一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

[0001]
本发明涉及一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测技术领域。


背景技术：

[0002]
嘧菌酯(azoxystrobin)，商品名为阿米西达，是由先正达公司开发的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，是一个广谱、高效杀菌剂，具有内吸性传导性好，渗透性强、持效期长等特点，对几乎所有真菌病害都具有保护、治疗和铲除作用，使用方式多样，不但可用于茎叶喷雾，也可用于种子处理和土壤处理。由于嘧菌酯防治病害的范围特别广，可适用于小麦、玉米、水稻等多种粮食作物，花生、棉花、芝麻、烟草等经济作物，番茄、西瓜、黄瓜、茄子、辣椒等蔬菜作物，苹果、梨树、猕猴桃、芒果、荔枝、龙眼、香蕉等果树，以及中药材、花卉等上百种作物。在我国农药检定所登记有400多个制剂，也是登记最多的一个杀菌剂品种。
[0003]
《gb 2763—2019食品中农药最大残留限量》中规定了嘧菌酯在各种食品中的最大残留限量标准（mrl），如其在稻谷中的mrl为1 mg/kg，在糙米和小麦中的mrl均为0.5 mg/kg，在黄瓜中的mrl为0.5 mg/kg，在马铃薯中的mrl为0.1 mg/kg，以及在柑、橘和橙中的mrl均为1 mg/kg。
[0004]
为了有效监督监测食品中嘧菌酯的使用情况，需要一种特异性好，灵敏度高的测定方法，而目前检测方法如气相色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等，其样品前处理过程较为复杂、成本昂贵，加上食品中干扰物较多，因此仪器方法并不适用于现场检测。免疫学检测方法是一种低成本、快速且高灵敏度高特异性的免疫学检测方法，而且操作简便，已广泛适用于药物残留检测领域。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是其重要前提。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对嘧菌酯具有较高的检测灵敏度，可以用来建立嘧菌酯的免疫学检测方法。
[0006]
本发明的技术方案，一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株abc04，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号cgmcc no.19175。
[0007]
嘧菌酯单克隆抗体，它由所述保藏编号为cgmcc no.19175的杂交瘤细胞株abc04分泌产生。
[0008]
本发明提供的嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株abc04的制备基本步骤为：（1）半抗原的合成：
嘧菌酯半抗原的合成方案如上式所示。将嘧菌酯（25g，62mmol）加入三口瓶中，加入thf(375ml)，控温30℃以下滴加配好的naoh溶液(6.8g，170 mmol)25ml，随后升温至68℃反应5h。向反应液中滴加1n的hcl调ph至5，过滤固体，母液用ea萃取2次，有机相合并干燥，旋干溶剂，经硅胶柱纯化，纯化后溶于300ml的dmso，中压（10 bar）制备色谱，再把产物用ea溶解，采用薄层色谱法得到嘧菌酯半抗原。
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（2）完全抗原和包被原的制备：完全抗原的制备：称取4.5 mg 嘧菌酯半抗原，用200μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，然后加入6.7 mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，4.0 mg n-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6 h（称为嘧菌酯半抗原活化液）。将钥孔血蓝蛋白 10 mg，用3ml硼酸缓冲溶液溶解（称为蛋白a液），在室温条件，将嘧菌酯半抗原活化液缓慢加入到蛋白a液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得完全抗原；包被原的制备：称取7.8mg 嘧菌酯半抗原，用300μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，随后加入11.5 mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，6.9 mg n-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6h（称为嘧菌酯半抗原活化液）。称取10 mg 鸡卵白蛋白ova，溶解于2ml硼酸缓冲溶液中（称为b液），在室温条件下，将嘧菌酯半抗原活化液逐滴加入到b液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得包被原。
[0010]
（3）小鼠的免疫：嘧菌酯完全抗原与等体积完全弗氏佐剂混合乳化后，通过颈背部皮下注射balb/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫用不完全弗氏佐剂。每一次加强免疫之间均间隔3周。最后一次加强免疫采用完全抗原（不含佐剂）进行腹腔注射；通过间接竞争酶联免疫法（ic-elisa）检测血清效价和抑制率。
[0011]
（4）细胞融合与细胞株建立：通过peg法将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合，通过hat培养基选择性培养，ic-elisa检测细胞孔的阳性和抑制率，通过有限稀释法对阳性及抑制率较高的杂交瘤细胞进行亚克隆，最终筛选获得嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株abc04。
[0012]
（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-elisa测定灵敏度。
[0013]
取高效价低ic
50
小鼠的脾细胞，通过peg方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株abc04。
[0014]
本发明的有益效果：本发明提供的细胞株abc04分泌的单克隆抗体，对嘧菌酯具有
较好的特异性和检测灵敏度（ic
50
值为0.03 ng/ml），可实现对果蔬、谷物中嘧菌酯残留量的检测，为食品中嘧菌酯残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
[0015]
生物材料样品保藏：一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株abc04，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号cgmcc no.19175。
附图说明
[0016]
图1本发明abc04单克隆抗体对嘧菌酯的抑制标准曲线。
具体实施方式
[0017]
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0018]
本发明通过将嘧菌酯完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，hat选择性培养基培养，通过ic-elisa筛选细胞上清，最终得到了对嘧菌酯有较高灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0019]
实施例1 杂交瘤细胞株abc04的制备（1）半抗原的合成：嘧菌酯半抗原的合成方案如上式所示。将嘧菌酯（25g，62mmol）加入三口瓶中，加入thf(375ml)，控温30℃以下滴加配好的naoh溶液(6.8g，170 mmol)25ml，随后升温至68℃反应5h。向反应液中滴加1n的hcl调ph至5，过滤固体，母液用ea萃取2次，有机相合并干燥，旋干溶剂，经硅胶柱纯化，纯化后溶于300ml的dmso，中压（10 bar）制备色谱，再把产物用ea溶解，采用薄层色谱法得到嘧菌酯半抗原。
[0020]
（2）完全抗原和包被原的制备：完全抗原的制备：称取4.5 mg 嘧菌酯半抗原，用200μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，然后加入6.7 mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，4.0 mg n-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6 h（称为嘧菌酯半抗原活化液）。将钥孔血蓝蛋白 10 mg，用3ml硼酸缓冲溶液溶解（称为
蛋白a液），在室温条件，将嘧菌酯半抗原活化液缓慢加入到蛋白a液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得完全抗原；包被原的制备：称取7.8mg 嘧菌酯半抗原，用300μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，随后加入11.5 mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，6.9 mg n-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6h（称为嘧菌酯半抗原活化液）。称取10 mg 鸡卵白蛋白ova，溶解于2ml硼酸缓冲溶液中（称为b液），在室温条件下，将嘧菌酯半抗原活化液逐滴加入到b液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得包被原。
[0021]
（3）小鼠的免疫：嘧菌酯完全抗原与等体积完全弗氏佐剂混合乳化后，通过颈背部皮下注射balb/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫用不完全弗氏佐剂。每一次加强免疫之间均间隔3周。最后一次加强免疫采用完全抗原（不含佐剂）进行腹腔注射；通过间接竞争酶联免疫法（ic-elisa）检测血清效价和抑制率。
[0022]
（4）细胞融合：在最后一次加强免疫三天后，按照常规peg法进行细胞融合，具体步骤如下：a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入 75% 酒精中消毒，浸泡 5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用rpmi-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；b、收集sp2/0细胞：融合前 7-10 天，将 sp2/0 瘤细胞用含10% fbs（胎牛血清）rpmi-1640 培养基在5% co2培养箱中培养。融合前要求sp2/0瘤细胞数量达到（1~ 4）
×
107，保证融合前sp2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；c、融合过程7min。第1min，将1ml的peg 1500 由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min 和第4min，在1min内滴加1ml rpmi-1640培养基；第5min 和第6min，在1min内滴加2ml rpmi-1640 培养基；第7min，每10s 滴加1ml 的 rpmi-1640 培养基。然后37℃温浴5 min。离心（800 rpm，8 min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清、2%的50
×
hat的rpmi-1640筛选培养液中，按照200μl/ 孔加到 96 孔细胞板，置于37℃、5% co2培养箱中培养。
[0023]
（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清，1%的100
×
ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-elisa筛选出阳性细胞孔，第二步选用嘧菌酯为标准品，用ic-elisa对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对嘧菌酯标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株abc04。
[0024]
（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1
×
106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 igg型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 m pbs溶液（ph7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存；6.1包被：将包被原tdf-ova用0.05m ph9.6 碳酸盐缓冲液从1
µ
g/ml开始倍比稀释，100
μl/孔，37℃反应2h；6.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；6.3封闭：拍干后，加入200μl /孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；6.4加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μl /孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反应30min；6.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的tmb显色液，37℃避光反应15min；6.6终止和测定：每孔加入50μl终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od 450值。
[0025]
用ic-elisa测定嘧菌酯单克隆抗体的ic
50
为0.03ng/ml，说明对嘧菌酯有很好的灵敏度，可用于嘧菌酯免疫分析检测。
[0026]
溶液的配置：碳酸盐缓冲液（cbs）：称取na2co
3 1.59 g，nahco
3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至1000ml，4℃贮存备用；磷酸盐缓冲液（pbs）：8.00g nacl，0.2g kcl，0.2g kh2po4，2.9g na2hpo4·
12 h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2～7.4，定容至1000ml；pbst：含0.05 % 吐温 20的pbs；tmb显色液：a液：na2hpo
4.
12h2o 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000ml；b液：60mg tmb 溶于100ml乙二醇中。a、b液按体积比1:5混合即为tmb显色液，现用现混。

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