新型发酵乳杆菌LM1016菌株及包含其的用于预防或治疗心血管疾病的组合物的制作方法

新型发酵乳杆菌lm1016菌株及包含其的用于预防或治疗心血管疾病的组合物
技术领域
[0001]
本发明涉及发酵乳杆菌lm1016(lactobacillus fermentum lm1016)的新型菌株。上述本发明的新型菌株具有同时治疗或预防心血管疾病、肥胖、脂肪肝及糖尿病的优秀效果。
[0002]
具体地，本发明的发酵乳杆菌lm1016菌株不仅减少作为心血管疾病的独立风险因子的c反应蛋白(crp，c-reactive protein)的数值，同时具有减少血中中性脂肪及胆固醇的浓度的效果。并且，通过抑制体内脂肪堆积来预防超重，通过减少血糖浓度及胰岛素浓度来抑制胰岛素抗性，从而具有预防及治疗糖尿病的效果。并且，本发明还具有如下效果，即，通过抑制肝脏组织中的脂肪堆积来抑制及减少脂肪肝的发生。


背景技术：

[0003]
心血管疾病为发生在心脏及主动脉的疾病，即，主动脉被堵塞或扩张或破裂而导致出血的疾病。根据2015年的统计局的数据，因心血管疾病而死亡的人数为28260名，为韩国第二大死因且单一疾病的第一死因。尤其，在55岁以上的男性、65岁以上的女性中循环系统疾病的死亡率大幅增加。
[0004]
代表性的心血管疾病有心肌梗塞症、心绞痛、心力衰竭、心房颤动、脑卒中等，主要原因可以例举中老年以上的年龄、高血压、高脂血症、糖尿病、吸烟、缺乏运动和超重等。因此，为了预防心肌梗塞或中风，在最近的治疗指南中，通过向患有血管疾病、糖尿病或高脂血症的患者使用他汀类药物来降低低密度脂蛋白(ldl)。但确认到，一半以上的心肌梗塞或脑卒中的发病患者具有正常的低密度脂蛋白数值。
[0005]
根据最近的研究结果表明，炎症为动脉硬化的主要病因，尤其，c反应蛋白为动脉硬化等心血管疾病的主要病因，随着c反应蛋白与动脉硬化的过程直接相关的事实被众所周知，c反应蛋白作为心血管疾病的新的生物标记物备受瞩目。
[0006]
多种研究表明，c反应蛋白为心血管疾病的独立风险因子，独立于先前确定的风险因素(risk factor)来作用，与以最重要的风险因素之一而周知的低密度脂蛋白胆固醇的数值无关，且直接关系到心血管疾病。已通过2008年完成的前瞻性大规模临床试验的结果证实这种假设，由此，在临床试验中使用的瑞舒伐他汀(rosuvastatin)与低密度脂蛋白数值无关地作为预防心血管疾病的药物在包括美国食品药品监督管理局在内的多个国家中获得了许可。
[0007]
c反应蛋白抑制氧化氮的产生，通过增加内皮素分泌来增加如细胞间黏附分子-1(icam-1)、血管细胞黏附分子(vcam)的黏附分子和如单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)的化学趋化因子，从而可降低血管内皮细胞的功能。并且，c反应蛋白刺激单核细胞移动至血管壁中，并刺激分泌如白细胞介素-1(il-1)、白细胞介素-6(il-6)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的炎症细胞因子。c反应蛋白通过调理低密度脂蛋白的作用来介导巨噬细胞吞噬低密度脂蛋白，从而刺激组织因子(tissue factor)的产生，并可通过增加纤溶酶原激活物抑制物-1
disease in women.n engl j med 2000；342:836-43.
[0022]
非专利文献3；ridker pm,rifai n,rose l,buring je,cook nr.comparison of c-reactive protein and low-density lipoprotein cholesterol levels in the prediction of first cardiovascular events.n engl j med 2002；347:1557-65.
[0023]
非专利文献4：koenig w,lowel h,baumert j,meisinger c.c-reactive protein modulates risk prediction based on the framingham score:implications for future risk assessment:results from a large cohort study in southern germany.circulation 2004；109:1349-53.
[0024]
非专利文献5：pai jk,pischon t,ma j,et al.inflammatory markers and the risk of coronary heart disease in men and women.n engl j med 2004；351:2599-610.
[0025]
非专利文献6：boekholdt sm,hack ce,sandhu ms,et al.c-reactive protein levels and coronary artery disease incidence and mortality in apparently healthy men and women:the epic-norfolk prospective population study 1993-2003.atherosclerosis 2006；187:415-22.
[0026]
非专利文献7：ballantyne cm,hoogeveen rc,bang h,et al.lipoprotein-associated phospholipase a2,high-sensitivity c-reactive protein,and risk for incident coronary heart disease in middle-aged men and women in the atherosclerosis risk in communities(aric)study.circulation 2004；109:837-42.
[0027]
非专利文献8：paul m ridker,et al.rosuvastatin to prevent vascular events in men and women with elevated c-reactive protein.n engl j med 2008；359:2195-207.


技术实现要素：

[0028]
技术问题
[0029]
为了找到通过益生菌能够无副作用地同时有效治疗如心血管疾病、肥胖及糖尿病的慢性疾病的方法而不断研究的结果，本发明人完成了本发明。
[0030]
本发明人研究了多种益生菌，结果发现了如下事实，即，发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)的新型菌株lm1016通过降低血中的c反应蛋白、中性脂肪及胆固醇数值来有效预防及治疗心血管疾病。
[0031]
并且，本发明人还发现，lm1016不仅通过减少体脂肪和皮下脂肪来预防及治疗肥胖，而且减少皮下脂肪炎并降低血糖、胰岛素及瘦蛋白的数值，从而对于糖尿病也有效。
[0032]
解决问题的手段
[0033]
本发明涉及新型发酵乳杆菌lm1016(lactobacillus fermentum lm1016)菌株，以保藏编号kccm12468p保藏在韩国微生物保藏中心(korean culture center of microorganisms)。
[0034]
本发明的发酵乳杆菌lm1016于2017年12月13日以保藏编号kfc11756p韩国内保藏(domestic deposit)在韩国微生物保藏中心，对于相同的菌株，于2019年03月22日以kccm12468p国际保藏(internationl deposit)在韩国微生物保藏中心。
[0035]
本发明涉及包含上述发酵乳杆菌lm1016菌株的对心血管疾病有效的组合物。在一实施方式中，本发明提供在对象体(subject)中预防、改善或治疗心血管疾病的方法，包括向需要预防、改善或治疗心血管疾病的对象体给药有效量的发酵乳杆菌lm1016菌株。具体地，本发明的发酵乳杆菌lm1016菌株具有降低作为心血管疾病的独立风险因子的c反应蛋白、中性脂肪或胆固醇数值的效果。
[0036]
本发明涉及包含上述发酵乳杆菌lm1016菌株的对于心血管疾病、肥胖、糖尿或脂肪肝疾病有效的组合物。在一实施方式中，本发明提供在对象体中预防、改善或治疗心血管疾病、肥胖、糖尿病或脂肪肝疾病的方法，包括向需要预防、改善或治疗心血管疾病、肥胖、糖尿病或脂肪肝疾病的对象体给药有效量的发酵乳杆菌lm1016菌株。
[0037]
具体地，上述发酵乳杆菌lm1016菌株具有减少皮下脂肪炎的效果。并且，上述发酵乳杆菌lm1016菌株具有降低血糖、胰岛素或瘦蛋白的数值的效果。
[0038]
并且，上述发酵乳杆菌lm1016菌株减少肝脏的重量或肝中性脂肪的量，从而具有预防或治疗脂肪肝疾病的效果。
[0039]
本发明的组合物可用于医药品、保健功能食品、乳制品、发酵制品、食品添加剂或动物用饲料。
[0040]
发明的效果
[0041]
本发明的发酵乳杆菌lm1016菌株具有通过减少作为心血管疾病的风险因子的c反应蛋白、血中中性脂肪或胆固醇浓度来预防及治疗如高血压、高脂血症及动脉硬化等心血管疾病的效果。
[0042]
并且，上述新型lm1016菌株具有通过抑制作为心血管疾病的其他原因的肝组织脂肪的堆积来预防及治疗脂肪肝的效果。
[0043]
并且，上述新型lm1016菌株具有抑制体脂肪堆积、减少脂肪细胞的大小、抑制脂肪细胞炎症反应的效果，从而具有预防及治疗肥胖及因肥胖引起的疾病的效果。
[0044]
尤其，本发明的发酵乳杆菌lm1016菌株通过迅速减少血糖浓度并减少血胰岛素的浓度来改善胰岛素抗性，从而具有预防或治疗能够成为心血管疾病的原因的糖尿病的效果。
[0045]
由此，本发明的新型lm1016菌株具有能够无副作用地同时治疗及预防心血管疾病、脂肪肝、肥胖及糖尿病的优秀效果。
附图说明
[0046]
图1示出第1组至第3组的小鼠血清中的c反应蛋白、中性脂肪、总胆固醇数值。
[0047]
图2示出第1组至第3组的累积体重增加量的变化。
[0048]
图3示出第1组至第3组的小鼠的皮下脂肪、附睾脂肪、褐色脂肪量。
[0049]
图4示出小鼠的皮下脂肪、附睾脂肪、褐色脂肪的大小。
[0050]
图5在附睾脂肪与褐色脂肪中利用苏木精-伊红染色(h&e stain)对各个组进行染色来示出脂肪组织的数量及脂肪细胞大小。
[0051]
图6通过免疫化学染色法处理第2组与第3组的附睾脂肪来示出脂肪的形状和多个细胞之间的炎症反应。
[0052]
图7示出第1组至第3组的小鼠的血中葡萄糖数值。
[0053]
图8示出血清中的瘦蛋白与胰岛素数值。
[0054]
图9示出肝脏的重量及肝脏中性脂肪的量。
[0055]
图10示出通过苏木精-伊红染色对肝脏组织进行染色来观察是否患有脂肪肝的结果。
具体实施方式
[0056]
本发明人发现发酵乳杆菌的新型lm1016菌株。
[0057]
并且，上述新型lm1016菌株具有通过减少作为心血管疾病的风险因子的c反应蛋白、血中中性脂肪及胆固醇浓度来预防及治疗如高血压、高脂血症及动脉硬化等的心血管疾病的效果。
[0058]
并且，上述新型lm1016菌株具有通过抑制作为心血管疾病的另一原因的肝组织脂肪的堆积来预防及治疗脂肪肝的效果。
[0059]
并且，上述新型lm1016菌株具有抑制体脂肪堆积、减少脂肪细胞的大小、抑制脂肪细胞炎症反应的效果，从而具有预防及治疗肥胖及因肥胖引起的疾病的效果。
[0060]
尤其，本发明的发酵乳杆菌lm1016菌株通过迅速减少血糖浓度并减少血胰岛素的浓度来改善胰岛素抗性，从而具有预防或治疗能够成为心血管疾病的原因的糖尿病的效果。
[0061]
由此，本发明的新型lm1016菌株具有能够无副作用地同时治疗及预防心血管疾病、脂肪肝、肥胖及糖尿病的优秀效果，之前并不知晓如上所述的具有能够同时预防及治疗多种慢性疾病的效果的益生菌(发酵乳杆菌)。
[0062]
因此，本发明涉及发酵乳杆菌lm1016的新型菌株。
[0063]
并且，本发明涉及包含发酵乳杆菌lm1016的对于心血管疾病、脂肪肝、肥胖或糖尿病有效的组合物。
[0064]
本发明的组合物可用于医药品、保健功能食品、乳制品、发酵制品、食品添加剂或动物用饲料等。
[0065]
具体地，本发明的微生物能够以通过与根据给药路径选择的载体、赋形剂或稀释剂等的混合而成的如片剂或胶囊的单位形态给药。
[0066]
适合本发明的组合物的载体、赋形剂及稀释剂可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯丙酯、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油等。
[0067]
本说明书中的“组合物”不仅包括药品可接受的组合物，还包括普通的功能性食品或健康辅助食品。
[0068]
本说明书中所使用的“心血管疾患”或“心血管疾病”指影响心脏和/或血管的疾病。尤其，心血管疾病包括：心率失常；动脉硬化症；心绞痛；心力衰竭；心肌缺血；心肌梗塞；心脏或血管动脉瘤；血管炎；脑卒中；四肢、器官或组织的周围阻塞性动脉病症；脑、心脏、肾脏或其他器官或组织缺血引起的再灌流损伤；耐毒性；手术或外伤性休克；高血压；心脏瓣膜症；心脏衰竭；异常血压；休克；血管收缩；血管异常；仅限于单一器官或组织的功能障碍。
[0069]
在再一实施方式中，本发明提供在对象体中预防、改善或治疗心血管疾病、脂肪肝、肥胖或糖尿病的方法，包括向需要预防、改善或治疗心血管疾病、脂肪肝、肥胖或糖尿病
的对象体给药有效量的发酵乳杆菌lm1016菌株。
[0070]
本申请中所使用的术语“对象体”包括人及非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳类及非哺乳类，例如，非人灵长类、羊、狗、牛、马等。
[0071]
在另一实施方式中，本发明提供用于预防、改善或治疗心血管疾病、脂肪肝、肥胖或糖尿病的发酵乳杆菌lm1016菌株的用途。
[0072]
以下，通过实施例更加详细说明本发明。这些实施例仅用于更加具体说明本发明，本发明的范围并不局限于这些实施例。
[0073]
实施例1
[0074]
lm1016的心血管疾病因子抑制作用实验
[0075]
为了评价以保藏编号kccm12468p保藏在韩国生命工程研究院韩国微生物保藏中心(korean culture center of microorganisms)的发酵乳杆菌lm1016菌株对于心血管疾病因子的影响，将5周龄的c57bl6/j小鼠驯化1周后，将其分成3组来进行实验。
[0076]
第1组为给食12周的正常饮食(nd，3.1kcal/g)的组，第2组为前两周给食正常饮食且剩余10周给食高脂饮食(hfd，5.2kcal/g)的组，第3组为在给食与第2组相同的饮食的同时以每周5次的频率口服给药12周的lm1016(109cfu/mouse)。
[0077]
12周的给食结束后，从小鼠心脏采取血液并测定血液c反应蛋白浓度、中性脂肪及胆固醇浓度。在下述表1及图1示出其结果。
[0078]
表1
[0079] 第1组第2组第3组c反应蛋白(crp)(ng/ml)4.35.44.6中性脂肪(mg/dl)62.079.074.9总胆固醇(mg/dl)119.4176.0129.3
[0080]
如上述表1所示，可确认，相对于第2组中的血液c反应蛋白浓度为5.4ng/mg，给药lm1016的第3组显著减少至4.6ng/ml，呈现与给食正常饮食的第1组(4.33ng/ml)相似的数值。
[0081]
并且，可确认，第1组的血中中性脂肪的浓度为62.0mg/dl，第2组的血中中性脂肪的浓度为79.0mg/dl，第3组的血中中性脂肪的浓度为74.9mg/dl，虽然第2组与第3组的数值差异并不大，但第2组的总胆固醇浓度为176.0mg/dl，第3组的总胆固醇浓度为129.3mg/dl，相比于第2组，第3组的总胆固醇浓度减少了46.7mg/dl，呈现与第1组相似的数值。
[0082]
最终可知，发酵乳杆菌lm1016菌株具有通过减少c反应蛋白浓度及总胆固醇浓度来恢复至正常的优秀的效果。
[0083]
实施例2
[0084]
lm1016的体重增加率、体脂肪堆积及炎症反应抑制效果
[0085]
在进行实施例1的心血管疾病的动物实验的过程中，每周测定体重，并在第12周通过解剖来摘取各个主要器官并测定其重量。
[0086]
1.体重增加率的减少
[0087]
以第0周的体重为基准，测定随着时间变化的累积体重增加量，并在下述表2及图2示出其结果。
[0088]
如图2所示，在给食高脂饮食之前的2周，3个组的体重增加量均呈现缓慢的累积增
加量。随着向第2组及第3组给食高脂饮食，体重增加量逐渐开始出现差异，并且从第5周开始呈现明显的差异。
[0089]
表2
[0090] 第1组第2组第3组第11周的体重增加量(g)9.3523.7717.89第12周的体重增加量(g)9.5023.9218.84
[0091]
如上述表2所示，经确认，在第11周，第2组的体重增加量为23.77g，第3组的体重增加量为17.89g，相比于第2组，第3组的体重增加量减少了5.88g。
[0092]
经确认，在第12周，第2组的体重增加量为23.92g，第3组的体重增加量为18.84g，相比于第2组，第3组的体重增加量减少了5.08g，与第2组相比，第3组的体重增加率减少了17％以上。
[0093]
结果，对给食高脂饮食的第2组与在给食高脂饮食的同时给药lm1016的第3组进行比较的结果，可知，在一周后开始呈现体重增加率的差异，随着时间的推移，体重增加率的差异也显著增大。由此，可知lm1016具有减少体重的效果。
[0094]
2.皮下脂肪、附睾脂肪及褐色脂肪组织的减少
[0095]
测定12周的皮下脂肪、附睾脂肪及褐色脂肪组织的重量，在下述表3、图3及图4示出其结果。
[0096]
表3
[0097] 第1组第2组第3组皮下脂肪(g)0.641.991.44附睾脂肪(g)0.802.632.05褐色脂肪组织(g)0.060.120.08
[0098]
如上述表3所示，可确认，相比于给食高脂饮食的第2组，在给食高脂饮食的同时给药lm1016的第3组的皮下脂肪、附睾脂肪和褐色脂肪组织的增加量均减少。
[0099]
并且，利用苏木精-伊红染色对附睾脂肪进行染色，并在图5示出其结果。如图5所示，可确认，第2组的脂肪细胞的大小最大，相比于第2组，第3组的脂肪细胞的大小减少至一半以下。
[0100]
测定上述脂肪球的大小，并下述表4示出其结果。
[0101]
表4
[0102] 第1组第2组第3组皮下脂肪的脂肪球大小(μm2)158966211435652
[0103]
如上述表4所示，第1组为15896μm2，第2组为62114μm2，第三组为35652μm2。
[0104]
3.皮下脂肪炎症反应减少
[0105]
利用f4/80抗体并通过免疫化学染色法确认皮下脂肪炎症反应，其结果如图6所示，可确认，虽然给食高脂饮食的小鼠的皮下脂肪的细胞的形状变形，并在这些细胞之间确认到了疑似炎症的蓝点，但给药lm1016的组依旧维持着齐整的细胞形状，几乎没有发生炎症反应。
[0106]
实施例3
[0107]
lm1016的抗糖尿效果
[0108]
1.血糖减少
[0109]
为了测定小鼠的葡萄糖耐性，在向各个组给食11周后给药葡萄糖，之后，测定随时间变化的血糖，并在表5及图7示出其结果。
[0110]
表5
[0111][0112][0113]
如上述表5所示，经确认，给食高脂饮食的第2组从给食初期开始到120分钟为止的血糖数值最高。相反，在给食高脂饮食的同时给药lm10116的第3组在刚开始的30分钟内的血糖数值上升，但第3组的血糖数值低于第2组的血糖数值。
[0114]
并且，经确认，在给药30分钟后，第3组的血糖迅速降低，在120分钟后降低至几乎与第1组显示的水平。
[0115]
因此，可知，lm1016具有通过降低血糖来降低高脂饮食引起的葡萄糖耐性的效果。
[0116]
2.胰岛素及瘦蛋白的数值减少
[0117]
测定12周的各个组的胰岛素及瘦蛋白的数值，在下述表6及图8示出其结果。
[0118]
表6
[0119] 第1组第2组第3组胰岛素(ng/ml)0.362.091.19瘦蛋白(ng/ml)2.7325.7817.92
[0120]
如上述表6所示，经确认，第3组的胰岛素数值大幅减少至第2组的胰岛素数值的一半左右。
[0121]
在肥胖的情况下，随着胰岛素抗性的增加，胰岛素分泌也会增加，lm1016具有通过减少胰岛素浓度来降低高脂饮食引起的胰岛素抗性的效果。
[0122]
并且，第2组的瘦蛋白数值为25.78ng/ml，第3组的瘦蛋白数值为17.92ng/ml，与第2组的数值相比，第3组的瘦蛋白数值大大减少。
[0123]
瘦蛋白为脂肪细胞所分泌的食欲调节激素，当在脂肪组织中堆积中性脂肪而使脂肪细胞的大小增变大时，可促进瘦蛋白的合成并增加瘦蛋白的浓度。因此，可知，通过给药lm1016来减少中性脂肪及脂肪细胞，并且，相比于第2组，第3组的瘦蛋白的浓度显著减少。
[0124]
实施例4
[0125]
脂肪肝改善效果
[0126]
1.肝脏的重量及肝脏中性脂肪量
[0127]
在给食12周后，从各个组的小鼠摘取肝脏并测定肝脏的重量及肝脏组织中的中性脂肪量，在下述表7及图9示出其结果。
[0128]
表7
[0129] 第1组第2组第3组肝脏的重量(g)0.921.290.88中性脂肪量(nmol/全肝(whole liver))5.789.334.20
[0130]
如上述表7所示，经确认，与第2组相比，第3组的肝脏的重量显著减少，从而，与第1组相比，第3组的肝脏的重量也减少。
[0131]
并且，从测定肝脏组织中性脂肪量的结果中可知，第2组为9.33nmol/全肝，第3组为4.20nmol/全肝，第3组的中性脂肪量数值显著减少至第2组的数值的一半以下。并且，第2组的中性脂肪量数值低于第1组的数值。
[0132]
因此，随着体重过重，体内的脂肪代谢变得异常，从而导致脂质成分堆积在肝脏中，使得肝的重量及肝脏组织中性脂肪量增加，lm1016菌株具有参与肝的脂质代谢来抑制肝细胞的脂肪堆积的效果。
[0133]
2.脂肪肝减少
[0134]
通过苏木精-伊红染色对肝脏进行染色，从而观察是否存在(
×
20倍率及
×
40倍率)大脂肪泡(macro fat vacuole)，并在图10示出其结果。
[0135]
如图10所示，虽然第1组与第3组的肝脏组织紧密相连，但在第2组的肝脏组织中的多处观察到了疑似大脂肪泡的白色部分。由此，可知，lm1016菌株具有优秀的脂肪肝抑制效果。
[0136]
[0137]

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