段，分别纵向剖开，用无菌pbs反复冲洗至液体无血污，用止血钳和眼科去除一根静脉血管和两根动脉血管(共三根)，并分离得到华通胶组织。
[0061]
(3)将步骤(2)得到的华通胶组织剪切成小于2mm3组织块，以pbs冲洗后沥干，将组织块固定于细胞培养容器的固定件上，然后将盖板套设于固定有组织块的固定件上，以使组织块被盖板压住。在培养箱放置30分钟，然后加入含15％胎牛血清的dmem/f12培养基，在37℃5％co2培养箱中培养。
[0062]
(4)倒置相差显微镜下观察组织块周围细胞爬出情况，在7天后首次换液(换液是指将培养皿中的培养上清去除后，加入含15％(v/v)胎牛血清的dmem/f12培养基)，以后每隔4天换一次。当细胞扩增面积占培养皿底面积的80％时，用0.05％胰酶-edta消化使细胞脱附，并计数。然后传代到常规培养皿(无固定件和盖板的聚苯乙烯培养皿，用于细胞培养)中培养(首次传代1:2，后续每3天1:3或1:4传代)。本文中，将从组织块中爬出且未进行传代的细胞记为零代间充质干细胞(p0)，将零代间充质干细胞传代培养而得到的间充质干细胞记为第一代间充质干细胞(p1)，将第一代间充质干细胞传代培养而得到的间充质干细胞记为第二代间充质干细胞(p2)，其他以此类推。
[0063]
经统计，实施例1中，每4cm的脐带组织中爬出的细胞的量为9.77
×
107个，组织块的贴壁率(贴壁率＝贴壁组织块的面积/接种组织块的面积，下同)为82.2％。
[0064]
(5)将第三代间充质干细胞进行表型鉴定：具体地，取1
×
106个细胞，加100μl的细胞染色缓冲液。然后根据抗体说明书加入相应体积的抗体[小鼠抗人pe、apc或fitc标志的单抗cd105、cd44、cd90、cd29、cd34、cd45和人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，hla)-dr]，室温孵育30min，1000r/min离心5min，弃上清，加入500μl pbs上流式细胞仪进行检测。结果如表1所示。
[0065]
表1
[0066][0067]
由表1可知，实施例1的第三代间充质干细胞的表面表达cd105、cd73、cd90、cd45、cd34、cd14、cd19和hla-dr的阳性率符合国际标准(国际标准中规定，间充质干细胞的细胞表面表达cd105、cd73和cd90(≥95％)，不表达cd45、cd34、cd14或cd11b、cd79α或(≤2％))。
[0068]
实施例2
[0069]
实施例2的原代培养步骤大致与实施例1相同，其不同在于，在培养过程中，实施例2中所采用的组织为羊膜组织。
[0070]
经统计，实施例2中，每4cm的脐带组织中爬出的细胞的量为6.1
×
107个，组织块的贴壁率为79.9％。
[0071]
实施例2中的第三代间充质干细胞的流式细胞仪鉴定的结果如表2所示。
[0072]
表2
[0073]
[0074]
由表2可知，实施例2的第三代间充质干细胞的表面表达cd105、cd73、cd90、cd45、cd34、cd14、cd19和hla-dr的阳性率符合国际标准(国际标准中规定，间充质干细胞的细胞表面表达cd105、cd73和cd90(≥95％)，不表达cd45、cd34、cd14或cd11b、cd79α或(≤2％))。
[0075]
对比例1
[0076]
对比例1的原代培养步骤大致与实施例1相同，其不同在于，在培养过程中，对比例1中承装组织块的容器为常规的用于培养细胞的培养皿(无固定件和盖板)。
[0077]
经统计，对比例1中，每4cm的脐带组织中爬出的细胞的量为1.01
×
107个，组织块的贴壁率为9.1％。
[0078]
对比例1中的第三代间充质干细胞的流式细胞仪鉴定的结果如表3所示。
[0079]
表3
[0080]
[0081]
由表3可知，对比例1的第三代间充质干细胞的表面表达cd105、cd73、cd90、cd45、cd34、cd14、cd19和hla-dr的阳性率符合国际标准(国际标准中规定，间充质干细胞的细胞表面表达cd105、cd73和cd90(≥95％)，不表达cd45、cd34、cd14或cd11b、cd79α或(≤2％))。
[0082]
对比例2
[0083]
对比例2的原代培养步骤大致与实施例2相同，其不同在于，在培养过程中，对比例2中承装组织块的容器为常规的用于培养细胞的培养皿(无固定件和盖板)。
[0084]
经统计，对比例2中，每4cm的脐带组织中爬出的细胞的量为0.68
×
107个，组织块的贴壁率为7.8％。
[0085]
对比例2中的第三代间充质干细胞的流式细胞仪鉴定的结果如表4所示。
[0086]
表4
[0087][0088]
由表4可知，对比例2的第三代间充质干细胞的表面表达cd105、cd73、cd90、cd45、cd34、cd14、cd19和hla-dr的阳性率符合国际标准(国际标准中规定，间充质干细胞的细胞表面表达cd105、cd73和cd90(≥95％)，不表达cd45、cd34、cd14或cd11b、cd79α或(≤2％))。
[0089]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0090]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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