从蝙蝠蛾冬虫夏草中分离出的提升腺苷含量的蝙蝠蛾拟青霉CS4菌株的制作方法

从蝙蝠蛾冬虫夏草中分离出的提升腺苷含量的蝙蝠蛾拟青霉cs4菌株
技术领域
[0001]
本发明涉及从蝙蝠蛾冬虫夏草中分离出的提升腺苷含量的蝙蝠蛾拟青霉(paecilomyces hepiali)cs4菌株，更详细地，涉及从中国西藏产的蝙蝠蛾冬虫夏草中分离且显著提升腺苷(adenosine)含量的蝙蝠蛾拟青霉(paecilomyces hepiali)cs4菌株。


背景技术：

[0002]
通常，子囊菌门的真菌中的一部分以昆虫为宿主，在昆虫体内生长，若满足规定条件，则穿透昆虫并形成子实体，将其统称为冬虫夏草(cordyceps)，根据作为宿主的昆虫种类和寄生的真菌种类发现多种冬虫夏草。
[0003]
根据菌株和作为宿主的昆虫的种类，众所周知的如上所述的冬虫夏草属菌包括以蚕蛹为寄主的蛹虫草(红冬虫夏草，cordyceps millitaris)、日本冬虫夏草(paecilomyces japonica)、金龟子虫草(cordyceps scarabaeicola)、垂头虫草(cordyceps mutans)、蝉茸(cordyceps sobolifera)、蝙蝠蛾冬虫夏草(cordyceps sinensis)等数百余种，尤其，自古以来以蝙蝠蛾幼虫为寄主的蝙蝠蛾冬虫夏草以其优秀的药效而众所周知。
[0004]
如上所述的蝙蝠蛾冬虫夏草在如中国的西藏、青海地区和尼泊尔等地的高山地带采摘，被视为中国三大传统药材之一的贵重药材。
[0005]
但是，在中国，由于担忧自然生态被破坏，极其限制采摘蝙蝠蛾冬虫夏草，最近，随着在从自然状态的冬虫夏草中发现如砒的重金属，对于自然采摘冬虫夏草的食品安全的担忧逐渐增加。
[0006]
在上述蝙蝠蛾冬虫夏草中，有性及无性孢子或菌丝感染蝙蝠蛾幼虫，在冬季菌丝在蝙蝠蛾幼虫的体内吸取营养成分并生长，使幼虫死亡，但是，在夏季蝙蝠蛾冬虫夏草菌生长，子实体从宿主的头部生长并穿透宿主，最终呈棒球棍形态。
[0007]
如图1所示，蝙蝠蛾冬虫夏草呈总长度约为10cm、直径为0.5cm左右的圆形，初期呈浅绿色，然后变为深褐色，子实体的头部略微鼓起，呈圆周形及椭圆形。
[0008]
作为如上所述的蝙蝠蛾真菌，已知冬虫夏草菌(ophiocordyceps sinensis)、蝙蝠蛾拟青霉、蜡蚧菌属(lecanicillium)等多种真菌。
[0009]
另一方面，根据种类，冬虫夏草包含多糖类、虫草素(cordycepi n)、腺苷、洛伐他汀(lovastatin)、麦角固醇(ergosterol)、各种不饱和脂肪酸等的多种低分子物质，据报告有助于人体的生理活性(lo et al.a systematic review of the mysterious caterpillar fungus ophiocordyceps sinensis in dong-chongxiacao(冬蟲夏草)and related bioactive ingredients.j tradit complement med,2013,3,16-32)，此外，冬虫夏草对肝炎、糖尿病、结核等有效，不仅具有改善血液循环、作为强壮剂的效果，还具有增强免疫功能等多种效果。
[0010]
但是，蛹虫草、日本冬虫夏草等的多种冬虫夏草已成功进入人工栽培阶段，但是，以功效最优秀而周知的蝙蝠蛾冬虫夏草还处于未成功人工栽培的状态，因此，只能依赖野
生。
[0011]
这是因为未研发种菌的分离技术和分离的种菌的培养技术等，因此，需研发两种技术才能通过人工培养大量生产冬虫夏草，并且，可稳定供给用于产品化的原料并使产品标准化。
[0012]
另一方面，在韩国授权专利第10-0415893号中公开了“蝙蝠蛾冬虫夏草菌的分离方法”，在韩国授权专利第10-0459869号中公开了涉及将蚕或蚕蛹用作寄主来大量培养冬虫夏草的方法的“使用蚕培养基或蚕蛹培养基的蝙蝠蛾冬虫夏草的培养方法”，但是，未记载本发明的从蝙蝠蛾冬虫夏草分离出的蝙蝠蛾拟青霉cs4菌株及其培养方法。
[0013]
并且，在中国食品药品监督管理局尤其将腺苷认定为表示冬虫夏草的功能指标，在如上所述的现有技术中，未记载具有得到提升腺苷含量的人工培养方法。
[0014]
由于上述的背景，本发明的目的在于，提供从中国西藏产的蝙蝠蛾冬虫夏草分离出蝙蝠蛾拟青霉cs4菌株并显著提升冬虫夏草功能指标成分腺苷含量的培养法。


技术实现要素：

[0015]
技术问题
[0016]
本发明为了解决如上所述的需求而提出，其目的在于，提供从中国西藏产的野生蝙蝠蛾冬虫夏草中分离出的提升腺苷含量的蝙蝠蛾拟青霉cs4菌株。
[0017]
技术方案
[0018]
为了解决如上所述的问题，本发明提供从中国西藏产的天然蝙蝠蛾冬虫夏草分离出的蝙蝠蛾拟青霉cs4菌株(保藏号：kctc13285bp)。
[0019]
在本发明中，上述菌株可具有得到提升的腺苷含量。
[0020]
在本发明中，上述菌株可在蝅蛹培养基培养。
[0021]
发明的效果
[0022]
根据本发明的实施例，可确保作为表示冬虫夏草的功能指标成分-腺苷含量与野生菌株相比显著提高(180mg/100g培养基)的蝙蝠蛾拟青霉cs4菌株。
[0023]
并且，能够以高浓度大量生产作为表示冬虫夏草的功效指标成分且对于免疫力增强、防止老化及改善心脏/肝脏有效的成分的腺苷。
[0024]
根据这种本发明实施例的效果并不局限于以上所例示的内容，本说明书包含更加多种的效果。
附图说明
[0025]
图1为采摘的蝙蝠蛾冬虫夏草照片(左)及在培养皿培养从蝙蝠蛾冬虫夏草分离的蝙蝠蛾拟青霉cs4菌株的照片(右)。
[0026]
图2为用于区分本发明的蝙蝠蛾冬虫夏草真菌的随机扩增多态性脱氧核糖核酸(rapd)结果的图像(1～4号、7号为分离菌，5号为蛹虫草菌，6号为蝉虫草(cordyceps cicadae)菌)。
[0027]
图3为比较根据本发明分离的蝙蝠蛾冬虫夏草分离菌株的腺苷含量的图表。
[0028]
图4为蝙蝠蛾冬虫夏草分离菌株的转录间隔区(its)碱基序列比较图像。
[0029]
图5为将多种材料用作培养基的本发明的蝙蝠蛾拟青霉cs4菌株的腺苷含量调查
结果图表。
[0030]
图6为示出利用来源于冬虫夏草孢子的单倍体的杂交育种的图表。
[0031]
图7为示出本发明的蝙蝠蛾拟青霉cs4菌株在各个培养条件下的腺苷含量分析结果的图表。
具体实施方式
[0032]
以下，参照附图更加详细地说明本发明的优选实施例。
[0033]
本发明一实施例的蝙蝠蛾冬虫夏草菌株为属于蝙蝠蛾拟青霉的菌株，于2017年06月13日以蝙蝠蛾拟青霉yc1-4的保藏名保藏于韩国生命工程研究院，保藏号为kctc 13285bp。
[0034]
上述蝙蝠蛾拟青霉yc1-4菌株当在蝅蛹培养基培养时可具有180mg/100g培养基的腺苷产量。
[0035]
但是，上述菌株的培养并不局限于培养基的种类，还可在糙米培养基、糙米+蚕粉培养基等培养。
[0036]
如上所述的腺苷以作为表示冬虫夏草的功能指标成分且示出对于增强免疫力、防止老化及改善心脏/肝脏相当具有功效而周知。
[0037]
根据再一实施例，本发明可提供冬虫夏草提取物。
[0038]
上述冬虫夏草提取物为上述蝙蝠蛾拟青霉yc1-4菌株的提取物，可包含腺苷作为有效成分，还可包含氨基酸、维生素前体和/或甘露醇等。
[0039]
如上所述的冬虫夏草提取物不仅指从上述蝙蝠蛾拟青霉yc1-4菌株提取有效成分，还指对上述蝙蝠蛾拟青霉yc1-4菌株本身或其一部分进行纯化或加工。
[0040]
为了获取如上所述的冬虫夏草提取物，可使用从天然物提取提取物的本领域的常规方法。具体地，可通过在常规温度及压力条件下使用常规提取溶剂的方法获取上述蝙蝠蛾拟青霉yc1-4菌株的提取物，可使用水、碳数为1～4的无水或含水低级醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷及1，3-丁二醇等在提取工序中通常使用的溶剂作为提取溶剂。
[0041]
根据另一实施例，本发明可提供包含冬虫夏草提取物的保健功能食品、保健辅助食品、保健食品、化妆品、医药品及医药外品等。
[0042]
包含如上所述的冬虫夏草提取物的保健功能食品、保健辅助食品、保健食品、化妆品、医药品及医药外品还可包含食品学、化妆品学或药剂学上可接受的成分。
[0043]
如上所述的食品学上可接受的成分可例举蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养成分及调味剂等。具体地，尤其，作为碳水化合物可例举单糖(葡萄糖、果糖等)、二糖(麦芽糖、蔗糖等)、寡糖、多糖(糊精、环糊精)及糖醇(木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等，作为香味剂可例举天然香味剂(索马甜、甜叶菊提取物等)及合成香味剂(糖精、阿斯巴甜等)。
[0044]
如上所述的化妆品学或药剂学上可接受的成分可例举载体、粘合剂、润滑油、崩解剂、可溶剂、稳定化剂、基剂、润滑剂、保存剂、湿润剂、乳化剂、悬浮剂、粘度调节剂、防腐剂、表面活性剂、抗氧化剂、保湿剂、香料及色素。
[0045]
并且，包含如上所述的冬虫夏草提取物的医药品及医药外品根据该发明所属技术领域的普通技术人员容易实施的方法利用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂来制剂化，从而能够以单位容量形态制备或放置在多容量溶解内来制备。
[0046]
此时，剂型可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者还可以为提取剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊形态，还可包含分散剂或稳定化剂。
[0047]
以下，具体说明上述蝙蝠蛾拟青霉yc1-4菌株的分离、培养方法及关于腺苷产量调查的实验例。
[0048]
实施例1：分离及培养本发明的菌株
[0049]-从野生蝙蝠蛾冬虫夏草分离真菌菌株-[0050]
利用70％的乙醇清洗图1所示的在中国青海地区采摘的野生蝙蝠蛾冬虫夏草，切开所清洗的冬虫夏草后，将内部组织切成0.1～0.3cm的大小，之后在马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基(包含氨苄西林(ampicillin)100mg/ml)中以18℃的培养温度培养1周以上。
[0051]
之后，将通过培养期间生长的多个真菌移到新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基并纯培养，结果，共分离了5种真菌。
[0052]
实施例2：区分蝙蝠蛾冬虫夏草分离的真菌及腺苷含量调查
[0053]-区分从蝙蝠蛾冬虫夏草分离的真菌-[0054]
利用随机扩增多态性脱氧核糖核酸方法进行了确认所分离的多个真菌是否为相同菌或互不相同的菌的实验，为此，首先，从各个菌的菌丝提取染色体脱氧核糖核酸，通过使用i-genomic植物脱氧核糖核酸提取试剂盒(i-genomic plant dna extraction kit)(intron biotech)分离了所提取的染色体脱氧核糖核酸。
[0055]
向1ml的以如上所述的方式分离的真菌脱氧核糖核酸添加0.1mm的ops1(ctactgcgct)引物(primer)、0.1mm的ops10(gtcgttcctg)引物、10ml的2x pcr premix(intron biotech)及8ml的蒸馏水，并进行聚合酶链式反应(pcr)。
[0056]
聚合酶链式反应以在94℃的温度条件下加热10分钟、在94℃的温度条件下加热45秒钟、在48℃的温度条件下加热30秒钟、在72℃的温度条件下加热1分钟的条件反复进行35次，通过1％的琼脂糖胶(agarose gel)电泳确认聚合酶链式反应产物的结果，如图2所示，确认了1～4号菌株和7号菌株为分离菌、5号菌株为蛹虫草菌、6号菌株为蝉虫草菌，经判断，相当于上述分离菌的菌株中的2号菌株和3号菌株为相同菌，4号菌株和7号菌株为相同菌。
[0057]
因此，共分离3种(1号菌株、2号菌株、4号菌株)真菌。
[0058]-分离的各个菌株的腺苷含量调查-[0059]
调查了以如上所述的方式分离的各个菌株的腺苷含量。
[0060]
为此，将所分离的各个菌株(1号菌株、2号菌株、4号菌株)在马铃薯葡萄糖肉汤(pdb)培养基维持20℃的温度并培养1周，并比较所生产的腺苷含量，结果如图3所示，在所分离的菌株中，4号菌株的腺苷含量最高，在随机扩增多态性脱氧核糖核酸中确认为相同种类的菌株的7号菌株示出4号菌株的约80％的产量，剩余三个菌株的腺苷产量显著降低。
[0061]
实施例3：冬虫夏草分离菌的鉴定
[0062]
通过上述实验对从蝙蝠蛾冬虫夏草分离的真菌菌株中的4号菌株确定转录间隔区(its，internal transcribed spacer)碱基序列。
[0063]
比较在上述4号菌株中确定的碱基序列与现有的冬虫夏草菌的结果，如图4所示，发现通过本发明分离的菌株与蝙蝠蛾拟青霉cs4菌株一致。
[0064]
由此，将如上所述的4号菌株命名为本发明的蝙蝠蛾拟青霉cs4yc1-4。
[0065]
实施例4：研究本发明的蝙蝠蛾拟青霉cs4 yc1-4的培养条件
[0066]
为了掌握作为本发明的蝙蝠蛾冬虫夏草分离菌株的拟青霉cs4yc1-4(以下，称为“yc1-4”)的最优培养条件，在8种培养基材料中调查在本发明获取的yc1-4菌株的腺苷含量。
[0067]
为此，准备大豆、蛹、黑豆1、黑豆2、芸豆、花生、腰果、大米等8种培养基材料，利用水分别清洗50g的各个培养基材料后，还添加30ml的水来杀菌，在杀菌的各个培养基材料接种3ml的在马铃薯葡萄糖肉汤培养基中培养1周的本发明的yc1-4菌株。
[0068]
在如上所述的各个培养基材料接种本发明的yc1-4菌株后，在23℃的温度、黑暗条件下培养20日，培养结束后，在各个培养条件下收集试样并分析腺苷含量。
[0069]
结果，如图5所示，在8种培养基材料中，从蛹中生产最多的腺苷。
[0070]
通过如上所述的实验，蛹为用于生产腺苷的最优秀的培养基材料，因此，如以下图像1所示，调查了蝅蛹培养基中的腺苷产量，还调查了糙米、糙米+蚕粉培养基。
[0071]
通过与如上所述的方法相同的方法制备了培养基，在接种本发明的yc1-4菌后，以(1)光照条件、(2)黑暗条件、(3)光照12小时～黑暗12小时交叉等的条件培养20日。
[0072]
完成如上所述的培养后，对各个试样中的腺苷韩玲进行高效液相色谱(hplc)分析，并在图6及图7分别示出分析结果。
[0073]
根据上述图6及图7，最终，在光照条件下培养的蝅蛹培养基中示出最高的腺苷产量，在此条件下，腺苷含量达到180mg/100g培养基。
[0074]
常规的如蝙蝠蛾拟青霉cs4或冬虫夏草菌的蝙蝠蛾冬虫夏草菌的腺苷含量大概仅为0.3～0.5mg/g培养基。
[0075]
但是，在本发明中，通过优化培养基条件来新分离的蝙蝠蛾拟青霉cs4 yc1-4菌株的腺苷含量达到180mg/100g培养基，由此可确认，相比于现有的蝙蝠蛾冬虫夏草菌株，腺苷含量显著得到提高。
[0076][0077]
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
[0078]
国际格式
[0079]
对于原保藏的保藏证书
[0080]
根据7.1发行
[0081]
保藏人：李原在
[0082]
地址：韩国首尔特别市钟路区孝子路9街18-2
[0083][0084]

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