一种固体微球及其制备方法和应用与流程

[0001]
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种固体微球的制备方法，通过该制备方法制得的微球，以及利用该微球作为细胞培养微载体的应用。


背景技术：

[0002]
目前，微载体作为细胞培养载体、药物递送载体、包埋剂、吸附剂等方面的应用被不断报道。固体微球是一类广泛用于细胞培养的微载体，其合成材料要求具有高的生物相容性和良好的可降解性，以适用于细胞的体内和体外培养。壳聚糖(chitosan)是一种从无脊椎动物骨骼中提取的大量多糖-几丁质的阳离子聚合衍生物。壳聚糖作为甲壳素的n-脱乙酰基产物，可被溶菌酶降解，具有良好的生物相容性、无毒、性质稳定，还具有低致敏性和可生物降解性，因此在医用敷料、药物缓释载体等多个领域具有广泛应用。壳聚糖虽然已被中国、美国等国家批准为药用辅料。然而，壳聚糖类微球多采用有毒的交联剂来合成，例如戊二醛、京尼平等，残留的交联剂细胞毒性大。此外，常规喷雾加热干燥机在制备壳聚糖微球时，加热会导致液滴收缩，因此所得颗粒的尺寸较小(＜100微米)，且颗粒形貌很难控制。另一方面，壳聚糖本身不存在细胞识别位点，细胞黏附效果差。明胶作为哺乳动物体内含量最多的一种蛋白质-胶原的水解产物，被fda认证为一种安全的材料，其在药物、食品等工业中的应用具有长久的历史。作为生物医用材料，明胶具有结构和生物学上的优势：
①
明胶具有温度可逆性，可通过冷冻干燥的方法得到多孔的材料；
②
明胶分子中含有大量的、不同种类的官能团，可通过化学修饰的方法对其性能进行调控；
③
明胶具有良好的生物相容性和生物可降解性，因其含有精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(rgd)生物活性短肽，可以提供大量的细胞识别位点，有利于细胞的黏附和生长。
④
明胶可被胶原酶降解或水解成氨基酸，具有良好的生物降解性。尽管明胶自身有很多优点，但由于其溶解/溶胀导致其结构稳定性差，因此其本身无法作为微载体用于细胞三维动态培养。
[0003]
引用文献1公开了一种三维多孔壳聚糖/明胶微球，其制备方法包括：将壳聚糖和明胶b混合后经过高压脉冲微胶囊成型仪滴入液氮快速冷冻成球，一次冻干后的微球用饱和的三聚磷酸盐-85％乙醇溶液交联固化后进行二次冻干，再将二次冻干所得的微球充分水化，加入交联剂碳二亚胺/n-羟基琥珀酰，用明胶a对微球进行修饰，水浴，避光反应后，洗去未反应的碳二亚胺/n-羟基琥珀酰和明胶a，再进行三次冻干后即得到直径在300-800μm,表面孔径50-200μm的三维多孔壳聚糖/明胶微球。
[0004]
引用文献2公开了一种壳聚糖-明胶交联微球的制备方法，包括：1)将壳聚糖加入到酸溶液中，在温度a条件下溶解，得到壳聚糖溶液；将明胶加入到水中，在温度b条件下溶解，得到明胶溶液；将壳聚糖溶液与明胶溶液混合，得到壳聚糖-明胶混合溶液；将壳聚糖-明胶混合溶液喷雾冷冻并冻干，得到壳聚糖-明胶物理混合微球；2)将步骤1)中的壳聚糖-明胶物理混合微球加入到洗涤溶剂a中洗涤，过滤，将截留物加入到交联剂溶液中，在温度c条件下交联，过滤，将截留物中加入到ph调节剂中中和，过滤，将截留物加入到洗涤溶剂b中振荡，将沉淀物冻干，得到壳聚糖-明胶交联微球。
[0005]
上述引用文献中虽然以明胶和壳聚糖为材料制得了能够作为细胞培养微载体的微球，然而，在微球的制备过程中均需要使用具有一定毒性的交联剂，降低了微球的生物形容性。因此，目前仍亟需一种尺寸适宜、细胞黏附性能好、生物相容性高、可生物降解，结构稳定的多孔微载体用于细胞培养。
[0006]
引用文献：
[0007]
引用文献1：cn102172498a
[0008]
引用文献2：cn111269444a


技术实现要素：

[0009]
发明要解决的问题
[0010]
鉴于现有技术存在的技术问题，例如，以壳聚糖和明胶制备的固体微球，需要使用具有一定细胞毒性的交联剂，降低了固体微球的生物安全性。为此，本发明提供了一种微球的制备方法，在未引入交联剂的情况下，合成了尺寸均一的固体微球。微球的表面可以粘附细胞，作为细胞培养的微载体，由于微球的制备过程中未引入交联剂，所用材料均为生物医用辅料，使微球具有高的生物相容性，并且兼具良好的机械强度和结构稳定性，使培养的细胞具有高的细胞活力和生长效率。
[0011]
用于解决问题的方案
[0012]
本发明首先提供了一种固体微球的制备方法，其包括如下步骤：
[0013]
将壳聚糖与任选存在的明胶类物质溶解于酸溶液中，得到微球前体溶液，所述微球前体溶液经喷雾冷冻处理，一次冻干后得到微球前体；
[0014]
将所述微球前体在洗涤剂中洗涤，过滤，所得截留物即为固体微球。
[0015]
根据本发明的制备方法，其中，所述微球前体溶液中，所述壳聚糖的质量浓度为0.5～4wt％，粘度为30～300mpa.s，脱乙酰度为70～99％。
[0016]
根据本发明的制备方法，其中，所述明胶类物质选自明胶和明胶衍生物；可选地，所述明胶衍生物选自琥珀酰明胶和聚明胶肽。
[0017]
根据本发明的制备方法，其中，所述微球前体溶液中，所述明胶类物质的质量浓度为0.5～5wt％。
[0018]
根据本发明的制备方法，其中，所述酸选自乙酸、氯化氢、甲酸、乳酸、苹果酸和抗坏血酸；可选地，所述酸溶液中，酸与溶剂的质量比为0.3:99.7～4:96；可选地，所述酸溶液为所述酸的水溶液。
[0019]
根据本发明的制备方法，其中，所述洗涤剂为溶剂或基于所述溶剂的碱溶液；可选地，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钙和氨中；所述溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、乙腈和水。
[0020]
根据本发明的制备方法，其中，所述喷雾冷冻处理的温度为-20℃～-196℃。
[0021]
根据本发明的制备方法，其中，还包括如下步骤：在保护剂存在下，对所述截留物进行二次冻干处理，得到所述固体微球。
[0022]
根据本发明的制备方法，其中，所述二次冻干处理的温度为-20℃～-196℃。
[0023]
根据本发明的制备方法，其中，所述保护剂为赋形剂溶液或水；可选地，所述赋形剂选自乳糖、葡聚糖、明胶、甘露醇、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、聚乙二醇、乙二醇、葡萄糖、
山梨醇、肌醇、牛血清蛋白、谷氨酸钠、赖氨酸和明胶。
[0024]
本发明还提供了一种固体微球，其中，所述固体微球通过本发明所述的方法制备得到。
[0025]
根据本发明的固体微球，其中，所述固体微球的粒径为50～500μm；
[0026]
可选地，所述固体微球具有联通外表孔隙，所述孔隙的孔径为1-30μm。
[0027]
根据本发明所述的固体微球作为生物医用材料的应用。
[0028]
根据本发明对的应用，其中，所述生物医用材料为细胞培养的微载体；
[0029]
可选地，所述细胞选自293细胞、hek293细胞、hek-293t细胞、293t细胞、293tn细胞、293ft细胞、aav-293细胞、huvec细胞、ecv-304细胞、l929细胞、wb-f344细胞、l-02细胞、thp-1细胞、d407细胞、vero细胞、cho细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪干细胞或ips细胞。
[0030]
发明的效果
[0031]
本发明提供的固体微球的制备方法，在未引入交联剂的情况下，以壳聚糖为骨架得到了固体微球。虽然固体微球内部未形成交联的化学键，但固体微球仍具有高的结构稳定性。微球表面粘附细胞，可作为细胞培养的微载体。微球所用材料均为生物医用辅料，使微球具有高的生物相容性，适合作为细胞体内培养或体外培养的微载体。由于无交联剂，固体微球与壳聚糖-明胶交联微球相比，能够以更快的速度降解。另一方面，通过喷雾冷冻的方式适合大规模制备微球，且得到的微球尺寸较为均一，固体微球兼具良好的结构稳定性，能够用于细胞的三维动态培养，为细胞提供更接近体内的微环境。
[0032]
进一步地，微球的原料中引入明胶类物质，壳聚糖可以作为骨架支撑明胶类物质不溶解，明胶类物质可帮助细胞黏附在微球上，除掉酸后，将水溶性的物质巧妙地转变成水中不溶性微球。此外，明胶类物质的加入大大降低了壳聚糖的粘度，使得到的壳聚糖-明胶的固体微球适合作为细胞二维培养以及三维培养的载体，有效提高了细胞培养效率。
[0033]
进一步地，本发明的制备方法原料成本低、制备过程绿色环保、制备步骤简单易行，适合大规模的工业化生产。制备过程所使用材料均为生物可降解材料，使固体微球具有生物可降解性，负载细胞的微球在膝关节病症、肌腱损伤等领域有极大的应用前景。
附图说明
[0034]
图1示出了实施例1中微球的扫描电镜照片。
[0035]
图2示出了实施例2中微球的扫描电镜照片。
[0036]
图3示出了实施例3中微球的扫描电镜照片，图3-a为一次冻干后微球孔径照片，图3-b为二次冻干后制备微球的孔径照片。
[0037]
图4示出了实施例18中微球培养细胞(转速40rpm，接种细胞1000个/cm2)的明场照片，图4-a为200μm标尺下的明场照片，图4-b为50μm标尺下的明场照片。
[0038]
图5示出了实施例18中微球培养细胞(转速40rpm，接种细胞1000个/cm2)的荧光照片，图5-a为200μm标尺下的荧光照片，图5-b为50μm标尺下的荧光照片。
[0039]
图6示出了实施例18中微球培养细胞(转速30rpm，接种细胞1000个/cm2)的明场照片，图6-a为200μm标尺下的荧光照片，图6-b为50μm标尺下的荧光照片。
[0040]
图7示出了实施例18中微球培养细胞(转速30rpm，接种细胞1000个/cm2)的荧光照
片，图7-a为200μm标尺下的荧光照片，图7-b为50μm标尺下的荧光照片。
[0041]
图8示出了实施例18中微球培养细胞(转速30rpm，接种细胞500个/cm2)的明场照片。
[0042]
图9示出了实施例18中微球培养细胞(转速30rpm，接种细胞500个/cm2)的荧光照片。
[0043]
图10示出了实施例18中微球培养细胞(转速30rpm，接种细胞1000个/cm2)的明场照片。
[0044]
图11示出了实施例18中微球培养细胞(转速30rpm，接种细胞1000个/cm2)的荧光照片。
[0045]
图12示出了实施例18中微球培养细胞(转速30rpm，接种细胞2000个/cm2)的明场照片。
[0046]
图13示出了实施例18中微球培养细胞(转速30rpm，接种细胞2000个/cm2)的荧光照片。
[0047]
图14示出了实施例18中微球培养细胞(转速30rpm，接种细胞4000个/cm2)的明场照片。
[0048]
图15示出了实施例18中微球培养细胞(转速30rpm，接种细胞4000个/cm2)的荧光照片。
具体实施方式
[0049]
以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
[0050]
另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
[0051]
如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。
[0052]
本说明书中，如没有特别说明，则“％”均表示质量百分含量。
[0053]
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
[0054]
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
[0055]
本说明书中，使用“数值a～数值b”表示的数值范围是指包含端点数值a、b的范围。
[0056]
另外，本说明书中，所述“水”包含去离子水、蒸馏水、离子交换水、双蒸水、高纯水、纯净水等化妆品领域能够使用的任何可行的水。
[0057]
第一方面
[0058]
本发明的第一方面提供了一种固体微球的制备方法，包括如下步骤：
[0059]
将壳聚糖与任选存在的明胶类物质溶解于酸溶液中，得到微球前体溶液，所述微球前体溶液经喷雾冷冻处理，一次冻干后得到微球前体；
[0060]
将所述微球前体在洗涤剂中洗涤，过滤，所得截留物即为固体微球。
[0061]
<微球前体溶液>
[0062]
在本发明中，微球前体溶液由壳聚糖溶解于酸溶液中得到；壳聚糖是一种天然高分子材料，具有良好的生物相容性，适合作为合成固体微球的骨架材料，得到能够粘附细胞的多孔微球结构。
[0063]
具体的，在微球前体溶液中，壳聚糖的质量浓度为0.5～4wt％。例如，壳聚糖的质量浓度为0.8wt％、1.0wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％等等。壳聚糖的粘度为30～300mpa.s，例如，壳聚糖的粘度为40mpa.s、50mpa.s、70mpa.s、100mpa.s、120mpa.s、150mpa.s、190mpa.s、200mpa.s、250mpa.s等等。脱乙酰度为70～99％，例如，脱乙酰度为75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％等等。采用壳聚糖的质量浓度为0.5～4％、粘度为30～300mpa.s、脱乙酰度为70～99％的微球前体溶液，适合制备粒径为50～500μm且结构稳定性好的固体微球。
[0064]
在本发明中，微球前体溶液中还可以是将壳聚糖和明胶类物质溶解于酸溶液中得到。通过加入明胶类物质，可以帮助细胞粘附在微球上；明胶类物质可降低壳聚糖的粘度，使其更适合于喷雾冷冻的工艺处理。
[0065]
具体的，在微球前体溶液中，明胶类物质的质量浓度为0.5～5wt％，例如，，明胶类物质的质量浓度为0.8wt％、1.0wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％等等。采用明胶类物质的质量浓度为0.5～5wt％的微球前体溶液，适合制备细胞粘附性好、可降解的固体微球。
[0066]
在一些具体的实施方案中，明胶类物质选自明胶和明胶衍生物。其中，明胶衍生物选自琥珀酰明胶和聚明胶肽中的至少一种。上述的明胶、明胶衍生物均是生物医用材料，具有良好的生物相容性及细胞黏附性。
[0067]
对于酸溶液，可以是将酸溶于溶剂中得到。作为优选，本发明对溶剂不作具体限定，可以是本领域常用的极性溶剂，例如：水等。进一步的，酸选自乙酸、氯化氢、甲酸、乳酸、苹果酸和抗坏血酸中的一种或多种。进一步的，酸与溶剂的质量比为0.3:99.7～4:96。
[0068]
在一些具体的实施方案中，微球前体溶液是将明胶溶于50℃～80℃的水中，然后加入壳聚糖与酸溶液得到。通过加入温度为50℃～80℃的水中，有利于得到均一、稳定的微球前体溶液。
[0069]
<微球前体>
[0070]
在本发明中，微球前体是将微球前体溶液经喷雾冷冻处理并冻干得到。喷雾冷冻的方式适合大规模制备微球，且得到的微球尺寸较为均一。
[0071]
具体的，是将所述微球前体溶液分散于冷媒介中，使分散的液滴固化为冰球。微球前体溶液可以通过喷雾装置分散为液滴，本发明对喷雾装置不作具体限定，可以是单流体喷雾装置、二流体喷雾装置、多流体喷雾装置、超声雾化装置、超临界流体喷雾装置或微流控喷雾装置等本领域常用的装置。
[0072]
进一步的，微球前体溶液分散后的液滴与冷媒介可以是直接接触或间接接触。例如，分散后的液滴在喷雾冷冻塔内不直接与冷媒介接触，而是与降温后的气体接触。
[0073]
作为优选，喷雾冷冻处理的温度为-20℃～-196℃，更优选为-20℃～-80℃。
[0074]
<固体微球>
[0075]
在本发明中，将微球前体在洗涤剂中洗涤，过滤，所得截留物即为固体微球。通过洗涤和过滤处理，可以去除微球前体中残留的酸，防止微球前体在放入溶液中后残留的酸降解壳聚糖，使微球发生降解。因此，可以进一步提高固体微球的生物相容性和结构稳定性。具体的，所述微球前体的洗涤方法包括搅拌、摇床震荡、涡旋、离心或过滤。
[0076]
在一些具体的实施方案中，将微球前体在洗涤剂中洗涤，过滤后，在保护剂存在下，对所述截留物进行所述二次冻干处理，得到所述固体微球。二次冻干处理后的微球可长时间保存、运输，满足实际市场需求。
[0077]
对于洗涤剂，可以是用于洗去酸溶液的任何溶剂或基于溶剂的碱溶液。其中，碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钙和氨中的一种或多种。溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、乙腈和水中的一种或多种。示例性的，碱溶液由碱溶解于上述溶剂中得到。
[0078]
对于保护剂，可以是赋形剂溶液或水。其中，所述赋形剂选自乳糖、葡聚糖、明胶、甘露醇、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、聚乙二醇、乙二醇、葡萄糖、山梨醇、肌醇、牛血清蛋白、谷氨酸钠、赖氨酸和明胶中的一种或多种。所述赋形剂溶液可以是赋形剂溶于水得到，本发明对赋形剂溶液的溶剂不作特别限定。
[0079]
作为优选，二次冻干处理的温度为-20℃～-196℃。
[0080]
本发明提供的固体微球的制备方法，原料绿色环保且成本低、制备步骤简单易行，适合大规模的工业化生产。
[0081]
第二方面
[0082]
本发明的第二方面提供了一种固体微球，由第一方面所提供的固体微球的制备方法制得。
[0083]
由于固体微球的制备过程中未引入任何固体剂，具有高的生物相容性，可以粘附细胞作为细胞培养的载体，提高细胞活性和生长效率。固体微球兼具良好的结构稳定性和可生物降解性，能够用于细胞的三维动态培养，为细胞提供更接近体内的微环境。此外，固体微球还可作为吸附剂或药物递送载体，在生物医用领域具有广泛的应用前景。
[0084]
作为优选，固体微球的粒径为50～500μm；固体微球具有联通外表孔隙，所述孔隙的孔径为1-30μm。固体微球所具有的孔隙可以增加细胞粘附的表面积，增加细胞培养的数量。
[0085]
第三方面
[0086]
本发明的第三方面提供了第二方面所述的固体微球作为生物医用材料的应用。具体的，生物医用材料为细胞培养的微载体。
[0087]
固体微球使用的材料全部属于生物医用辅料，因此负载细胞的固体微球生物相容性良好，可以生物降解，负载细胞的固体微球在膝关节病症、肌腱损伤等领域有极大的应用前景。
[0088]
实施例
[0089]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0090]
实施例1
[0091]
将0.5g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1g壳聚糖(脱乙酰度80％，粘度190mpa.s)及1ml的乙酸溶液，溶解，得到壳聚糖质量浓度为2wt％、明胶质量浓度为1wt％的壳聚糖明胶溶液(也即，微球前体溶液)。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-80℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥，得到微球前体；取干燥后的微球前体，加入氢氧化钠的乙醇洗涤残余的乙酸，用水搅拌洗涤三次后，过滤，加入水，在-80℃条件下冷冻并干燥，得到壳聚糖-明胶固体微球。
[0092]
图1显示壳聚糖-明胶固体微球的扫描电镜照片，可见壳聚糖-明胶固体微球粒径均一，可形成稳定的球状结构。
[0093]
实施例2
[0094]
将1g明胶溶于50ml温度为65℃的热水中，加入0.5g壳聚糖(脱乙酰度90％，粘度200mpa.s)及1ml的乙酸溶液，得到壳聚糖质量浓度为1wt％、明胶质量浓度为2wt％的壳聚糖明胶溶液(也即，微球前体溶液)。将溶液置于二流体喷雾设备，喷入液氮中，得到固化的冰球，冷冻干燥，得到微球前体；取干燥后的微球前体，加入乙醇洗涤残余的乙酸，加入水洗涤三次后，过滤，加入乳糖溶液，在-196℃条件下冷冻并干燥，得到壳聚糖-明胶固体微球，壳聚糖-明胶固体微球的扫描电镜照片如图2所示。
[0095]
实施例3
[0096]
将1g明胶溶于50ml温度为70℃的热水中，加入0.5g壳聚糖(脱乙酰度90％，粘度200mpa.s)及1ml的乙酸溶液，得到壳聚糖质量浓度为1wt％、明胶质量浓度为2wt％的壳聚糖明胶溶液(也即，微球前体溶液)。将溶液置于二流体喷雾设备，用二流体雾化装置喷入预冷至-60℃的冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥，得到微球前体；取干燥后的微球前体，加入乙醇洗涤残余的乙酸，加入水洗涤三次后，过滤，在-196℃条件下冷冻并干燥，得到壳聚糖-明胶固体微球。图3-a为一次冻干后微球孔径照片，图3-b为二次冻干后制备微球的孔径照片。
[0097]
实施例4
[0098]
将0.5g壳聚糖及0.5ml的乙酸(脱乙酰度85％，粘度200mpa.s)溶于50ml温度为65℃的水溶液，得到壳聚糖质量浓度为1wt％的壳聚糖溶液(也即，微球前体溶液)。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体雾化装置喷入预冷至-40℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥，得到微球前体；取干燥后的微球前体，加入碳酸钠的乙醇洗涤残余的乙酸，加入水洗涤三次后，过滤，加入5ml含2％的纤维黏连蛋白或重组人纤维蛋白，得到负载纤维黏连蛋白或重组人纤维蛋白的壳聚糖微球。
[0099]
实施例5
[0100]
将2.5g明胶溶于50ml温度为50℃的热水中，加入0.5g壳聚糖(脱乙酰度90％，粘度100mpa.s)及0.5ml的乳酸溶液，得到壳聚糖质量浓度为1wt％、明胶质量浓度为5wt％的壳聚糖明胶溶液(也即，微球前体溶液)。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用多流体喷雾装置喷入
预冷至-80℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥，得到微球前体；取干燥后的微球前体，加入氢氧化钙的80％丙酮水溶液洗涤残余的乳酸，加入水涡旋洗涤三次后，过滤，加入明胶溶液，在-20℃条件下冷冻并干燥，得到壳聚糖-明胶固体微球。
[0101]
实施例6
[0102]
将0.5g明胶溶于50ml温度为75℃的热水中，加入1g壳聚糖(脱乙酰度96％，粘度190mpa.s)及1ml的乙酸溶液，溶解，得到壳聚糖质量浓度为2wt％、明胶质量浓度为1wt％的壳聚糖明胶溶液(也即，微球前体溶液)。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-80℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥，得到微球前体；取干燥后的微球前体，加入无水乙醇洗涤残余的乙酸，用水搅拌洗涤三次后，过滤得到壳聚糖-明胶微球。
[0103]
实施例7
[0104]
将1g明胶溶于50ml温度为80℃的热水中，加入2g壳聚糖(脱乙酰度70％，粘度300mpa.s)及1ml的抗坏血酸溶液，得到壳聚糖质量浓度为4wt％、明胶质量浓度为2wt％的壳聚糖明胶溶液(也即，微球前体溶液)。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用多流体喷雾装置喷入预冷至-80℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥，得到微球前体；取干燥后的微球前体，加入氢氧化钠与氢氧化钾的乙醇洗涤残余的抗坏血酸，加入水洗涤过滤三次后，加入麦芽糖溶液在液氮条件下冷冻并干燥，得到壳聚糖-明胶固体微球。
[0105]
实施例8
[0106]
将1.5g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1.5g壳聚糖(脱乙酰度90％，粘度100mpa.s)及0.5ml的盐酸溶液，得到壳聚糖质量浓度为3wt％、明胶质量浓度为3wt％的壳聚糖明胶溶液(也即，微球前体溶液)。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用超声雾化装置喷入预冷至-40℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥，得到微球前体；取干燥后的微球前体，加入碳酸氢钠的丙酮洗涤残余的盐酸，加入水搅拌洗涤三次后，加入聚乙二醇溶液在-40℃条件下冷冻并干燥，得到壳聚糖-明胶固体微球。
[0107]
实施例9
[0108]
将2g明胶溶于50ml温度为70℃的热水中，加入0.5g壳聚糖(脱乙酰度95％，粘度30mpa.s)及1ml的甲酸溶液，得到壳聚糖质量浓度为1wt％、明胶质量浓度为4wt％的壳聚糖明胶溶液(也即，微球前体溶液)。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用超临界流体喷雾装置喷入预冷至-40℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥，得到微球前体；取干燥后的微球前体，加入碳酸钠的丙醇洗涤残余的甲酸，加入水离心洗涤三次后，加入牛血清蛋白及明胶在-60℃条件下冷冻并干燥，得到壳聚糖-明胶固体微球。
[0109]
实施例10
[0110]
将0.25g明胶溶于50ml温度为75℃的热水中，加入2g壳聚糖(脱乙酰度90％，粘度40mpa.s)及2g的苹果酸溶液，得到壳聚糖质量浓度为4wt％、明胶质量浓度为0.5wt％的壳聚糖明胶溶液(也即，微球前体溶液)。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用单流体喷雾装置喷入预冷至-80℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥，得到微球前体；取干燥后的微球前体，加入氨水的丁醇洗涤残余的苹果酸，加入水搅拌洗涤三次后，过滤，加入山梨醇溶液在-20℃条件下冷冻并干燥，得到壳聚糖-明胶固体微球。
[0111]
实施例11
[0112]
将0.5g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入0.5g壳聚糖(脱乙酰度85％，粘度
120mpa.s)及1.5g的抗坏血酸溶液，得到壳聚糖质量浓度为1wt％、明胶质量浓度为1wt％的壳聚糖明胶溶液(也即，微球前体溶液)。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用多流体喷雾装置喷入预冷至-60℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥，得到微球前体；取干燥后的微球前体，加入氢氧化钙的乙醇洗涤残余的抗坏血酸，加入水离心洗涤三次后，加入谷氨酸钠在-20℃条件下冷冻并干燥，得到壳聚糖-明胶固体微球。
[0113]
实施例12
[0114]
将2g明胶溶于50ml温度为70℃的热水中，加入0.25g壳聚糖(脱乙酰度80％，粘度200mpa.s)及0.5ml的甲酸溶液，得到壳聚糖质量浓度为0.5wt％、明胶质量浓度为4wt％的壳聚糖明胶溶液(也即，微球前体溶液)。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-40℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥，得到微球前体；取干燥后的微球前体，加入氢氧化钠的乙腈洗涤残余的甲酸，加入水洗涤过滤三次后，加入赖氨酸在液氮条件下冷冻并干燥，得到壳聚糖-明胶固体微球。
[0115]
实施例13
[0116]
将1g明胶溶于50ml温度为70℃的热水中，加入1.5g壳聚糖(脱乙酰度97％，粘度50mpa.s)及1ml的乙酸溶液，得到壳聚糖质量浓度为3wt％、明胶质量浓度为2wt％的壳聚糖明胶溶液(也即，微球前体溶液)。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用超声喷雾装置喷入预冷至-50℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥，得到微球前体；取干燥后的微球前体，加入碳酸钠的甲醇洗涤残余的乙酸，加入水离心振荡洗涤三次后得到壳聚糖-明胶固体微球。
[0117]
实施例14
[0118]
将1.5g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1g壳聚糖(脱乙酰度95％，粘度70mpa.s)及1.5ml的盐酸溶液，得到壳聚糖质量浓度为2wt％、明胶质量浓度为3wt％的壳聚糖明胶溶液(也即，微球前体溶液)。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用单流体喷雾装置喷入液氮中，得到固化的冰球，冷冻干燥，得到微球前体；取干燥后的微球前体，加入碳酸氢钠的丁醇洗涤残余的盐酸，加入水涡旋洗涤三次后，加入乙二醇在-20℃条件下冷冻并干燥，得到壳聚糖-明胶固体微球。
[0119]
[利用壳聚糖明胶微球为微载体的二维静态细胞培养]
[0120]
实施例15
[0121]
将实施例1-14中制得的壳聚糖明胶微球进行高压灭菌，然后用pbs漂洗。将灭菌后的固体球置于细胞培养板中，加入细胞培养基，平衡一段时间。弃去培养基，再加入新鲜的培养基，然后接种脂肪干细胞，摇晃均匀后，将孔板放入二氧化碳培养箱中，在37℃条件下培养。之后用荧光素双醋酸酯(fda)染色，观察细胞在壳聚糖明胶微球上第1天和第3天的黏附和增殖情况。
[0122]
实施例16
[0123]
将实施例1-14中制得的壳聚糖明胶微球进行高压灭菌，然后用pbs漂洗。将灭菌后的固体球置于细胞培养板中，加入细胞培养基，平衡一段时间。弃去培养基，再加入新鲜的培养基，然后接种间充质干细胞，摇晃均匀后，将孔板放入二氧化碳培养箱中，在37℃条件下培养。之后用fda染色，观察细胞在壳聚糖明胶微球上第1天和第3天的黏附和增殖情况。
[0124]
实施例17
[0125]
将实施例1-14中制得的壳聚糖明胶微球进行高压灭菌，然后用pbs漂洗。将灭菌后
的固体球置于细胞培养板中，加入细胞培养基，平衡一段时间。弃去培养基，再加入新鲜的培养基，然后接种293细胞，摇晃均匀后，将孔板放入二氧化碳培养箱中，在37℃条件下培养。之后用fda染色，观察细胞在壳聚糖明胶微球上第1天和第3天的黏附和增殖情况。
[0126]
[壳聚糖-明胶化学固体微球三维动态细胞培养]
[0127]
实施例18
[0128]
将实施例1的壳聚糖-明胶微球用pbs漂洗3遍，置于转瓶中；加入培养基并将转瓶放入二氧化碳培养箱中，搅拌使微球能均匀的悬浮。12h后接种脂肪干细胞，设置不同搅拌速度及细胞接种比例，继续培养，于第5天内分别取样观察细胞形态。
[0129]
图4、6、8、10、12、14显示在不同转速及不同细胞接种数量下细胞形态的明场观测结果。其中，图4、6分别显示不同转速培养第1d、2d、3d、4d的细胞形态观测结果，图8、10、12、14显示培养第1d和第5d的细胞形态观测结果。图中结果显示，以固体微球连续培养细胞4-5d后，细胞的增殖情况良好，说明固体微球适合于黏附细胞，为细胞增殖提供长期、稳定的微载体环境。
[0130]
实施例19
[0131]
将实施例2-14的壳聚糖-明胶微球用pbs漂洗3遍，置于转瓶中；加入培养基并将转瓶放入二氧化碳培养箱中37℃预培过夜，搅拌使微球能均匀的悬浮。12h后接种脂肪干细胞，继续培养，于第5天内分别取样观察细胞形态。
[0132]
实施例20
[0133]
将实施例1-14的壳聚糖-明胶微球用pbs漂洗3遍，置于转瓶中；加入培养基并将转瓶放入二氧化碳培养箱中37℃预培过夜，搅拌使微球能均匀的悬浮。12h后接种间充质干细胞，继续培养，于第1，3，5天分别取样观察细胞形态。
[0134]
实施例21
[0135]
将实施例15-20培养细胞的微球用移液器将孔板和摇瓶里面吸出来，转移到离心管中，静止一段时间后，待微球全部沉到底部后，去掉上清培养基后用pbs悬浮，洗涤2次，从冰箱中取出fda，复温摇匀，fda尽量避光，从转瓶中取一部分微球至48孔板中，用pbs漂洗一遍后加入fda染色液，避光染色15min，弃染色液，加入pbs漂洗3遍后用倒置荧光显微镜观察拍照。
[0136]
图5、7、9、11、13、15显示实施例18中培养细胞在不同转速及细胞接种数量下细胞形态的荧光观测结果。其中，图5、7分别显示不同转速培养第1d、2d、3d、4d的细胞形态观测结果，图9、11、13、15显示培养第1d和第5d的细胞形态观测结果。图中结果显示，以固体微球连续培养细胞4-5d后，细胞的增殖情况良好，说明固体微球适合于黏附细胞，为细胞增殖提供长期、稳定的微载体环境。
[0137]
实施例22
[0138]
将0.5g壳聚糖(脱乙酰度96％，粘度200mpa.s)及1ml的乙酸溶液加入50ml的热水中，溶解，得到壳聚糖明胶溶液使用数字式粘度计测粘度，粘度为200mpa.s；加入1g明胶溶解后，测得粘度为130mpa.s。明胶的加入可以大大降低溶液的粘度。
[0139]
实施例23
[0140]
收集实施例19-20中的负载细胞的壳聚糖明胶微球，用0.9％的生理盐水清洗三遍，取0.3ml微球与0.1ml 5％的透明质酸钠及人血白蛋白溶液共混，使用注射器将混悬液
注射进入有关节炎症的关节腔，并于注射后2周、4周、6周、8周、12周、16周使用microct观察软骨修复情况。
[0141]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则和精神之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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