一种亚细胞定位表达载体及构建方法与流程

[0001]
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种亚细胞定位表达载体及构建方法。


背景技术：

[0002]
目前，最接近的现有技术：近年来，随着植物全基因组测序的快速发展，一大批植物物种完成了参考序列的拼接、组装和注释。对基因进行解析并明确其功能已成为我们了解生命密码的必需步骤。目前植物科学研究中，功能基因研究离不开载体的构建。
[0003]
目前常用的载体构建方法有gateway系统的同源重组法、胡向阳研究组开发的ta克隆法以及pcambia系列载体。gateway系列载体利用载体上面的attr和attl序列，通过同源重组酶，将片段插入到载体中，采用毒性蛋白ccdb和相应的抗生素进行筛选；胡向阳团队开发的ta克隆系列载体，利用非高保真酶扩增得到的pcr产物末端含有突出的碱基a的特点，利用限制性内切酶xcmi切割载体，产生突出的碱基t，然后利用碱基a∷t配对的方式将目的片段插入到载体中。
[0004]
上述两种方法都极好的利用了毒性蛋白ccdb，以及相应抗生素筛选的方法，所产生的片段均为零背景的目的克隆。但目前同源重组酶的价格相对较高，ta克隆则存在连接效率较低的情况。pcambia系列载体采用的是限制性内切酶连接的方式将目的基因插入到载体中，连接效率高，该方法目前实验中采用的较多。但该系列的载体不含有毒性蛋白，仅采用相应抗生素进行筛选，得到的克隆中，时常存在假阳性，即不能排除空载的情况。
[0005]
综上所述，现有技术存在的问题是：（1）目前同源重组酶的价格相对较高，ta克隆则存在连接效率较低的情况。
[0006]
（2）pcambia系列载体不含有毒性蛋白，仅采用相应抗生素进行筛选，得到的克隆中，时常存在假阳性，即不能排除空载的情况。
[0007]
解决上述技术问题的意义：本发明将ccdb毒性蛋白与限制性内切酶位点进行聚合，构建出既含有多个限制性内切酶位点，又含有ccdb毒性蛋白筛选的亚细胞定位载体。该载体既可以用于瞬时转化，研究亚细胞定位，也可以利用农杆菌介导的方法，获得稳定的转基因植株。获得的转基因材料可以用于下一步的生理生化与功能分析。
[0008]
本发明加快和简化了载体构建的速度，方便基因功能的研究。


技术实现要素：

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针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种亚细胞定位表达载体的构建方法。
[0010]
本发明是这样实现的，一种亚细胞定位表达载体的构建方法，所述亚细胞定位表达载体的构建包括以下步骤：（1）从ta载体（参考文献wang, c., et al. (2013). a series of ta-based and zero-background vectors for plant functional genomics）中获得ccdb毒性蛋白，同时
利用pcr在gateway载体p2fgw7中扩增得到egfp片段，在pcambia载体中获得多克隆位点以及载体的骨架，获得p35s∷ccdb-egfp片段。
[0011]
（2）用多克隆位点进行酶切后，所获得的线性片段中不再含有ccdb蛋白，同时获得黏性末端，可以利用连接酶将含有相应黏性末端的目的片段插入到载体中。
[0012]
（3）利用任意一种限制性内切酶消化后，然后利用连接酶将片段进行连接，可以获得p35s∷egfp载体，该载体产生的蛋白质可以进入细胞的任意结构，用于阳性对照。
[0013]
进一步，所述ccdb包含306bp的碱基，egfp为增强型绿色荧光蛋白，其中有7个限制性内切酶位点可以使用，分别为ecori、saci、smai、bamhi、xbai、psti和hindiii。
[0014]
进一步，所述p35s∷egfp载体中，目的片段与egfp基因之间插入了15个碱基的linker。
[0015]
本发明另一目的在于提供所述亚细胞定位表达载体序列为seq id no.1。
[0016]
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明的亚细胞定位载体既可以用于稳定表达也可以瞬时表达，研究亚细胞定位。
[0017]
本发明的载体含有egfp，其荧光信号强。
[0018]
本发明的载体引入了ccdb毒性蛋白和卡那霉素两个筛选标记，几乎能避免所有的假阳性克隆本发明的多克隆位点的限制性内切酶位点数多达7个，几乎能满足所有基因的亚细胞定位载体的使用。
[0019]
本发明创造性的引入了15个碱基的linker，能有效的避免egfp影响目的蛋白正常折叠的现象的发生，有利于目的蛋白能够正常的亚细胞定位。
附图说明
[0020]
图1是本发明实施例提供的亚细胞定位表达载体的构建方法流程图。
[0021]
图2是本发明实施例提供的p35s∷ccdb-egfp片段结构图。
[0022]
图3是本发明实施例提供的阳性对照的亚细胞定位结果图。
[0023]
具体实施方式
[0024]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0025]
目前同源重组酶的价格相对较高，ta克隆则存在连接效率较低的情况。
[0026]
pcambia系列载体不含有毒性蛋白，仅采用相应抗生素进行筛选，得到的克隆中，时常存在假阳性，即不能排除空载的情况。
[0027]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种亚细胞定位表达载体及构建方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0028]
如图1所示，本发明实施例提供的亚细胞定位表达载体的构建方法包括以下步骤：s101：ta载体中获得ccdb毒性蛋白，同时利用pcr在gateway载体p2fgw7中扩增得到egfp片段，在pcambia载体中获得多克隆位点以及载体的骨架，获得p35s∷ccdb-egfp片段。
[0029]
s102：用多克隆位点进行酶切后，所获得的线性片段中不再含有ccdb蛋白，同时获得黏性末端，可以利用连接酶将含有相应黏性末端的目的片段插入到载体中。
[0030]
s103：利用任意一种限制性内切酶消化后，然后利用连接酶将片段进行连接，可以获得p35s∷egfp载体，该载体产生的蛋白质可以进入细胞的任意结构，用于阳性对照。
[0031]
本发明在ta载体中获得ccdb毒性蛋白，同时利用pcr在gateway载体p2fgw7中扩增得到egfp片段，在pcambia载体中获得多克隆位点以及载体的骨架，获得p35s∷ccdb-egfp片段（如图2所示）。其中ccdb包含306bp的碱基，egfp为增强型绿色荧光蛋白，其中有7个限制性内切酶位点可以使用，分别为ecori、saci、smai、bamhi、xbai、psti和hindiii。用上述多克隆位点进行酶切后，所获得的线性片段中不再含有ccdb蛋白，同时获得黏性末端，可以利用连接酶将含有相应黏性末端的目的片段插入到载体中。
[0032]
利用上述任意一种限制性内切酶消化后，然后利用连接酶将片段进行连接，可以获得p35s∷egfp载体，该载体产生的蛋白质可以进入细胞的任意结构，用于阳性对照。采用限制性内切酶切除ccdb毒性蛋白，然后载体自连，作为阳性对照的亚细胞定位结果如图3所示。
[0033]
本载体中创造性的在目的片段与egfp基因之间插入了15个碱基的linker。相关的研究表明，egfp与目的基因的直接连接可能会影响部分蛋白质的折叠，从而目的蛋白不能够正常的亚细胞定位。
[0034]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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