利用CRISPR/Cas9系统同时敲除橡胶草1-SST和1-FFT基因的方法与流程

利用crispr/cas9系统同时敲除橡胶草1-sst和1-fft基因的方法
技术领域
[0001]
本发明涉及橡胶草基因编辑技术领域，具体涉及利用crispr/cas9系统同时靶向敲除橡胶草菊糖合成酶基因1-sst和1-fft的sgrna、表达盒、载体、宿主细胞以及利用crispr/cas9系统同时靶向敲除橡胶草菊糖合成酶基因1-sst和1-fft的方法。


背景技术：

[0002]
天然橡胶是重要的战略物资和工业原料，主要产自巴西橡胶树。橡胶草(taraxacum kok-saghyz rodin)为菊科蒲公英属多年生草本植物，其根部可合成优质的天然橡胶，且与巴西橡胶树所产天然橡胶的结构和性能相似，是极具开发前景的产胶作物。近年来，通过种质资源调查和收集获得的橡胶草种质为橡胶草的品种改良提供了丰富的材料，但目前含胶量最高的仅为9％左右，通过橡胶草提取天然橡胶的成本仍很高。因此，创制高含胶量新种质是橡胶草产业化的关键。
[0003]
菊糖和天然橡胶是橡胶草的两个重要代谢产物，其合成的共同底物是蔗糖，但在橡胶草根部菊糖的含量远高于天然橡胶。已有的研究表明，橡胶草根部的菊糖和天然橡胶的积累存在竞争性，抑制菊糖合成可能是提高橡胶草根部天然橡胶含量的有效途径。蔗糖在乳管细胞中经过甲羟戊酸途径(mva)合成天然橡胶(顺式-1,4-聚异戊二烯)，而菊糖专一性地在橡胶草根部积累，其合成是以蔗糖为底物，由蔗糖-1-果糖基转移酶(1-sst,ec2.4.1.99)和果聚糖:果聚糖1-果糖基转移酶(1-fft,ec2.4.1.100)催化完成。因此，敲除橡胶草菊糖合成酶基因1-sst和1-fft，可获得橡胶草菊糖合成缺陷型新种质，可提高蔗糖的供应从而促进天然橡胶的合成。
[0004]
crispr/cas9系统是一种高效的基因组dna编辑技术，其实现基因编辑的原理是利用一段靶基因序列特异的sgrna引导cas9核酸内切酶对靶基因的dna进行切割、编辑，而且这种突变可以稳定遗传。与化学诱变、物理诱变、dna插入突变等诱变技术相比，crispr/cas9技术具有靶标明确、突变效率高、多靶点同时突变等优点，是种质创新的强有力工具。crispr/cas9编辑的特异性由人工设计的sgrna来决定，精确靶向的sgrna是实现定点突变的关键。而目前橡胶草中尚未有利用crispr/cas9技术实现多个靶位点同时突变的报道。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供利用crispr/cas9系统同时靶向敲除橡胶草菊糖合成酶基因1-sst和1-fft的sgrna、表达盒、载体和宿主细胞。本发明的另一目的是提供一种利用crispr/cas9系统同时敲除橡胶草1-sst和1-fft基因的方法。
[0006]
本发明以橡胶草菊糖合成酶基因1-sst和1-fft为目标基因，开发利用crispr/cas9系统同时靶向敲除1-sst和1-fft的方法。在研发过程中，本发明针对1-sst和1-fft设计了多组打靶sgrna，并发现不同的sgrna序列对于1-sst和1-fft同时靶向敲除的效率影响较大。各sgrna除需要尽量降低脱靶效应，提高打靶效率外，靶向1-sst和1-fft基因的sgrna
的打靶效率还需要相互协调才能够实现高效的两基因同时靶向敲除。
[0007]
具体地，本发明提供以下技术方案：
[0008]
第一方面，本发明提供利用crispr/cas9系统同时靶向敲除橡胶草菊糖合成酶基因1-sst和1-fft的sgrna，所述sgrna包括靶向1-sst基因的sgrna-sst1和sgrna-sst2以及靶向1-fft基因的sgrna-fft1和sgrna-fft2；sgrna-sst1、sgrna-sst2、sgrna-fft1和sgrna-fft2依次分别包含如seq id no.1-4所示的序列。
[0009]
利用上述4个打靶sgrna能够显著提高1-sst和1-fft基因同时靶向敲除的效率。
[0010]
第二方面，本发明提供包含所述sgrna的表达盒。
[0011]
以上所述的表达盒还包含用于驱动所述sgrna转录的启动子，所述启动子为选自启动子atu6-1、atu6-29、atu3b和atu3d中的任意一个或多个。
[0012]
优选地，以atu6-1启动子驱动sgrna-sst1转录，以atu6-29启动子驱动sgrna-sst2转录，以atu3b启动子驱动sgrna-fft1转录，以atu3d启动子驱动sgrna-fft2转录。
[0013]
atu6-1启动子的序列为seq id no.6所示序列的第7926～8248位，atu6-29启动子的序列为seq id no.6所示序列的第8382～8719位，atu3b启动子的序列为seq id no.6所示序列的第8854～9197位，atu3d启动子的序列为seq id no.6所示序列的第9332～9452位。
[0014]
启动子的强度影响sgrna的转录水平，本发明发现，采用上述启动子和sgrna的组合方式能够使得各sgrna更好地协调作用，进一步提高1-sst和1-fft基因同时靶向敲除的效率。
[0015]
具体地，所述表达盒的结构如下：atu6-1-sgrna-sst1-atu6-29-sgrna-sst2-atu3b-sgrna-fft1-atu3d-sgrna-fft2。
[0016]
作为本发明的优选方案，所述表达盒的序列如seq id no.5所示。
[0017]
第二方面，本发明提供利用crispr/cas9系统同时靶向敲除橡胶草菊糖合成酶基因1-sst和1-fft的载体，该载体包含所述sgrna或包含所述表达盒。
[0018]
以上所述的载体还包含cas9基因和筛选标记基因。其中，所述cas9基因编码cas9蛋白。所述筛选标记基因可为植物转基因过程中常用的筛选标记基因，包括但不限于bar基因等。
[0019]
以上所述的载体可为将本发明所述的含有sgrna的表达盒连接至常用的crispr/cas9基因编辑载体骨架得到。
[0020]
优选地，所述载体的序列如seq id no.6所示。该载体能够在橡胶草中实现高效的1-sst和1-fft基因同时靶向敲除。
[0021]
第三方面，本发明提供包含所述sgrna或所述表达盒或所述载体的宿主细胞。
[0022]
优选地，所述宿主细胞微生物细胞或非繁殖性植物细胞。
[0023]
第四方面，本发明提供所述sgrna或所述表达盒或所述载体或所述宿主细胞在提高橡胶草根部的蔗糖、果糖或天然橡胶含量，或者在降低橡胶草根部的菊糖含量中的应用。
[0024]
本发明还提供所述sgrna或所述表达盒或所述载体或所述宿主细胞在橡胶草遗传育种或种质资源改良中的应用。
[0025]
优选地，所述应用为选育橡胶草菊糖合成缺陷型种质或高产天然橡胶种质。
[0026]
第五方面，本发明提供一种利用crispr/cas9系统同时靶向敲除橡胶草菊糖合成
酶基因1-sst和1-fft的方法，其为：将所述sgrna或所述表达盒或所述载体转入橡胶草中，经筛选获得菊糖合成酶基因1-sst和1-fft同时敲除的橡胶草植株。
[0027]
具体地，所述方法包括如下步骤：
[0028]
(1)分别在菊糖合成酶基因1-sst和1-fft的编码区筛选特异性打靶sgrna，sgrna-sst1(seq id no.1)和sgrna-sst2(seq id no.2)同时靶向1-sst基因，sgrna-fft1(seq id no.3)和sgrna-fft2(seq id no.4)同时靶向1-fft基因；
[0029]
(2)以中间载体ylgrna-atu6/atu3为模板，根据打靶sgrna设计并合成用于表达盒扩增的引物，通过overlapping pcr扩增将启动子、靶点和grna构建成完整的表达盒；
[0030]
(3)以crispr/cas9基因编辑载体pylcrispr/cas9双元表达载体为骨架，将含有不同靶标sgrna的表达盒与pylcrispr/cas9载体连接，获得重组表达载体sst-fft-cas9并转入农杆菌菌株；
[0031]
(4)采用农杆菌介导的方式将含有重组表达载体的农杆菌侵染转化橡胶草，通过诱导分化和抗性筛选获得再生植株；
[0032]
(5)提取阳性植株dna，分别设计1-sst(seq id no.7和seq id no.8)和1-fft(seq id no.9和seq id no.10)基因的特异性扩增引物，通过pcr扩增跨越sgrna位点的片段并测序验证，鉴定植株突变位点，筛选获得1-sst和1-fft基因同时突变的橡胶草。
[0033]
上述步骤(2)中，以中间载体ylgrna-atu6/atu3为模板，利用引物sst1-grt1(seq id no.11)、sst1-atu6-1t1(seq id no.12)、sst2-grt2(seq id no.13)、sst2-atu6-29t2(seq id no.14)、fft1-grt3(seq id no.15)、fft1-atu3bt3(seq id no.16)、fft2-grt4(seq id no.17)、fft2-atu3dt4(seq id no.18)，通过overlapping pcr扩增获得完整的表达盒atu6-1-sst1-sgrna、atu6-29-sst2-sgrna、atu3b-fft1-sgrna、atu3d-fft2-sgrna。
[0034]
上述步骤(3)中，所述重组表达载体sst-fft-cas9中，用atu6-1启动子驱动sgrna-sst1(seq id no.1)，用atu6-29启动子驱动sgrna-sst2(seq id no.2)，用atu3b启动子驱动sgrna-fft1(seq id no.3)，用atu3d启动子驱动sgrna-fft2(seq id no.4)，重组载体sst-fft-cas9的序列如seq id no.6所示。
[0035]
上述步骤(4)中，采用橡胶草组培苗根段进行侵染转化。
[0036]
本发明的有益效果在于：本发明提供的特异性靶向菊糖合成酶基因1-sst和1-fft的sgrna能够高效引导内切酶蛋白cas9在靶点位置进行切割并产生双链dna断裂，结合抗性筛选和dna测序实现精确、高效地同时敲除橡胶草菊糖合成酶基因1-sst和1-fft。本发明提供一种方便、高效的方法创制橡胶草菊糖合成酶基因突变体，有效地避免了常规诱变育种中存在的周期长、突变不确定性、筛选难度大、成本高等问题，为橡胶草优良种质的选育提供了新方法。
附图说明
[0037]
图1为本发明实施例1中同时靶向菊糖合成酶基因1-sst和1-fft的crispr/cas9重组表达载体sst-fft-cas9的结构图。
[0038]
图2为本发明实施例3中t0代植株在1-sst和1-fft基因靶点区域dna测序结果，1-sst/wt和1-fft/wt分别为野生型对照wt的1-sst和1-fft基因部分序列，突变体m2-2为转化后植株基因部分序列，突变体m2-2在1-sst基因的第2个靶标(sgrna-sst2)发生2个碱基删
除，从而导致基因阅读框改变和基因失活；同时1-fft基因序列与野生型对照wt相比，在靶标1(sgrna-fft1)与靶标2(sgrna-fft2)之间发生了大片段缺失，删除了504bp，从而导致基因失活。
[0039]
图3为本发明实施例3中t0代突变体植株与野生型植株表型，t0代突变体m2-2与野生型对照wt相比，突变体的叶片明显变宽，叶长变短。
具体实施方式
[0040]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明各实施例所涉及的引物信息如表1所示。
[0041]
表1 引物信息
[0042]
[0043][0044]
实施例1橡胶草菊糖合成酶基因1-sst和1-fft的sgrna设计及其crispr/cas9重组表达载体sst-fft-cas9构建
[0045]
1、sgrna打靶位点筛选
[0046]
由于橡胶草为自交不亲和植物，不同品系间基因序列存在差异，通过比较不同种质中1-sst和1-fft基因序列，分别在两个基因的保守区域寻找pam序(ngg)，在pam位置5
’
端20bp的一段序列即为sgrna序列，并在已公布的橡胶草基因组序列中进行搜索分析靶标的特异性。
[0047]
本发明经大量筛选确定了靶向1-sst基因的2条sgrna(sgrna-sst1和sgrna-sst2)，其序列如seq id no.1和seq id no.2所示(二者均位于第4外显子中)，以及靶向1-fft基因的2条sgrna(sgrna-fft1和sgrna-fft2)，其序列如seq id no.3和seq id no.4所示(二者均位于第2外显子中)。
[0048]
2、crispr/cas9重组表达载体sst-fft-cas9的构建
[0049]
参考文献报道方法(刘耀光课题组，ma x,zhang q,zhu q,et al..a robust crispr/cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[j].molecular plant,2015,8(8):1274-1284.)，利用overlapping pcr和酶切连接的方法构建atu6-1驱动sgrna-sst1、atu6-29驱动sgrna-sst2、atu3b驱动sgrna-fft1、atu3d驱动sgrna-fft2和cas9蛋白的表达载体，最终将这4个片段同时连入经bsaⅰ酶切的pylcrispr/cas9p
ubi-b载体中。具体过程如下：
[0050]
(1)sgrna表达盒的构建
[0051]
overlapping pcr第一轮pcr扩增：以中间载体ylgrna-atu6/atu3为模板，atu6-1-sst1-sgrna表达盒扩增引物对：u-f/sst1-atu6-1t1(反应1)、gr-t/sst1-grt1(反应2)；atu6-29-sst2-sgrna表达盒扩增引物对：u-f/sst2-atu6-29t2(反应1)、gr-t/sst2-grt2(反应2)；atu3b-fft1-sgrna表达盒扩增引物对：u-f/fft1-atu3bt3(反应1)、gr-t/fft1-grt3(反应2)；atu3d-fft2-sgrna表达盒扩增引物对：u-f/fft2-atu3dt4(反应1)、gr-t/fft2-grt4(反应2)。pcr扩增体系：2
×
phanta max buffer 7.5μl；10mmol/l dntps mix 0.25μl；phanta max polymerase 0.2u；ylgrna-atu6/atu3 2～5ng；10μmol/l u-f和u#-t#各0.3μl(反应1)；10μmol/l gr-t#和gr-r各0.3μl(反应2)；ddh2o补足到15μl。pcr扩增程序为：95℃10s,58℃15s,72℃15s，扩增25～26个循环。
[0052]
第二轮pcr：各表达反应1和反应2产物稀释10倍后分别混合后作为模板，分别利用引物对pps-r/pgs-2(用于atu6-1-sst1-sgrna表达盒)、pps-2/pgs-3(用于atu6-29-sst2-sgrna表达盒)、pps-3/pgs-4(用于atu3b-fft1-sgrna表达盒)、pps-4/pgs-l(用于atu3d-fft2-sgrna表达盒)进行第二轮pcr反应。pcr扩增体系：2
×
phanta max buffer 15μl；10mmol/l dntp mix 0.5μl；phanta max 0.4u；10μmol/l混合通用引物0.5μl；反应1+反应2稀释液1μl；ddh2o补足到30μl；pcr扩增程序为：95℃10s,58℃15s,72℃20s，扩增25～28pcr循环。
[0053]
(2)将sgrna表达盒克隆到pylcrispr/cas9p
ubi-b载体上：使用基于bsaⅰ酶切和连接的“金门”克隆方法，以“边切边连”法组装sgrna表达盒到pylcrispr/cas9p
ubi-b载体上。反应体系：10
×
cutsmart buffer 1.5μl；10mmol/l atp 1.5μl；pylcrispr/cas9p
ubi-b质粒60～80ng；纯化后的混合sgrna表达盒每个表达盒10～15ng，4个共约60～70ng；bsa i-hf 10 u；t4 dna ligase 35 u；ddh2o补足到15μl。用变温循环(可使用pcr仪)进行边切边连反应10～15循环(37℃5min,10℃5min,20℃5min)；最后37℃5min。
[0054]
(3)连接产物转化：将连接产物滴载在悬浮于0.2
×
te的透析膜millipore vswp04700上4℃透析15～20min。取1～1.5μl透析的连接产物电激转化e.coli dh10b感受态细胞。电激后加入1ml soc培养基37℃恢复培养1h，将转化细胞涂在含卡那霉素(25μg/ml)的lb平板培养过夜。
[0055]
(4)阳性克隆筛选：挑取数个菌落培养和提取质粒，并用ascⅰ酶切和电泳确认，然后进行测序验证，确认构建成功，重组载体sst-fft-cas9的结构如图1所示。
[0056]
3、重组载体sst-fft-cas9导入农杆菌：将上述2中获得的阳性克隆提取质粒，并电激转化农杆菌(如agl1)。阳性克隆用所有靶点接头正向引物和反向引物配对进行pcr扩增验证。
[0057]
实施例2重组表达载体sst-fft-cas9转化橡胶草获得再生植株
[0058]
1、橡胶草无菌苗的获得：橡胶草品系20112的种子为材料，采用浓度为10-15％(v/v)的次氯酸钠溶液(原液按100％用)，按1滴(20μl)/200ml加入tritonx-100混匀制成消毒液，用消毒液对种子进行消毒10-15分钟，无菌水冲洗3-5次后播种于1/2ms培养基中催芽，5天后转接一次1/2ms培养基培养20天左右获得根系生长情况良好的无菌苗。
[0059]
2、取生长状态良好的无菌苗的根，经无菌水洗2-3次后，用滤纸吸干用于侵染转化。
[0060]
3、农杆菌侵染转化：含有重组质粒sst-fft-cas9的农杆菌agl1用侵染液(ms+:20g/l蔗糖+1.5mg/l 6-ba+0.05mg/l naa+200μm乙酰丁香酮)悬浮调整od
600
值为0.5-0.8，根切成0.5-1.0cm的根段进行侵染20-30分钟。
[0061]
4、侵染根段移至滤纸上21-25℃黑暗共培养1-3天，然后转接至分化培养基(ms+20g/l蔗糖+1.5mg/l 6-ba+0.05mg/l naa+500mg/l特美汀+3.95g/l植物凝胶+5mg/l basta)诱导分化不定芽，分化培养条件均为21-25℃，光周期为光照16-18小时，黑暗6-8小时。
[0062]
5、再生植株生根与抗性筛选：将分化的不定芽转接至生根培养基(1/2ms+10g/l蔗糖+300mg/l特美汀+4.0g/l植物凝胶+10mg/l basta)，每隔2-3周转接一次相同的培养基，共转接2-3次进行抗性筛选，最终获得抗性的再生植株。
[0063]
6、炼苗移栽：将生根良好的再生植株打开封口3-4天，之后移栽到基质中，并套上干净塑料膜保持湿度。3天后逐渐开孔防风，使植株适应外界环境。
[0064]
实验例3转基因植株突变检测及其表型
[0065]
1、转化植株筛选与检测
[0066]
dna提取：用购自天根生化科技(北京)有限公司的dna提取试剂盒抽提实施例2获得的t0代植株基因组dna。
[0067]
2、1-sst和1-fft基因pcr扩增
[0068]
使用kod-fx(toyobo，cat.no.kfx-101，上海)对t0代植株进行pcr扩增，反应体系为：基因组dna 80-100ng，上、下游引物(sst-390f/sst-1355r引物对扩增1-sst基因靶位点；fft-338f/fft-1322r引物对扩增1-fft基因靶位点)(10μmol/l)各1.5μl，2
×
pcr buffer 25μl，dntp mix 10μl，kod polymerase1.0μl，加ddh2o至50μl。pcr扩增程序为：98℃变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸30s，共32个循环；最后72℃延伸2min；4℃保存。
[0069]
3、样品测序及其序列分析
[0070]
分别将以上1-sst和1-fft基因的pcr产物回收纯化之后连接到t载体，送广州艾基生物技术有限公司进行测序验证。测序结果如图2所示，1-sst/wt和1-fft/wt分别为野生型对照wt的1-sst和1-fft基因部分序列，突变体m2-2为转化后植株基因部分序列，从图中可以看出，突变体m2-2在1-sst基因的第2个靶标(sgrna-sst2)发生2个碱基删除，从而导致基因阅读框改变和基因失活；同时1-fft基因序列与野生型对照wt相比，在靶标1(sgrna-fft1)与靶标2(sgrna-fft2)之间发生了大片段缺失，删除了504bp，从而导致基因失活；表明利用本发明提供方法成功实现了对菊糖合成酶基因1-sst和1-fft的同时编辑。在17株抗性植株中检测到1株1-sst和1-fft同时突变的株系，双基因的突变频率为5.88％。
[0071]
4、突变体表型观察
[0072]
如图3和表2所示，t0代突变体m2-2与野生型对照wt相比，突变体的叶片明显变宽，叶长变短，其根部蔗糖和果糖含量显著升高，而菊糖含量显著下降。结果表明，突变体中菊糖合成酶基因1-sst和1-fft敲除后使得植株的菊糖含量降低，通过多代的纯化有望获得纯合的菊糖合成缺陷型突变体，为后期选育产胶型橡胶草品系提供优良的材料。
[0073]
表2 突变体m2-2与野生型对照wt的表型统计结果
[0074]
株系名称叶宽叶长蔗糖含量果糖含量菊糖含量wt 201120.576.212.35％1.64％21.22％m2-21.484.158.83％6.81％6.77％
[0075]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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