修饰的免疫细胞及其用途的制作方法

[0001]
本发明属于生物医药技术领域，具体而言属于免疫细胞治疗领域。


背景技术：

[0002]
t细胞是人体最重要的特异性免疫细胞之一，近年来在备受瞩目的细胞治疗领域中扮演着重要的作用，例如可以通过修饰并回输患者的自体t细胞进行细胞治疗。然而，鉴于肿瘤的异质性，患者mhc的个体性，以及t细胞受体(tcr)产生过程(vdj重排)的随机性，患者体内特异识别有害细胞的t细胞群各不相同，换言之是一个包含高度个体化的tcr队列的t细胞群体。如何从患者自体快速获得具有特异识别有害细胞(如癌细胞或病毒宿主细胞)的能力的t细胞群，并且在此基础上加以修饰，进而更高效、安全地应用于细胞治疗，是一个技术难题。


技术实现要素：

[0003]
本发明的发明人提出，pd-1阳性t细胞(pd-1
+
t细胞)是一组处于被抑制状态的细胞，这类细胞很可能是能够识别靶细胞并且经历过与靶细胞的pd-l1的相互作用的t细胞。在个体没有自身免疫病史的情况下，可将pd-1
+
t细胞视为攻击过有害细胞的t细胞的集合。正因为该集合中的t细胞已经与有害细胞有过接触，因此可以认为这些t细胞拥有靶向有害细胞的能力。经过加工的外周血中的pd-1
+
t细胞有望用于治疗各类疾病，尤其是肿瘤和感染性疾病。pd-1
+
t细胞的优点是有较好的对有害细胞的识别特性，但缺憾是pd-1的高表达使得这些细胞处于耗竭状态，功能被抑制，难以起到杀伤效果。为了使pd-1
+
t细胞兼具识别特性和免疫活性，本发明提出了克服pd-1
+
t细胞抑制状态的几种修饰方法，由此完成了本发明。
[0004]
因此，在第一方面，本申请涉及一种修饰的免疫细胞，所述免疫细胞是来源于外周血中的pd-1阳性t(pd-1
+
t)细胞。优选地，所述pd-1
+
t细胞来源于外周血单个核细胞(pbmc)。例如，所述pd-1
+
t细胞是通过分选pbmc获得的细胞，例如通过pd-1和cd3作为标志物进行分选。
[0005]
在优选的实施方案中，所述修饰是能够减弱或消除pd-1
+
t细胞的抑制状态的修饰。例如，所述修饰可以通过对所述免疫细胞进行基因改造和/或蛋白质修饰进行。
[0006]
在一个具体的实施方案中，所述修饰是对pd1
+
t细胞的遗传修饰，其使得所述pd1
+
t细胞的pd-1表达缺失或降低。所述遗传修饰可以在体内或体外进行。在一个实施方案中，所述遗传修饰在体内通过基因编辑或基因治疗进行。在另一个实施方案中，所述遗传修饰在体外进行，例如在所述pd-1
+
t细胞的制备过程中进行。所述遗传修饰可以是对所述pd-1
+
t细胞的内源pd-1的敲除或敲低。敲除内源pd-1基因的手段包括但不限于crispr/cas方法，talen等。
[0007]
在一个具体的实施方案中，所述修饰是对pd-1
+
t细胞表面的pd-1的修饰，其使得pd-1
+
t细胞表面的pd-1与其配体的结合能力相对于未修饰之前有所下降。在具体的实施方
案中，通过将pd-1抗体与所述pd-1
+
t细胞混合，使得pd-1抗体竞争性结合pd-1
+
t细胞表面的pd-1，从而降低pd-1与其配体的结合能力，由此完成修饰。在一个实施方案中，所述修饰在体内通过与pd-1抗体联合给药进行。在另一个实施方案中，所述修饰在体外进行，如通过在pd-1
+
t细胞制备的过程中加入pd-1抗体进行。所述pd-1抗体优选是pd-1单克隆抗体或单链抗体。
[0008]
在进一步的实施方案中，所述经修饰的pd-1
+
t细胞具有增强受体(er)，所述增强受体包含：细胞外结构域(ecd)和细胞内结构域(icd)，所述icd包含引发免疫细胞激活信号的共刺激分子，所述ecd包含特异性结合所述免疫细胞的靶细胞的部分。在具体的实施方案中，所述特异性结合免疫细胞的靶细胞的部分选自所述靶细胞的膜蛋白的受体、配体和抗体，或其具有与靶细胞结合功能的部分或片段。优选地，所述ecd包含pd1的部分序列或抗pd-l1抗体优选抗pd-l1 scfv，和/或所述icd源自cd28。
[0009]
优选地，所述修饰的免疫细胞对受试者中的靶细胞具有靶向性。在一些实施方案中，所述靶细胞是肿瘤细胞，特别是癌细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是受病毒感染的宿主细胞，所述病毒如肝炎病毒，优选乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒，或人乳头瘤病毒(hpv)。在一些实施方案中，所述修饰的免疫细胞的靶细胞选自下组中的一种或多种：肿瘤细胞、癌细胞、受病毒感染的细胞。
[0010]
在进一步的实施方案中，所述经修饰的pd-1
+
t细胞表达嵌合抗原受体(car)，所述car特异性识别与所述免疫细胞的天然tcr所识别的不同的另一种抗原。优选地，所述另一种抗原是cd19。
[0011]
在进一步的实施方案中，所述经修饰的pd-1
+
t细胞包含其他修饰，例如自杀开关。
[0012]
第二方面，本申请提供包含第一方面的修饰的免疫细胞的细胞群体。
[0013]
第三方面，本申请提供一种制备修饰的免疫细胞的方法，所述方法包括：(a)从外周血分选pd-1
+
的t细胞；和(b)对所述步骤(a)分选的pd-1
+
t细胞进行如下一种或多种处理：i.敲除或敲低pd-1的表达；ii.与pd-1抗体混合；iii.使其表达增强受体(er)；iv.使其表达嵌合抗原受体(car)；v.使其表达控制细胞死亡的修饰，如自杀开关。在优选的实施方案中，所述步骤(b)的处理至少包括使其表达增强受体(er)。进一步地，所述步骤(b)的处理包括使其表达嵌合抗原受体(car)。在另一种实施方案中，或在此基础上的实施方案中，所述步骤(b)的处理包括敲除或敲低pd-1的表达和/或与pd-1抗体混合。额外地，所述步骤(b)的处理包括使其表达自杀开关。所述处理可以在体内或体外进行。所述处理可以在将所述修饰的免疫细胞回输至受试者之前、之后或同时进行。在具体的实施方案中，所述方法的步骤(a)的分选包括从外周血单个核细胞以任意顺序进行pd-1
+
细胞分选和cd3
+
细胞分选。在优选的方案中，所述处理至少包括i.敲除或敲低pd-1的表达。
[0014]
第四方面，本申请涉及通过第三方面的方法制备的修饰的免疫细胞。
[0015]
第五方面，本申请涉及一种药物组合物，其包含第一方面或第四方面的修饰的免疫细胞，或第二方面的细胞群体。
[0016]
第六方面，本申请涉及第一方面或第四方面的免疫细胞或第二方面的细胞群体在治疗中的用途，或在制备用于药物中的用途。所述治疗或药物用于(1)治疗肿瘤，和/或(2)治疗或预防与病毒感染相关的疾病或症状，或防止与病毒感染相关的疾病或症状的复发。优选地，所述病毒感染为慢性病毒感染。在具体的实施方案中，所述病毒为肝炎病毒，优选
乙型肝炎病毒。在另一个具体的实施方案中，所述病毒为人乳头瘤病毒。本发明的免疫细胞可以用于在受试者中清除治疗后的残余病毒成分，预防病毒感染的复发。
附图说明
[0017]
图1是展现实施例1中的pdx小鼠荷瘤情况的照片。
[0018]
图2是展现实施例1中为了分离肿瘤组织解剖后的荷瘤小鼠的照片。
[0019]
图3a-b展示了使用来自患者外周血的pd-1
+
t细胞或pd-1-t细胞与患者的肿瘤组织共培养，进行elispot实验以检测ifnγ分泌的结果，其显示了两种t细胞对肿瘤的识别性和响应性的差异；(a)共培养24小时的elispot染色照片和elispot统计结果；(b)共培养48小时的elispot染色照片和elispot统计结果。
[0020]
图4a-e显示了检测pd-1敲除对pd-1
+
t细胞功能影响的体外实验结果。(a)流式检测pd-1的分选效率；(b)流式检测tcr的表达情况，以未用表达tcr的病毒转染的细胞作为对照(pd-1
+
notd)；(c)在表达和不表达tcr的pd-1
+
t细胞中流式检测pd-1的敲除效果，两种细胞均以未经处理和进行空电击的细胞作为对照；(d-e)elisa实验检测t细胞与j82-ny肿瘤细胞共培养后，t细胞的ifnγ(d)和il-2(e)的分泌。
[0021]
图5a-d显示了检测增强受体对pd-1
+
t细胞功能影响的体外实验结果。(a)流式检测pd-1的分选效率；(b-c)elisa实验检测表达和不表达增强受体的t细胞与j82-ny肿瘤细胞共培养后，t细胞的ifnγ(b)和il-2(c)的分泌；(d)elisa实验检测表达和不表达增强受体的t细胞在包被了okt3和/或pd-l1蛋白的96孔板中的ifnγ分泌。
[0022]
图6a-f显示实施例4中在接种了j82-ny-eso1肿瘤细胞的小鼠中进行的体内实验的结果，证明了增强受体对pd-1
+
t细胞的抑瘤功能的影响。(a)pbs对照；(b)pd-1
+
notd；(c)pd-1-tcr-t细胞；(d)pd-1
+
tcr-t细胞；(e)pd-1
+-v1e-tcr-t细胞；(f)各组平均值的整合图。
[0023]
图7a-c显示实施例4中在接种了来自结肠癌患者的肿瘤组织的小鼠中进行的体内实验的结果，证明了增强受体对pd-1
+
t细胞的抑瘤功能的影响。(a)pbs对照；(b)pd-1-t细胞；(c)pd-1
+
t细胞；(d)pd-1
+-v2e-t细胞。
[0024]
图8显示实施例6中的患者(a-b)和对照受试者(c)的肝功和hbv相关指标。
[0025]
图9显示hbv在宿主肝细胞内的生物学过程。
[0026]
图10显示细胞毒性t淋巴细胞(ctl)攻击与靶细胞免疫逃逸。
[0027]
图11显示sctil清除hbv在肝细胞中残余成分(不包括活性病毒)。
[0028]
图12是用于引入识别ny-eso-1的tcr的慢病毒载体构建体plenti-tcr-ny eso1的质粒图。
[0029]
图13是用于引入增强受体v1e的慢病毒载体构建体plenti-v1e-t2a-tcr的质粒图。
[0030]
图14是用于引入增强受体v2e的慢病毒载体构建体plenti-v2e-t2a-tcr的质粒图。
[0031]
图15是作为扩增因子使用的cd19 car的结构示意图。
[0032]
图16是实施例5中患者1-4在治疗前后的影像学检查结果。
[0033]
发明详述
[0034]
定义
[0035]
除非另有说明，否则本文公开的一些方法的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组dna的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。
[0036]
术语“约”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1或大于1的标准偏差内。或者，“约”可表示给定值的最多20％，最多10％，最多5％或最多1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，该术语可以表示数值的一个数量级，优选地在5倍内，更优选地在2倍内。在申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假定术语“约”意味着在特定值的可接受误差范围内。
[0037]
术语“基因”在本文指核酸(例如dna，例如基因组dna和cdna)及其相应的编码rna转录物的核苷酸序列。基因组dna在本文包括插入的非编码区以及调节区，并且可包括5'和3'末端。在一些用途中，该术语包括转录序列，包括5'和3'非翻译区(5'-utr和3'-utr)、外显子和内含子。在一些基因中，转录区将包含编码多肽的“开放阅读框”。在该术语的一些用途中，“基因”仅包含编码多肽所必需的编码序列如“开放阅读框”或“编码区”。在一些情况下，基因不编码多肽，例如核糖体rna基因(rrna)和转移rna(trna)基因。在一些情况下，术语“基因”不仅包括转录序列，而且还包括非转录区域，包括上游和下游调节区、增强子和启动子。基因可以指生物基因组中其天然位置中的“内源基因”或天然基因。基因可以指“外源基因”或非天然基因。非天然基因可以指通常不在宿主生物体中发现但通过基因转移引入宿主生物体的基因。非天然基因也可以指不在生物体基因组中的天然位置的基因。非天然基因还可以指天然存在的核酸或多肽序列，其包含突变、插入和/或缺失(例如，非天然序列)。
[0038]
术语“核苷酸”通常是指碱-糖-磷酸盐组合。核苷酸可包含核苷酸的类似物或衍生物以及合成核苷酸。核苷酸可以通过已知的技术进行标记以便检测。可检测标记可包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。
[0039]
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，指任何长度的聚合形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物，其可以是单股、双股或多股形式。多核苷酸对细胞可以是外源的或内源的。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是dna或rna。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。多核苷酸可包含一种或多种类似物(例如改变的主链，糖或核碱基)。
[0040]
术语“表达”是指多核苷酸从dna模板转录(例如转录成mrna或其他rna转录物)和/或转录的mrna随后翻译成肽、多肽或蛋白质的一个或多个过程。转录物和编码的多肽可统称为“基因产物”。如果多核苷酸衍生自基因组dna，则表达可包括在真核细胞中剪接mrna。表达的“上调”或“下调”通常是指相对于其在野生型状态下的表达水平，多核苷酸(例如rna，例如mrna)和/或多肽序列的表达水平增加或降低。
[0041]
涉及表达或活性的术语“调节”是指改变表达或活性水平。调节可以在转录水平和/或翻译水平发生。
[0042]
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指通过肽键连接的至少两个氨基酸残基的聚合物。术语“肽”，“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指通过肽键连接的至少两个氨基酸残基的聚合物。该术语不意味着特定长度的聚合物，也不意味着该
聚合物是天然的、经修饰的或合成的。在某些情况下，聚合物可被非氨基酸中断。该术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，和具有或不具有二级和/或三级结构的蛋白质(例如，结构域)。该术语还包括已经被修饰的氨基酸聚合物，例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、氧化和任何其他操作，例如与标记组分的缀合。本文所用的术语“氨基酸”通常是指天然和非天然氨基酸，包括但不限于修饰的氨基酸和氨基酸类似物。术语“氨基酸”包括d-氨基酸和l-氨基酸。
[0043]
术语“融合物”可以指包含一个或多个非天然序列(例如，部分)的蛋白质和/或核酸。融合物可包含一种或多种相同或不同的非天然序列。融合物可以是嵌合物。融合物可包含核酸亲和标签、条形码(barcode)或肽亲和标签。融合物可以提供使多肽定位于亚细胞部位的信号，例如，用于靶向细胞核的核定位信号(nls)，用于靶向线粒体的线粒体定位信号，用于靶向叶绿体的叶绿体定位信号，内质网(er)保留信号等。融合物可以提供可以用于跟踪或纯化的非天然序列(例如，亲和标签)。融合物可以包含小分子，例如生物素或染料，例如alexa氟染料，cyanine3染料，cyanine5染料。
[0044]
如本文所用的术语“抗原”是指能够被选择性结合剂结合的分子或其片段。例如，抗原可以是可以被选择性结合剂如受体结合的配体。作为另一个例子，抗原可以是抗原分子，其可以被选择性结合剂如免疫蛋白(例如抗体)结合。抗原还可以指能够在动物中使用以产生能够结合该抗原的抗体的分子或其片段。
[0045]
如本文所用的术语“抗体”是指具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子。术语抗体包括抗体(例如，单克隆和多克隆抗体)及其衍生物、变体和片段。抗体包括但不限于不同类别(即iga、igg、igm、igd和ige)和亚类(例如igg1、igg2等)的免疫球蛋白(ig)。其衍生物、变体或片段可以指保留相应抗体的结合特异性(例如完整和/或部分)的功能性衍生物、变体或片段。抗原结合片段包括fab、fab'、f(ab')2、可变片段(fv)、单链可变片段(scfv)、微抗体、双抗体和单结构域抗体(“sdab”或“纳米抗体”或“骆驼抗体”)。术语抗体包括已经优化、工程化或化学缀合的抗体和抗体的抗原结合片段。已经优化的抗体的实例包括亲和力成熟的抗体。已经改造的抗体的实例包括fc优化的抗体(例如，在片段可结晶区域中优化的抗体)和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
[0046]
术语“tcr”或“t细胞受体”具有本领域通常理解的含义。tcr是t细胞介导的抗原识别的基础，是免疫系统中的关键一环。tcr具有高度多样性，这种多样性与疾病之间的关系是免疫学领域的研究热点。t细胞在某个条件下或某个时间点包含的tcr的集合可被称为tcr组库(tcr repertoire)或tcr谱(tcr profile)，其随着疾病的发生和发展可能发生很大的变化。
[0047]
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，指脊椎动物，优选哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿猴、人类、农场动物、运动动物和宠物。还包括体内获得的或体外培养的生物实体的组织，细胞及其后代。
[0048]
术语“治疗”在本文指用于获得有益或所需结果(包括但不限于治疗益处和/或预防益处)的方法。例如，治疗可包括施用本发明的修饰的免疫细胞或包含该免疫细胞的细胞群。治疗益处是指被治疗的一种或多种疾病或症状存在任何与治疗相关的改善。对于预防益处，本发明修饰的免疫细胞可以施用于有风险形成特定疾病或症状的受试者，或施用于存在疾病的一种或多种生理征兆的受试者，即使疾病或症状可能还没有表现出来。
[0049]
术语“有效量”或“治疗有效量”是指组合物的量，例如包含本发明的修饰的免疫细胞如淋巴细胞(例如，t淋巴细胞和/或nk细胞)的组合物的量，在以该量给予有需要的受试者时足以产生所需的活性。
[0050]
免疫细胞
[0051]
本发明的免疫细胞来自于外周血，如外周血单个核细胞(pbmc)，外周血淋巴细胞(pbl)和其他血细胞亚群，包括但不限于t细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、单核细胞前体细胞、造血干细胞或非多能干细胞。在一些情况下，本发明的免疫细胞可以是任何免疫细胞，包括任何t细胞，例如肿瘤浸润细胞(til)。免疫细胞可以来自待治疗的受试者(例如，患者)。所述受试者可以是哺乳动物，如小鼠、猴或人。在具体的实施方案中，所述免疫细胞分离自受试者，如人类受试者的外周血单核细胞(pbmc)。
[0052]
可以使用任何技术，例如ficoll分离，从受试者收集的血液中获得t细胞。来自受试者的循环血液的细胞可以通过单采血液成分术或白细胞去除术获得。单采血液成分产品通常含有淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞以及其他有核白细胞，还包括红细胞和血小板。可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆部分，并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中，例如磷酸盐缓冲盐水(pbs)，用于随后的处理步骤。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如不含ca、mg的pbs。或者，可以除去单采血液成分样品中不需要的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。样品可以由受试者直接提供，或间接通过一个或多个居间者提供，例如样品采集服务提供者或医学提供者(例如医生或护士)。在一些实施方案中，从外周血白细胞中分离t细胞可包括裂解红细胞并通过例如percol
tm
梯度离心将外周血白细胞与单核细胞分离。
[0053]
可以通过正向或负向的选择技术进一步分离免疫细胞如t细胞的特定亚群，如本发明的免疫细胞是pd-1阳性的t细胞亚群。不受限于任何理论，认为pd-1阳性细胞很可能代表了经历过与靶细胞的相互作用的细胞群体，因此该细胞群体具有对靶细胞的识别性。在具体的实施方案中，以pd-1为标志物对获得自外周血的免疫细胞如pbmc进行分选。例如，可以使用pd-1抗体通过磁力分选(如使用磁珠)或流式细胞术来分选pd-1
+
t细胞，优选使用磁珠进行分选。
[0054]
本发明认为分选出的pd-1阳性的t细胞亚群是与希望靶向的有害细胞已经进行过相互作用的t细胞亚群，因此其中包含的t细胞具有能够特异性识别有害细胞上的抗原的tcr组库或tcr谱。为了使细胞治疗中使用的t淋巴细胞能够靶向识别有害细胞如肿瘤细胞，现有技术中的一种做法是通过筛选tcr库获得能够靶向该有害细胞如肿瘤细胞的tcr并获得其遗传信息，据此对来自患者的t细胞进行遗传改造，赋予其识别有害细胞上抗原的能力。与这种通过外源修饰赋予t细胞识别性的技术不同，本发明可以不进行tcr筛选，也不向用于治疗的t细胞中额外引入外源tcr，而是通过直接从患者自体细胞分选那些大概率本身具有特异性针对有害细胞的tcr的t细胞，来保证用于治疗的细胞的靶向性和安全性。因此，本领域技术人员能够理解，本发明不要求t细胞具有一种或多种特定的tcr，因为tcr组库会因患者及其疾病状态而具有巨大差异。本发明要求t细胞群体与有害细胞之间存在识别性即可，而这种识别性在本发明中主要通过分选pd-1阳性的t细胞来获得。也正因如此，本发明的方法学可以用于针对多种有害细胞并治疗多种疾病。
[0055]
在本发明的上下文中，“有害细胞”指被免疫细胞靶向并攻击的细胞，特别是肿瘤
细胞、癌症细胞、受病毒感染的细胞。
[0056]
本发明的t细胞还可以是cd3阳性、cd4阳性、cd4阴性或cd8阳性的t细胞亚群。可以使用任何本领域的技术来分选具有或不具有特定标志物的细胞亚群。例如，可以通过偶联有针对相关标志物的抗体的基质如磁珠进行分选，如通过cd3磁珠或cd3/cd28磁珠来分选cd3
+
t细胞。可以通过改变细胞浓度来促成和基质表面例如磁珠表面的最大接触。另外，也可以用针对不想要的细胞特有的表面标志物的抗体组合实现对细胞群体的负选择。一种合适的技术包括通过负磁性免疫粘附进行细胞分选，其利用针对不想要的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了分离cd4
+
细胞，单克隆抗体混合物可包括针对cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。
[0057]
在一些实施方案中，免疫细胞是经富集的细胞群中的细胞。可通过任何合适的方法富集一种或多种所需的细胞类型，例如，对细胞群进行处理以触发扩增和/或分化成所需细胞类型，或阻止不需要的细胞类型的生长，或杀死或裂解不需要的细胞类型，或纯化所需细胞类型(例如在亲和柱上纯化以基于一种或多种细胞表面标志物保留所需或不需要的细胞类型)。
[0058]
修饰
[0059]
pd-1
+
t细胞由于经历过与靶细胞的相互作用而被消耗、“钝化”，效力和功能有所削弱。本发明通过对pd-1
+
t细胞进行修饰来恢复、提升其功效。
[0060]
本发明的修饰的免疫细胞的pd-1表达被敲除或敲低。基因表达的“敲除(knock-out)”在本文指基本上消除该基因的表达。基因表达的“敲低(knock-down)”在本文指该基因的表达的降低。在优选的实施方案中，本发明的修饰的免疫细胞的内源pd-1表达被敲除。可以使用本领域已知的任何方法来实现对pd-1的敲除或敲低，所述方法包括但不限于：rnai(包括使用sirna或shrna)、crispr-cas方法、转录激活样效应因子核酸酶(talen)技术、定点诱变、锌指核酸酶(zfn)技术或其组合。
[0061]
在优选的实施方案中，使用crispr/cas方法来敲除免疫细胞的内源pd-1，所述方法包括使用能够与目标基因pd-1杂交的引导rna(grna)以及cas蛋白或其编码核酸分子。在具体的实施方案中，使用靶向pd-1的sgrna来敲除免疫细胞的内源pd-1，优选地所述sgrna具有如seq id no:4所述的核苷酸序列。在具体的实施方案中，使用cas9蛋白或其编码核酸分子来敲除pd-1。所述cas9蛋白可以源自酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)或其他物种。例如，cas9可以包括spcas9、cpfl、casy、casx或sacas9。
[0062]
在一个方面，本发明的修饰的免疫细胞包含增强受体(er)。增强受体可用于提供对免疫细胞活性的进一步控制，例如但不限于免疫细胞活化和扩增。增强受体与配体的结合可以在修饰的免疫细胞中产生免疫细胞活化信号而不是免疫细胞失活信号。在修饰的免疫细胞中引发免疫细胞活化信号而不是免疫细胞失活信号可以使免疫细胞中的免疫抑制作用最小化。最小化免疫细胞中的免疫抑制作用可以增加免疫细胞在免疫应答中的有效性，例如通过增加针对靶细胞(例如肿瘤细胞或受感染细胞)的免疫细胞细胞毒性。
[0063]
增强受体可以包含蛋白质的胞外结构域(ecd)。所述蛋白质可以是信号传导受体或其任何功能片段、衍生物或变体。在一些情况下，所述信号传导受体可以是膜结合受体。响应于配体结合，信号传导受体可以诱导细胞中的一种或多种信号传导途径。在一些情况
下，信号传导受体可以是非膜结合受体。增强受体可包含选自如下受体的片段(如细胞外结构域)：g蛋白偶联受体(gpcr)的受体、整合素受体、钙粘蛋白受体、催化受体(例如激酶)、死亡受体、检查点受体、细胞因子受体、趋化因子受体、生长因子受体、激素受体和免疫受体的片段，例如细胞外结构域。
[0064]
在一些实施方案中，增强受体包含免疫检查点受体的片段，其可以参与免疫系统的调节。此类受体的非限制性实例包括但不限于pd-1、ctla-4、btla)、kir、ido、lag3、tim-3、tigit、sirpα、nkg2d，优选pd-1。
[0065]
增强受体可以包含结合任何合适的免疫检查点受体配体的片段。此类配体的非限制性实例包括但不限于b7-1、b7-h3、b7-h4、hvem(疱疹病毒进入介质)、ap2m1、cd80、cd86、shp-2、ppp2r5a、mhc(例如，i类、ii类)、cd47、cd70、pd-l1(或pdl1)和pd-l2。增强受体与此类配体结合的区域，可以是此类配体的天然受体，也可以是此类配体的单克隆抗体。
[0066]
增强受体还包含胞内结构域(icd)，其可以是引发免疫细胞激活信号的共刺激分子或其片段、变体、衍生物。在一些实施方案中，共刺激分子可用于调节免疫细胞中的增殖和/或存活信号。在一些实施方案中，icd是共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自mhc i类蛋白、mhc ii类蛋白、tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、slam蛋白、活化nk细胞受体、btla或toll配体受体。在优选的实施方案中，所述共刺激分子是t细胞共刺激分子，优选t细胞正共刺激分子，优选cd28。
[0067]
增强受体的ecd和icd可以通过跨膜结构域连接。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含多肽。跨膜多肽可具有任何合适的多肽序列。在一些情况下，跨膜多肽包含内源或野生型跨膜蛋白的跨膜部分的多肽序列或其具有至少一个氨基酸变化的变体。在一些实施方案中，跨膜多肽包含非天然多肽序列，例如多肽接头的序列。多肽接头可以是柔性的或刚性的。多肽接头可以是结构化的或非结构化的。在一些实施方案中，跨膜多肽将来自ecd的信号传递至icd，例如指示配体结合的信号。在一些实施方案中，ecd包含跨膜结构域。在一些实施方案中，icd包含跨膜结构域。
[0068]
转染增强受体基因的手段可以向pd-1
+
t细胞电转增强受体的mrna，或通过慢病毒、腺相关病毒、或非病毒载体，将增强受体基因转染到pd-1
+
t细胞中。
[0069]
所述增强受体是是一种表达于免疫细胞表面的跨膜蛋白，由细胞外结构域(ecd)与细胞内结构域(icd)组成，其中icd包含引发免疫细胞激活信号的共刺激分子，可引发免疫细胞活化信号，ecd可以结合所述免疫细胞的靶细胞，是所述pd-1
+
t细胞的靶细胞的膜蛋白的受体、配体、抗体，或可与靶细胞结合的任意一种物质的完整序列结构或包含其结合域的部分。
[0070]
在具体的实施方案中，所述增强受体为v1e或v2e，ecd分别包含pd-1的片段(例如pd-1胞外结构域的片段)或抗pd-l1单克隆抗体的scfv序列，且所述增强受体的icd包含cd28的胞内信号传导结构域。更优选地，所述增强受体包含cd28的跨膜区或cd8的跨膜区。在最优选的实施方案中，所述增强受体包含选自seq id no:1或seq id no:2的序列，或与序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同源性的序列，或由这样的序列组成。
[0071]
在一些实施方案中，本发明的修饰的免疫细胞包含嵌合抗原受体(car)。当car能识别靶细胞时，经增强受体修饰的免疫细胞如t细胞比未经增强受体修饰的细胞有更强的
免疫细胞活化功能。在一些情况下，car可以帮助修饰的免疫细胞进行扩增。
[0072]
在优选的实施方案中，所述car特异性识别与所述免疫细胞的天然tcr不同的另一种抗原。优选地，所述car包含能够结合b细胞表面蛋白的抗原相互作用结构域(抗原结合结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。b细胞表面蛋白可以是可以在b细胞表面上发现的任何蛋白质，优选cd19。在一些实施方案中，car的抗原相互作用结构域能够结合非b细胞上的表面蛋白，只要与表面蛋白的结合不显著损害宿主的一般健康状态或免疫系统。
[0073]
抗原结合结构域的非限制性实例包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、鼠抗体或其功能衍生物、变体或片段，包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、fv、单链fv(scfv)、微抗体、双抗体和单结构域抗体如骆驼科动物衍生的纳米抗体的重链可变结构域(vh)、轻链可变结构域(vl)和可变结构域(vhh)。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含fab、fab'、f(ab')2、fv和scfv中的至少一种，优选scfv。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含抗体模拟物。抗体模拟物是指能够以与抗体相当的亲和力结合靶分子的分子。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含跨膜受体或其任何衍生物，变体或片段。例如，抗原结合结构域可以包含至少跨膜受体的配体结合结构域。
[0074]
在一些实施方案中，car的抗原相互作用结构域能够结合与颗粒(例如，纳米颗粒)偶联(例如，通过共价和/或非共价键)的b细胞的表面蛋白或其片段。颗粒可以是包含有机和/或无机材料的任何颗粒材料。颗粒可具有各种形状和尺寸。颗粒在至少一个维度上可以是约1纳米(nm)至约50微米(μm)。颗粒在至少一个维度上可以是至少约1nm、5nm、10nm、50nm、100nm、500nm、1μm、5μm、10μm、50μm或更大。颗粒在至少一个维度上可以是至多约50μm、10μm、5μm、1μm、500nm、100nm、50nm、10nm、5nm、1nm或更小。颗粒可以是纳米颗粒、微颗粒、纳米球、微球、纳米棒、微米棒、纳米纤维、纳米带等。颗粒的实例包括金属纳米颗粒(例如，金纳米颗粒，银纳米颗粒和铁纳米颗粒)、金属间纳米半导体纳米颗粒、核-壳纳米颗粒、具有聚合物壳的无机核的颗粒、具有聚合物壳的有机核的颗粒以及它们的混合物。或者，颗粒可以是有机纳米颗粒，例如交联聚合物、水凝胶聚合物、可生物降解的聚合物、聚丙交酯(pla)、聚乙交酯(pga)、聚己内酯(pcl)、共聚物、多糖、淀粉、纤维素、壳聚糖、聚羟基链烷酸酯(pha)、phb、phv、脂质、肽、肽两亲物、多肽(例如蛋白质)或其组合。在表面上呈递b细胞表面蛋白的颗粒可以在体外引入包含结合b细胞表面蛋白的car的免疫细胞。作为另外一种选择或除此之外，呈递b细胞表面蛋白的颗粒可以与包含car的免疫细胞一起体内引入(例如局部或全身注射)。这些颗粒可用于在体外或体内扩增包含car的免疫细胞群。
[0075]
在一些实施方案中，car的抗原相互作用结构域能够在死b细胞上结合b细胞表面蛋白或其片段。b细胞凋亡可以在免疫应答发展之前或之后发生。因此，死b细胞或其碎片仍然可以在表面上呈现b细胞表面蛋白或其片段。car靶向活b细胞和死b细胞的能力可以增加包含所述car的修饰的免疫细胞结合b细胞表面蛋白和启动细胞内信号传导结构域的信号传导的概率。在一些情况下，细胞内信号传导结构域的信号传导可促进包含car的免疫细胞的扩增(增殖)。
[0076]
car的胞内信号传导结构域可以诱导修饰的免疫细胞的活性。胞内信号传导结构域可以转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能。信号传导结构域可包含其他分子的信号传导结构域。在一些情况下，将信号域的截短部分用于car。胞内信号传导结构域包含参与免疫细胞信号传导的多个信号传导结构域，或其任何衍生物、变体或片段。car的胞内
信号传导结构域可包括共刺激结构域，例如来自共刺激分子。
[0077]
在一个具体的实施方案中，本申请的car包含seq id no:3的序列或与该序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同源性的序列，或由这样的序列组成。
[0078]
与缺乏car的免疫细胞相比，包含的修饰的免疫细胞可通过car与b细胞表面蛋白的结合可以增强免疫细胞增殖。免疫细胞的增殖可以指免疫细胞的扩增或表型变化。包含car的本发明的修饰的免疫细胞可与b细胞表面蛋白结合，其增殖可以是缺乏car的相应免疫细胞的增殖的约5倍至约10倍，约10倍至约50倍，约50倍至约100倍，约100倍至约200倍，约为200倍至约300倍，约300倍至约400倍，约400倍至约500倍，约500倍至约600倍，大约600倍至约700倍。增殖可以在使b细胞与包含car的修饰的免疫细胞接触后至少约12、24、36、48、60、72、84或96小时确定。可以在体外或体内确定增殖，例如通过测定免疫细胞的数量。测定免疫细胞的数量的方法可包括流式细胞术、台盼蓝排除法和/或血细胞计数法。也可以通过免疫细胞的表型分析来确定增殖。
[0079]
本文提供的增强受体和car的各种结构域可通过化学键连接，例如酰胺键或二硫键；小有机分子(例如烃链)；氨基酸序列，例如肽接头(例如，长度约3-200个氨基酸的氨基酸序列)，或其组合。肽接头可提供所需的灵活性以使嵌合多肽能够具有恰当的表达、活性和/或构象定位。肽接头可以具有任何合适的长度以连接至少两个目标结构域，并且优选设计为有足够的柔性以使其连接的一个或两个结构域能够正确折叠和/或发挥功能和/或具有活性。在一些实施方案中，肽接头的长度为约0至200个氨基酸，约10至190个氨基酸，约20至180个氨基酸，约30至170个氨基酸，约40至160个氨基酸，约50至150个氨基酸，约60至140个氨基酸，约70至130个氨基酸，约80至120个氨基酸，约90至110个氨基酸。在一些实施方案中，接头序列可包含内源蛋白质序列。在一些实施方案中，接头序列包含甘氨酸，丙氨酸和/或丝氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，接头可以以gs、ggs、ggggs、ggsg或sggg为基序并含有多个这样的基序，例如多个重复的相同基序。接头序列可包括任何天然存在的氨基酸，非天然存在的氨基酸或其组合。
[0080]
在一些实施方案中，本发明的修饰的免疫细胞还包含调控免疫细胞死亡的修饰，如自杀开关。在严重毒性的情况下，例如高细胞因子血症出现时，可以激活自杀开关以消除免疫细胞。当免疫系统具有过于强烈的反应以致许多炎性细胞因子被释放时，会引发轻微至严重的症状，包括发烧、头痛、皮疹、心跳加速、低血压和呼吸困难，此时可以启动自杀开关。自杀开关可以是药物诱导自杀开关。自杀开关可包含诱导型半胱天冬酶9。
[0081]
在优选的实施方案中，本发明的修饰的免疫细胞不包含外源引入的tcr。
[0082]
可以使用任何合适的递送方法将需要的组合物和分子如多肽和/或核酸如编码多肽的核酸引入免疫细胞以完成修饰。各种组分可以同时或分开递送。递送方法可包括将一种或多种核酸引入免疫细胞，所述核酸包含编码本发明组合物的核苷酸序列，例如其可以是包含编码目标产物的核苷酸序列的表达载体，如重组表达载体。与宿主细胞相容的任何合适的载体可用于本发明。
[0083]
递送或转化方法的非限制性实例包括但不限于病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(pei)介导的转染、deae-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接微注射和纳米颗粒介导的核酸递送。
[0084]
基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于将核酸引入哺乳动物细胞或组织中，因此在本发明中可用于将目标核酸引入培养中的细胞中。非病毒载体递送系统可包括dna质粒、rna(例如转录物)、裸核酸和与递送载体复合的核酸例如脂质体。病毒载体递送系统可包括dna和rna病毒，其在递送至细胞后可与细胞的基因组整合或不整合。
[0085]
基于rna或dna病毒的体系可用于靶向体内的特定细胞并将病毒的负载运输至细胞核。病毒载体可以直接(体内)给药，或用于体外处理细胞，并且可以任选地(离体)施用至细胞。基于病毒的系统可包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒和单纯疱疹病毒载体。利用逆转录病毒、慢病毒和腺伴随病毒基因转移方法可以在宿主基因组中进行整合，这可以产生插入的转基因的长期表达。在许多不同的细胞类型和靶组织中可以观察到高转导效率。优选地，本发明使用慢病毒载体。
[0086]
在一些方面，本发明提供修饰免疫细胞的方法，包括将一种或多种多核苷酸，或如本文所述的一种或多种载体，或其一种或多种转录物，和/或由其转录的一种或多种蛋白质递送至免疫细胞的方法。在一些方面，本公开还提供由这些方法产生的修饰的免疫细胞，以及包含这些免疫细胞。
[0087]
靶细胞
[0088]
本发明的修饰的免疫细胞可以靶向并作用于体外、体内或离体的多种靶细胞。靶细胞可以是分离的细胞。靶细胞可以是生物体内的细胞。靶细胞可以是生物体。靶细胞可以是细胞培养物中的细胞。
[0089]
靶细胞可以是哺乳动物细胞或源自哺乳动物细胞，所述哺乳动物可以是啮齿动物、灵长类如人。靶细胞可以是或可以源自原核细胞，如细菌细胞、古细菌细胞，或者可以是或源自真核细胞。
[0090]
靶细胞可以是被病原体感染的细胞，所述病原体可以是微生物，包括但不限于细菌、真菌或病毒。靶细胞可以是宿主细胞，如所述病原体的宿主细胞。在具体的实施方案中，所述靶细胞是例如受到肝炎病毒感染的细胞或受到人乳头瘤病毒感染的细胞，所述肝炎病毒优选乙型肝炎病毒。
[0091]
靶细胞可以来自特定器官或组织。靶细胞可以是单细胞生物。
[0092]
靶细胞可以是干细胞或祖细胞，包括但不限于成体干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞(ipscs)和祖细胞如心脏祖细胞、神经祖细胞等。靶细胞可以是多能干细胞。
[0093]
靶细胞可以是经遗传修饰的细胞。靶细胞可包含靶核酸。
[0094]
靶细胞可以是患病细胞，如来自患病受试者的细胞。患病细胞可具有改变的代谢，基因表达和/或形态学特征。患病细胞可以是癌细胞或被病毒感染的细胞。
[0095]
在优选的实施方案中，所述靶细胞是肿瘤细胞，特别是癌细胞。所述肿瘤包括实体瘤和血液肿瘤，优选实体瘤。
[0096]
治疗用途
[0097]
本发明的修饰的免疫细胞可以用于治疗肿瘤，换言之以肿瘤细胞为靶细胞。在一些实施方案中，靶细胞形成肿瘤。用本发明的修饰的免疫细胞治疗可使肿瘤的生长稳定、不进展和/或不转移。例如，所述“生长稳定”意味着在治疗之后的一段时间内，一个或多个肿瘤的体积增加不超过1％、5％、10％、15％或20％。在一些实施方案中，所述一段时间为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多周，优选至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更
多个月，更优选至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年。在一些实施方案中，用本发明的修饰的免疫细胞治疗可使肿瘤的大小或肿瘤细胞的数量减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，肿瘤被完全消除，或降低至低于检测水平。在一些实施方案中，受试者在治疗后保持无肿瘤至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多周，优选至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月，更优选至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年。
[0098]
在用于治疗肿瘤时，施用给受试者的本发明的修饰的免疫细胞的量是104至10
10
之间，104至109之间，105至108之间，106至107之间。在本发明的pd-1
+
t细胞包含扩增因子修饰如cd19 car时，回输的总量可以适当低于不包含所述修饰的本发明的pd-1
+
t细胞，这是因为cd19 car有助于回输的免疫细胞在患者体内的扩增，这一效果在实施例5中有详细的记载。例如，在本发明的pd-1
+
t细胞包含扩增因子修饰如cd19 car时，回输细胞的总量可以在104至109之间，105至108之间，106至107之间。本发明的修饰的免疫细胞可以分为一次或多次回输给受试者，例如一次、两次、三次、四次。每次回输的免疫细胞的量可以相同或不同。
[0099]
本发明的修饰的免疫细胞可以用于治疗与病毒感染相关的疾病或症状，换言之以受病毒感染的细胞为靶细胞。在一些实施方案中，本发明的免疫细胞在治疗患者中癌症的同时可以清除患者体内的病毒，例如抗病毒治疗后的残余病毒。因此，本发明的经修饰的免疫细胞和方法特别适合于已知感染过病毒的患者。所述病毒感染可以与癌症有关，也可以与癌症无关。在另一些实施方案中，本发明的免疫细胞被专门用于针对受病毒感染的细胞、治疗与病毒相关的疾病和/或清除病毒。
[0100]
在优选的实施方案中，所述病毒感染是乙肝病毒感染。例如，所述病毒感染是慢性乙肝病毒感染，如肝脏被乙肝病毒感染的时间持续超过六个月。与慢性乙肝病毒感染相关的疾病包括肝硬化、肝细胞瘤。
[0101]
在另一个优选的实施方案中，所述病毒感染是人乳头瘤病毒(hpv)感染。迄今为止已经发现了超过100种人乳头瘤病毒。按照是否与癌症相关一般分为致癌的高危型(包括但不限于16型、18型、31型、45型、52型、84型)和不致癌的低危型(如引发尖锐湿疣的6型、11型、42型、43型、44型)。hpv可以引起人皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，导致皮肤、呼吸道、口腔、消化道、眼部、肛门和泌尿生殖系统的疾病。与hpv相关的疾病包括但不限于疣如寻常疣、扁平疣、尖锐湿疣，肿瘤或癌症如鳞状细胞癌、宫颈癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌、口咽癌。
[0102]
靶细胞的死亡可以通过任何合适的方法确定，包括但不限于在处理之前和之后计数细胞，或测量与活细胞或死细胞相关的标记物的水平。细胞死亡程度可通过任何合适的方法确定。在一些实施方案中，相对于起始条件确定细胞死亡程度。例如，个体可具有已知起始量的靶细胞，例如已知大小的起始细胞团或已知浓度的循环靶细胞。在这种情况下，细胞死亡程度可表示为治疗后存活细胞与起始细胞群的比率。可以使用各种细胞死亡分析，并且可以使用多种检测方法。检测方法的实例包括但不限于细胞染色、显微术、流式细胞术、细胞分选及其组合。
[0103]
当在治疗期结束后对肿瘤进行手术切除时，可以通过测量坏死(即，死亡)的切除组织的百分比来确定治疗在减小肿瘤大小方面的功效。在一些实施方案中，如果切除组织的坏死百分比大于约20％则治疗有效，例如至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％
或100％。在一些实施方案中，切除组织的坏死百分比是100％，即，没有活肿瘤组织存在或可检测到。
[0104]
将靶细胞暴露于本发明的修饰的免疫细胞可以在体外或体内进行。将靶细胞暴露于修饰的免疫细胞通常是指使靶细胞与修饰的免疫细胞接触和/或足够接近使得靶细胞的抗原(例如，膜结合或非膜结合抗原)可以与免疫细胞中表达的受体包括增强受体和/或car结合。通过共培养靶细胞和修饰的免疫细胞，可以在体外将修饰的免疫细胞暴露于靶细胞。共培养可以作为贴壁细胞或者悬浮液进行。靶细胞和修饰的免疫细胞可以在各种合适类型的细胞培养基中共培养，例如与补充物、生长因子、离子等共培养。可以在体内将靶细胞暴露于修饰的免疫细胞，例如，通过将修饰的免疫细胞施用于受试者，例如人，并允许所述修饰的免疫细胞通过循环系统定位于靶细胞来实现。在一些情况下，可以将修饰的免疫细胞递送至靶细胞所在区域，例如通过直接注射。所述暴露可以进行任何合适的时间长度，例如至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时、至少20小时、至少24小时、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月或更长时间。
实施例
[0105]
为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
[0106]
实施例1.验证癌症患者的pd-1
+
t细胞对肿瘤的识别特性
[0107]
为了验证癌症患者外周血pd-1
+
t细胞对肿瘤的识别特性，将来源于同一患者的肿瘤组织进行处理，构建人源肿瘤异种移植(patient-derived tumor xenograft,pdx)小鼠模型，具体流程如下。
[0108]
i.肿瘤移植
[0109]
1.将手术中从结肠癌患者取得的新鲜肿瘤样本转至60mm无菌培养皿中，加入适量含1％青霉素链霉素的pbs对肿瘤进行清洗。
[0110]
2.用灭菌手术刀片将肿瘤样本按3mm
×
3mm
×
3mm大小进行切割，并对6-8周龄npi(遗传背景nod-prkdcem1idmo-il2rgem2idmo)雄性小鼠进行皮下移植。
[0111]
3.移植前对npi小鼠腹腔注射麻醉剂，待小鼠麻醉后用灭菌眼科剪在小鼠右后肢外上方皮肤剪开约1cm开口，用眼科镊将肿瘤块推送至右后肢外侧皮下后闭合手术切口。
[0112]
ii.肿瘤观察
[0113]
1.成瘤后的肿瘤为p0代次，使用游标卡尺量取肿瘤长径a与短径b，并以公式(v)＝1/2
×
a
×
b2进行肿瘤体积计算。
[0114]
2.在p0肿瘤长至800-1000mm3大小时摘取肿瘤，剔除坏死组织后按每块3mm
×
3mm
×
3mm大小再次进行切割，并重复上述步骤移植到npi小鼠皮下进行组织传代，再次成瘤后将肿瘤标记为p1代次(小鼠荷瘤情况如图1所示)。重复此步骤，传至p3代次时，分别从3只小鼠身上摘取肿瘤组织，进行后续体外功能实验(解剖的肿瘤组织如图2所示)。
[0115]
3.每代次获得的肿瘤样本均可用于基因组学、蛋白组学及病理学分析等使用，同
时可留存缓冻样本，在后续有实验需求时复苏以进行荷瘤使用。
[0116]
iii.pd-1
+
t和pd-1-t细胞的分选
[0117]
在pdx小鼠模型传至第3代次时，分选来自同一患者的外周血pd-1
+
t细胞和pd-1-t细胞。
[0118]
iiia.pd-1
+
t细胞分选
[0119]
1.根据预计分选pd-1
+
细胞数和pd-1
+
细胞比例，取出相应数量的pbmc细胞于离心管中；
[0120]
2.加入足量生理盐水重悬洗涤细胞，600g离心10min，弃掉上清；
[0121]
3.重复步骤2生理盐水洗涤第2遍，获得细胞沉淀；
[0122]
4.每1
×
107个总细胞加入40μl缓冲液重悬；每1
×
106个有效细胞加2μl抗-pd-1-biotin抗体(biolegend，cat#329934)，混匀后4℃避光孵育10-15min；
[0123]
5.每1
×
107个总细胞加0.5-1ml缓冲液清洗，600g离心10min，吸弃上清；
[0124]
6.每1
×
107个总细胞加80μl缓冲液重悬，每1
×
107个有效细胞加20ul抗-biotin microbeads(meltenyi，cat#130-090-485)，混匀后4℃避光孵育15min；
[0125]
7.每1
×
107个总细胞加入1-2ml缓冲液清洗，600g离心10min，吸弃上清；
[0126]
8.每1
×
108个总细胞加入1ml缓冲液重悬细胞；
[0127]
9.将ls型分选柱放在磁力架上，下方放置15ml离心管，用3ml缓冲液润洗柱子1次，然后替换为新的50ml离心管作收集管；
[0128]
10.将步骤8中重悬的细胞混匀加入ls型柱内，过柱完成后，用3ml缓冲液冲洗柱子，洗3次，收集未吸附的细胞，即pd-1-pbmc细胞，计数，用于后续分选pd-1-t细胞；
[0129]
11.将ls型分选柱从磁力架上取下，放入一新的15ml离心管上；
[0130]
12.加入5ml缓冲液于柱内，迅速用活塞将柱内液体推出，收集到磁珠标记的细胞即为pd-1
+
细胞，计数，备用；
[0131]
13.分别取步骤10和步骤12分选出的pd-1-和pd-1
+
细胞各5
×
105个并标记cd3-apc的抗体，进行流式检测；
[0132]
14.根据实验需要，取相应数量的pd-1
+
细胞，600g离心10min，用完全培养基重悬细胞；
[0133]
15.重悬的pd-1
+
t细胞加入cd3/cd28 dynabeads(gibco，cat#40203d)进行激活，传代培养。
[0134]
iiib.pd-1-t细胞分选
[0135]
1.cd3流式检测pd-1-pbmc中t细胞的比例，并根据细胞计数计算出t细胞的总数目；
[0136]
2.根据t细胞数目，按照t细胞与cd3/cd28 dynabeads比例为1:3，取相应数量的cd3/cd28 dynabeads于15ml的离心管中，磁力架上去除保存液；
[0137]
3.将离心管从磁力架上取下，加入培养基重悬cd3/cd28 dynabeads(10倍体积)，置于磁力架上去除培养基；
[0138]
4.重复步骤3两次，最后一次使用1-5ml培养基重悬cd3/cd28 dynabeads；
[0139]
5.将1/2的重悬cd3/cd28 dynabeads加入悬浮细胞液中，调整细胞浓度3.35-15
×
106/ml于新的离心管中(50ml离心管15-50ml，15ml离心管2-15ml)；
[0140]
6.将离心管置于杂交炉上(1rpm/min)，室温18-20℃孵育30min；
[0141]
7.小心的将离心管置于磁力架上，静置2min，收集与cd3/cd28 dynabeads结合的t细胞，并用适量的培养基重悬，计数；
[0142]
8.未吸附的细胞悬液重复步骤5-7，第二次收集与cd3/cd28 dynabeads结合的t细胞，并用适量的培养基重悬，计数；
[0143]
9.未吸附的细胞悬液计数，冻存；
[0144]
10.将步骤7、8两部分收集的与cd3/cd28 dynabeads结合的t细胞合并，调整细胞密度到1.2
×
106/ml，加入tscm(t150 100-120ml，t75 50-60ml，t25 15-29ml)；
[0145]
11.混匀放入co2培养箱，传代培养。
[0146]
iv.检测t细胞的激活
[0147]
从上述第ii部分获得的3只p3代次小鼠身上分离肿瘤组织并剪碎，通过酶消化法制备成单细胞悬液，并分别命名为1#肿瘤组织、2#肿瘤组织、3#肿瘤组织。将上述第iii部分制备的pd-1-t细胞和pd-1
+
t细胞分别与所述3个肿瘤组织细胞共培养，形成六种培养物，在24小时和48小时分别对这六种培养物进行elispot实验，通过检测ifn-γ来考察不同t细胞的激活情况。
[0148]
如图3a-b所示，pd-1
+
t细胞的ifn-γ释放显著高于pd-1-t细胞，意味着pd-1
+
t细胞被肿瘤组织激活，而pd-1-t细胞则不能。该结果表明通过上述分选方法从患者外周血中获得的pd-1
+
t细胞能够有效识别肿瘤细胞并对其产生免疫应答、启动杀伤，说明患者外周血中存在能够对肿瘤细胞发挥免疫功能的t细胞(肿瘤特异性t细胞)，并且这些细胞主要集中在pd-1
+
组分中。
[0149]
实施例2.敲除pd-1对pd-1
+
t细胞功能的提升
[0150]
为了验证pd-1的敲除是否能够通过消除pd-1
+
t细胞的“抑制状态”来有效提升pd-1
+
t细胞的功能，进行了本实施例中的实验。发明人构建了一种体外模型，其中使用了以ny-eso-1表达为特征的肿瘤细胞，并构建了包含与之相对应的能够结合ny-eso-1的tcr的pd-1
+
tcr-t细胞。在此基础上使用crispr-cas9技术对t细胞中的pd-1基因进行了敲除，以观察其对肿瘤细胞的效果变化。
[0151]
首先，单采患者白细胞，加入pd-1单抗分选pd-1
+
t细胞，分选效率如图4a所示。
[0152]
随后在分选出的pd-1
+
t细胞中加入cd3/cd28 dynabeads，培养过夜。第二天将pd-1
+
t细胞分为两组，一组为notd-t，不加病毒转染；一组为tcr-t，加入表达识别ny-eso-1的tcr的慢病毒载体(plenti-tcr-ny eso1，质粒结构如图12所示)，按照moi(慢病毒数目/细胞数)＝2加入慢病毒。培养及扩增t细胞，流式检测该tcr的表达率为40.1％(图4b)。
[0153]
加入慢病毒后第4天去除cd3/cd28 dynabeads，第5天通过电转的方式将pd-1sgrna和cas9蛋白转入至pd-1
+
notd-t细胞和pd-1
+
tcr-t中，敲除内源表达的pd-1，并以不处理组和空电击组作为对照。如图4c所示，电转后第7天流式检测pd-1的表达情况，notd-t细胞不处理组和空电击组pd-1阳性比例分别为39.6％和34.8％，敲除pd-1后pd-1阳性比例降至3.6％；tcr-t细胞不处理组和空电击组pd-1阳性比例分别为40.1％和37.9％，敲除pd-1后pd-1阳性比例降至4.0％，敲除效果较好，可进行后续实验。
[0154]
为了验证敲除pd-1对pd-1
+
t细胞功能的影响，进行了elisa实验。将不同组的t细胞与膀胱癌细胞系j82或过表达ny-eso-1蛋白的j82-ny-eso1(j82-ny)肿瘤细胞共培养24
l1对t细胞功能的抑制。与之相反，表达增强受体的t细胞功能不仅没有被pd-l1蛋白所抑制，相对于仅使用okt3的处理，同时使用okt3和pd-l1处理的表达增强受体的t细胞具有显著更高的ifn-γ分泌，说明pd-l1蛋白结合到v1e或v2e增强受体上不仅会接触pd-l1本身对t细胞的抑制，还会显著促进t细胞分泌细胞因子。这个结果表明通过使本发明获得的pd-1
+
t细胞表达增强受体能够有效将pd-l1的抑制信号转变成对t细胞的激活信号，增强pd-1
+
t细胞的功能。
[0170]
实施例4.增强受体对pd-1
+
t细胞功能的提升(体内实验)
[0171]
为了进一步验证增强受体对pd-1
+
t细胞体内抑瘤功能的影响，构建了两种体系。一种包括移植有肿瘤细胞系的小鼠和表达能够识别该肿瘤细胞系的tcr以及增强受体的t细胞，另一种包括来自实体瘤患者的肿瘤细胞和来自同一患者的t细胞。
[0172]
1.使用接种了j82-ny-eso1肿瘤细胞系的小鼠的测试
[0173]
首先为20只nsg小鼠接种了j82-ny-eso1肿瘤细胞。当平均肿瘤体积达到100mm3时，将20只小鼠随机分为5组，每组4只。
[0174]
与此同时，从肿瘤患者外周血中分选pd-1
+
t细胞，同时将分选后的阴性组分定义为pd-1-t细胞。对分选后的pd-1
+
t和pd-1-t细胞进行慢病毒转染，以moi＝2的剂量分别加入表达tcr(识别ny-eso1的tcr)和表达v1e-tcr的慢病毒，如实施例3中所述制备pd-1-tcr-t、pd-1
+
tcr-t和pd-1
+
v1e-tcr-t细胞，以pd-1
+
notd细胞(未经病毒转染的pd-1+t细胞)为对照。
[0175]
细胞制备完成后，分别回输给4组小鼠，同时1组小鼠回输pbs作为空白对照。回输后在不同的时间点通过测量皮下肿瘤的长、宽、高来计算小鼠体内肿瘤的体积。
[0176]
结果如图6所示，回输pbs和pd-1
+
notd细胞的小鼠肿瘤持续增殖(图6a、6b)，在t细胞回输后第44天肿瘤体积达到500mm3左右。而另外3组小鼠回输了pd-1-tcr-t、pd-1
+
tcr-t和pd-1
+
v1e-tcr-t细胞，肿瘤体积均有所减小(图6c-e)，且pd-1
+
v1e-tcr-t细胞的效果最为明显，肿瘤基本上完全被去除。
[0177]
在图6f中显示了各组的肿瘤体积平均值曲线。回输了pd-1-tcr-t、pd-1
+
tcr-t和pd-1
+
v1e-tcr-t细胞的各个组内小鼠的肿瘤体积平均值分别为25.43mm3、102.4mm3和0mm3，均显示出了较好的抑瘤效果。
[0178]
如上所述，pd-1
+
v1e-tcr-t细胞的抑瘤效应最强，4只小鼠的肿瘤均被完全清除，实现100％cr的疗效。该疗效比pd-1-tcr-t的抑瘤效果更好，表明pd-1
+
t中负载的增强受体能够有效提升pd-1
+
t细胞的功能，使得原本肿瘤抑制效果不如pd-1-t细胞的pd-1
+
t细胞的耗竭状态被逆转，产生了更优于不表达增强受体的pd-1-t细胞的效果。
[0179]
2.使用移植了患者肿瘤组织的小鼠的测试
[0180]
使用移植了来自患者的肿瘤组织的小鼠和来自同一患者的t细胞进行了类似的实验。
[0181]
发明人将来自实体瘤患者的肿瘤组织构建成pdx(patient-derived tumor xenograft)模型。pdx模型传至第5代时，选取20只小鼠，在平均肿瘤体积达到100mm3时，将20只小鼠随机分为4组，每组5只。
[0182]
与此同时，从来自于同一患者的外周血中分选pd-1
+
t细胞，同时将分选后的阴性组分定义为pd-1-t细胞。对分选后的一部分pd-1
+
t细胞进行慢病毒转染，以moi＝2的剂量
加入表达增强受体v2e的慢病毒(该构建体与实施例3中表达v2e-tcr的慢病毒载体相同，只是不包括编码tcr的片段)，并制备pd-1
--
t、pd-1
+-t和pd-1
+
v2e-t细胞。
[0183]
细胞制备完成后，分别回输给3组小鼠，同时1组小鼠回输pbs作为空白对照。回输后在不同的时间点测定小鼠体内肿瘤的体积。
[0184]
比较各组不同小鼠的肿瘤增殖情况，结果如图7a-c所示。由于使用的是来自患者的肿瘤组织直接进行移植，相较于上文使用的细胞系而言，移植到每只小鼠体内的肿瘤组织在细胞构成上可能具有较大的异质性，使得同组中不同小鼠之间的结果也存在一些区别。因此，本实验中没有如前一实验中那样计算各组的平均值并进行比较。
[0185]
尽管如此，从图7中也可以看出，回输pbs和pd-1
--
t、pd-1
+-t细胞的所有小鼠肿瘤均持续增殖，且增殖速率较快，未见任何抑瘤效应。而回输pd-1
+
v2e-t细胞的小鼠，5只小鼠中有3只出现肿瘤体积缩小，其中两只小鼠的肿瘤体积由最初的94mm3和85mm3分别减小到21mm3和52mm3(图7d)。
[0186]
该结果表明pd-1
+
t细胞中负载增强受体能够有效提升pd-1
+
t细胞的功能，甚至逆转pd-1
+
t细胞的状态，促进其在体内的抑瘤能力。
[0187]
实施例5.经增强受体和car修饰的pd-1
+
t细胞的首批临床试验
[0188]
在本申请的背景中，认为晚期肿瘤患者外周血中的pd-1
+
t细胞是曾经在肿瘤中浸润过，并且在被肿瘤微环境抑制后又返回外周血的t细胞，将其称为ctil(circulating tumor infiltrating lymphocyte)。
[0189]
将对传统治疗无效的9位晚期实体瘤患者(或称受试者)纳入临床试验研究，采集患者pbmc，分离出其中的pd-1
+
t细胞(ctil)，对其进行表达v1e增强受体和扩增因子(cd19 car，序列如seq id no:3所示)的基因修饰，制备成超级ctil(sctil)，然后回输给患者。具体的试验如下。
[0190]
1.受试者的选择
[0191]
患者治疗前的临床情况如下下表所示。
[0192]
表1.患者临床情况
[0193]
序号性别年龄肿瘤类型临床分期tmb1男54胆囊癌iv期中2女54卵巢癌iv期中3女50肺癌iv期低4男73结肠癌iv期高5女53胰腺神经内分泌瘤iv期中6男63肺癌iv期低7男52肾癌iv期中8女61粘膜型黑色素瘤iv期低9男57胰腺癌iv期中
[0194]
在上表中，tmb代表肿瘤突变负荷(tumer mutation burden)，以基因组中每百万碱基的突变数量来评估，低于5为低突变负荷，5-10为中突变负荷，10以上为高突变负荷。本领域通常认为tmb越高越适合免疫治疗，越低越不适合这类疗法。
[0195]
从上表可知，入选患者为八种不同癌种(胆囊癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺神经
内分泌瘤、肾癌、粘膜型黑色素瘤、胰腺癌)的实体瘤患者，均为晚期且经传统多线治疗无效，体内拥有多个远端转移病灶，并且大部分患者tmb不是高水平。
[0196]
2.治疗前的细胞制备
[0197]
2.1pd-1
+
t(ctil)细胞的分离：
[0198]
(1)单采患者自体外周血单个核细胞，分离pbmc。用流式细胞仪检测pd-1
+
t细胞(pd-1
+
cd3
+
双阳性细胞)占总t细胞(cd3
+
细胞)的比例(见下表)。经鉴定发现pd-1
+
t细胞在总t细胞中比例为28.5％(患者1)和14.3％(患者2)(表2)，将如此高比例的pd-1
+
t细胞视为来自肿瘤组织的til，其从肿瘤组织进入了外周血，因此称为ctil(circulating til)。
[0199]
(2)用前述方法分选pd-1
+
t细胞。
[0200]
2.2sctil的制备：
[0201]
用同时装载v1e-cd19 car的联合慢病毒转染ctils细胞，从而制备超级ctil(sctil)。慢病毒转染过程同实施例3所述。经过8-10天的自然扩增过程，使用流式细胞术检测细胞中的car
+
细胞(视为有效细胞)比例，显示有效细胞比例为10％-40％。经过质控放行检验后，装入输液袋。整个制备过程仅为8-10天(不含新抗原成分识别性t细胞鉴定过程)。
[0202]
3.回输治疗及监测：
[0203]
所有患者均静脉回输sctil。将用于静脉回输的半透明淡黄色sctil细胞悬液用38.5℃水浴在床旁复苏后，快速经静脉输注。回输体积根据细胞总量确定，细胞总量为6.9
×
10
5-4.5
×
108回输体积为20-40ml，细胞密度约为3
×
10
6-3
×
107/ml，总有效细胞(car阳性细胞)回输量见表2。回输后的患者持续住院观察。
[0204]
3.1安全性评估
[0205]
所有9名受试者中，只有3人出现高热，其中1人自行缓解，另2人使用托珠单抗治疗后症状缓解，细胞因子风暴(crs)发生率为33％(3/9)，且均为1级crs，crs风险远低于cd19 car-t治疗血液肿瘤；所有患者，无一在治疗后出现自身免疫病。
[0206]
可见，本发明用扩增因子cd19 car和增强受体修饰ctil细胞并见其回输到受试者的治疗方案没有产生不可控的严重副作用，具有理想的安全性。
[0207]
3.2疗效评估
[0208]
根据回输前的基线和回输细胞后的两个月的影像学检查，结果显示，所有受试者在回输细胞后六周的观察期内，疾病总体都得到有效控制，说明本申请的sctil对晚期实体瘤的疾病控制率约为100％(9/9)，即患者对治疗的响应率为100％，其中三例患者的肿瘤出现明显缩小或活性消失，即客观缓解率为33％(3/9)。
[0209]
表2患者治疗结果
[0210][0211]
表2中最右栏的疗效评估均采用recist标准。患者1-4的影像学资料见图16，病灶处以箭头或标尺示出。如图所示，在治疗后肿瘤病灶显著缩小。
[0212]
可见，本发明用扩增因子cd19 car和增强受体修饰的pd-1
+
t细胞可以有效控制甚至治疗多种不同的实体瘤，有着广泛的潜在应用谱系，且其效果与患者肿瘤突变负荷没有关联性，因此其应用不局限于tmb高的患者。
[0213]
3.3car助力sctil在体内扩增特性的验证
[0214]
在回输后的不同时间点(30分钟，24小时，4天，7天，10天，14天，28天，71天和91天)分别采取外周血用于流式检测car阳性细胞数量及与淋巴细胞数量的比值，由此动态监测患者1和2的外周血car阳性细胞(即sctil细胞)比例，并推算其在患者体内的数量绝对值。通过如下公式计算sctil细胞在外周血中扩增的倍数：
[0215]
扩增倍数＝[淋巴细胞数浓度(个/l)
×
循环血量(l)
×
sctil占淋巴细胞比例]/回输sctil细胞数量
[0216]
数据显示，细胞回输后30分钟外周血内car拷贝数即显著高于回输的有效细胞量，提示细胞回输后即刻开始快速扩增。因此，将回输细胞量直接可以作为以上计算公式中的基数，回输后30分钟采血检测的外周血car数值已不能作为未经扩增的基线数值。
[0217]
其中，淋巴细胞数浓度可由血常规检测得到；sctil占t细胞比例可由流式细胞检测car+细胞占cd3
+
细胞比例得到。总循环血量按细胞回输治疗前的公斤体重值换算，男性按80ml/公斤体重，女性按75ml/公斤体重计算出总血容量(升/l)。
[0218]
经计算，在回输sctil后第14天(d14)，随机抽取患者1和2检测并计算sctil细胞在外周血中分别扩增倍数，发现分别为140倍和754倍。同时发现外周血b细胞数量大幅减少至
回输前的8％-25％(数量减少75％-92％)。
[0219]
表3.回输后14天sctil细胞和b细胞的数量变化
[0220][0221][0222]
即便在观察期内患者均未施用外源性的免疫球蛋白，所有患者均未出现免疫缺陷。
[0223]
可见，本发明中具有扩增因子cd19 car修饰的ctil细胞可以有效借助cd19 car对b细胞的识别来帮助其在体内扩增。
[0224]
3.4sctil双重识别性的验证
[0225]
本发明中的sctil采集自外周血来源的til(ctil)，这些t细胞具有天然识别肿瘤的属性，即t细胞的第一识别性。此外，在sctil基础上，引入靶向b细胞的cd19 car的设计，可借助b细胞对其靶标cd19的刺激，实现sctil在体内的大幅度扩增。
[0226]
随机抽取患者1和患者2(表1和表2)，动态监测其外周血循环肿瘤细胞数(ctc)，比较回输当天的基线值，和回输后两个月内的复查的数值。结果显示，这两位受试者在回输sctil细胞后两个月，每5毫升外周血中的ctc数量均大幅下降，见下表。
[0227]
表4.治疗后ctc的数量变化
[0228][0229]
可见，本发明带有扩增因子cd19 car的ctil细胞，不仅可以借助cd19 car识别b细胞来引起til或肿瘤识别性t细胞在体内的大规模扩增，还可借助细胞本身对肿瘤细胞的天然识别属性，进一步识别并杀灭肿瘤患者体内的肿瘤细胞。本发明中修饰的免疫细胞的这种双重识别性通过上述临床试验成功得以证实。
[0230]
4.疗效证据和分析
[0231]
本实施例中sctil疗法的疾病控制率为100％，但如果仅回输天然til细胞，不足以产生这样的疗效，理由如下：
[0232]
1)回输细胞的数量不足以产生这样的疗效。即便以扩增之后外周血中检测到的t细胞数量(10
5-106/kg体重)为基础，结合过去细胞治疗的相关文献报道(如steven rosenberg关于新抗原反应性t细胞或til治疗的报道，回输的细胞量大体在10的10-11次方左右)来看，这样的剂量低于常规回输剂量，因此在治疗实体瘤时不足以取得本实施例中观察到的疗效。
[0233]
2)sctil的来源是til，通常为耗竭性t细胞，在不加以基因改造的情况下，til杀伤
肿瘤的作用是非常有限的，回输如此低剂量的耗竭性t细胞不足以取得本实施例的疗效。
[0234]
因此，根据本实施例的疗效数据可从侧面证明，本发明将增强受体应用于pd-1
+
t细胞可以增强这些来自外周血的免疫细胞抑制肿瘤的能力。
[0235]
5.总结
[0236]
综合本实施例的多项实验结果，可以总结出本发明sctil疗法具有以下特点：
[0237]
1)从易于获得的外周血通过简单分选即可获得pd-1
+
t细胞(ctil)，因此可快速得到肿瘤识别性t细胞，缩短了制备周期；
[0238]
2)增强受体的设计可使超级ctil(sctil)细胞从抑制状态变为激活状态，从而增强对肿瘤的杀伤效率。
[0239]
3)靶向b细胞(cd19)的car的设计可使sctil细胞在体内得以大幅扩增，因此仅需制备很少的sctil细胞，且无需体外大量扩增。
[0240]
4)细胞制备过程简单快速，无需传统新抗原治疗技术的基因测序、筛选、合成等繁琐步骤，从而大幅缩短了制备周期，并进一步大幅降低了制备成本。
[0241]
5)本发明的sctil疗法对于不同癌种，且经传统多线治疗无效的实体瘤患者都显示出非常好的疗效，具有潜在的广泛应用。
[0242]
6)本发明的sctil疗法具有理想的安全性：a)没有严重的脱靶或自身免疫病等毒副作用；b)仅有轻微的细胞因子风暴(crs)出现，远低于car-t治疗b细胞血液肿瘤的crs级别；c)尽管对正常b细胞有所杀伤，但其副作用不会强于car-t治疗b细胞血液肿瘤的应用。这是因为cd19 car-t治疗b系血液恶性肿瘤后，b细胞缺如的状况通常持续不少于18个月，部分患者甚至终生需要替代性免疫球蛋白疗法。相比之下，sctil治疗后b细胞均于1-3个月内恢复并稳定于接近或达到正常生理范围下限的水平，而在此期间，所有受试者的免疫球蛋白均未发现低于正常生理水平下限。
[0243]
实施例6.增强受体修饰的pd-1
+
t细胞治疗恶性实体肿瘤附带清除既往hbv感染残留病毒
[0244]
发明人在使用sctil细胞治疗实体瘤患者的临床试验中，惊讶地观察到在使用本发明的修饰的免疫细胞(sctil)治疗后患者的乙肝标志物和肝酶出现了异常。基于这种观察结果，发明人作出了推测并设计了实验进行验证，继而提出本发明的免疫细胞可用于治疗与hbv感染相关的疾病，以及用于治疗体内残留的hbv病毒。
[0245]
1.sctil细胞治疗后出现的乙肝标志物与肝酶异常——性质与诱因
[0246]
在临床试验中，使用sctil细胞治疗后在两例组外患者中观察到了以下现象。
[0247]
基线处检测肝功能及hbv标志物正常，细胞治疗后出现：
[0248]
1)alt/ast高于正常范围上限；
[0249]
2)hbsag一过性阳性，hbsab和/或其它抗体随后转为阳性，而hbv dna拷贝数及hbcab igm始终保持阴性；
[0250]
3)受试者无主观急性肝炎临床特征(食欲差，黄疸，肝大及肝区胀痛等)；
[0251]
4)用于回输的细胞产品hbv检测阴性，血浆免疫球蛋白保持正常生理水平。
[0252]
为了确定导致上述现象的原因，设计并进行了多项实验，由此通过回答以下几个问题来分析导致这些现象的诱因。
[0253]
1)是否存在hbv对细胞产品的污染或外源性hbv感染？
[0254]
检测了细胞产品中是否含有hbv以及受试者外周血中是否存在hbv，结果均为阴性，因此可以认为细胞产品没有受到hbv的污染，受试者在临床试验期间也没有外源性hbv感染发生。
[0255]
2)是否由于继发于b细胞减少的免疫球蛋白降低，导致hbv病毒易感性增高而继发感染？
[0256]
患者接受sctil的细胞治疗后观察到了外周血淋巴细胞计数较治疗前基线水平降低，但血浆免疫球蛋白浓度始终保持在正常生理范围，因此可以排除这种可能。
[0257]
3)肝功异常是否源于细胞治疗相关不良反应或自体免疫性肝损伤？
[0258]
sctil无化学毒性，其分子作用机制可以确保不伤及自体健康组织，因此可以排除这种可能。
[0259]
2.患者基本情况
[0260]
病例-1(wj)
[0261]
女，36岁，胃印戒细胞癌并宫颈转移2年。测序检测结果tmb 1.03，新抗原16，hla全杂合。2019年11月15日实施单个核细胞单采，采集细胞总数为5.5x10e9/62ml。本实施例使用的sctil细胞的制备与实施例5中的基本相同，但用v2e增强受体(seq id no:2)替代了v1e增强受体，与cd19-car一起用于转染til细胞以获得sctil。治疗细胞制备：sctil细胞70ml
×
2袋+30ml
×
1袋，总有效细胞数量2.5x10e9。细胞分为两次回输，日期分别为2019年12月13日(70ml，有效细胞数量1.03x10e9)和2019年12月18日(70+30ml，有效细胞数量1.47x10e9)，两次回输过程顺利。两次均于完成回输后6小时出现体温升高，自述畏寒，头疼，与轻度恶心，无呕吐及其它特殊不适，发热均持续3天后降至正常水平。
[0262]
乙肝相关指标检测情况：
[0263]
1)患者于2019/11/18(治疗前)和2019/12/16(第1次细胞回输当天)检查肝酶谱与乙肝五项均未见异常；
[0264]
2)第2次回输后21天(2020/01/09)复查肝酶谱正常；
[0265]
3)第2次回输后64天(2020/02/20)再次复查发现肝酶谱升高：alt 65u/l(正常范围0-50u/l)，ast 61u/l(正常范围0-40u/l)，当时未查乙肝五项；
[0266]
4)第2次回输后115天(2020/04/15)复查，发现肝酶学已降至正常范围，但乙肝五项发现乙肝表面抗体阳性，和核心抗体阳性(次日复查为阴性)，而送检hbv dna拷贝数结果为阴性。为排除细胞产品hbv污染，于当日外送第三方检测“细胞制备用单采血样本”和“成品细胞样本”，乙肝病毒检测结果均为阴性。
[0267]
以上肝酶与乙肝五项异常的时间段内，患者自述有轻度纳差，但无恶心，呕吐，肝区涨痛不适，未出现肝大，黄疸等急性传染性感染常见表现。患者肝功与hbv相关指标见图8a。
[0268]
病例-2(ssy)
[0269]
男，46岁，乙状结肠癌合并肠周淋巴结转移。测序检测结果tmb 2.3，新抗原7，hla全杂合。2019年11月15日实施单个核细胞单采，采集细胞总数为4.66x10e9/54ml(制备完成后目前剩余细胞量为1.8x10e9)；治疗细胞制备:sctil细胞50ml
×
2袋，总有效细胞数量9.91x10e8。细胞分两次回输，日期分别为2020/01/02和2020/01/06，两次回输量各为4.955x10e8/50ml，过程顺利。首次回输后7小时出现畏寒、体温升高最高达39.6℃，口服扑
热息痛+物理降温后体温降至正常。发热持续3天，自感除乏力外余无不适，此后体温自行降至正常水平。第2次回输后未见明显体温改变与不适。
[0270]
乙肝相关指标检测信息：
[0271]
1)患者于2019/12/09(治疗前)，2020/01/06(第2次细胞回输当天)，和2020/01/16(第2次细胞回输后第10天)共3次查肝酶谱均未见异常；治疗前查乙肝五项为阴性。
[0272]
2)第2次回输后77天(2020/03/23)复查发现肝酶谱升高:alt 163u/l(正常范围0-50u/l)，ast 113u/l(正常范围0-40u/l)，当时未查乙肝五项；
[0273]
3)第2次回输后85天(2020/04/01)复查，alt 743u/l(正常范围0-50u/l)，ast 243u/l(正常范围0-40u/l)，乙肝五项发现乙肝表面抗原阳性，和核心抗体阳性，但核心抗体igm为阴性；
[0274]
4)第2次回输后93天(2020/04/09)复查，alt 301u/l(正常范围0-50u/l)，ast 76u/l(正常范围0-40u/l)，乙肝五项乙肝表面抗原转阴，核心抗体仍为阳性；
[0275]
5)第2次回输后132天(2020/04/09)复查，alt与ast均降低至正常范围，未查乙肝五项。
[0276]
以上肝酶与乙肝五项异常的时间段内，患者自述有轻度纳差，但无恶心，呕吐，肝区涨痛不适，也未出现肝大，黄疸等急性传染性感染常见表现。患者肝功与hbv相关指标见图8b。
[0277]
对照病例-真实hbv感染(cy)
[0278]
女，26岁，结肠癌术后伴多发肺部转移，于2019年5月9日接受sctil细胞(有效细胞量6.4x10e8)回输治疗。患者于2019年8月1日检测乙肝标志物，结果为阴性；于2019年9月13日有高度可疑血源性hbv接触事件；2019年10月12日检测发现乙肝表面抗原与e抗原阳性，抗体阴性，检测乙肝病毒dna拷贝数为阳性；给予保肝治疗后于2019年11月12日复查，结果为乙肝抗原与乙肝病毒dna拷贝数均转阴，而乙肝表面抗体与核心抗体转为阳性。患者肝功与hbv相关指标见图8c。
[0279]
3.乙肝标志物与肝酶异常与细胞治疗的相关性机理
[0280]
以上所述两例患者的特点在于，在观察到免疫细胞抗肿瘤疗效的同时，在细胞回输后6-8周检测到肝酶(alt，ast)升高，一过性hbsag(表面抗原)转为阳性(持续一周后转阴)，继之以hbsab/hbcab(表面抗体/核心抗体)由阴性转为阳性和肝酶降低至正常水平。在此期间，外周血与细胞产品的乙型肝炎病毒(hbv)dna拷贝数和hbcab igm检测均呈阴性，血浆免疫球蛋白(igg，igm，iga)均保持在正常范围内。
[0281]
发明人认为这种现象与既往hbv感染后少量病毒成分驻留于肝细胞内(图9)，其病毒dna的复制/组装/出胞程序被宿主增强的免疫机能所静默化有关。hbv感染后，被肝细胞mhc机制提呈的hbv蛋白可以被免疫淋巴细胞所识别，但免疫淋巴细胞对靶细胞的攻击可受到病毒感染肝细胞的免疫杀伤逃逸性机制(肝细胞的pd-l1表达)的抑制，从而阻止了对包含hbv成分的肝细胞的免疫性毁损和hbv清除(图10)，并因此产生了机体免疫机能显著降低时乙肝感染复发的风险。
[0282]
本申请实施例中采集并用于sctil制备的单核细胞通过使用pd-1抗体磁珠进行分选并获得pd-1阳性(pd-1
+
)淋巴细胞来制备。如前文所述，这些pd-1
+
细胞中包含了特异性识别hbv提呈膜蛋白、但对靶细胞的杀伤活性受到肝细胞所表达pd-l1抑制的ctl亚群。将这些
细胞经由慢病毒转染而负载了增强受体由此重新激活其细胞杀伤能力。在并回输后，这些经修饰的细胞(sctil)会经由特异性tcr来识别表达hbv蛋白的靶细胞，并且经由细胞膜增强因子即pd-1的胞外域与靶细胞反应性高表达的pd-l1相结合来反向触发sctil的进一步活化和对靶细胞的强化杀伤效应。遭ctl攻击而崩解的肝细胞将导致hbv成分释放入外周血流并激发体液免疫和抗体滴度升高，表现为一过性hbsag阳性和继发性抗体阳性(图11)。由于在既往乙肝病毒感染时，在宿主细胞内已完成组装的活性病毒颗粒不会受到干扰素抑制病毒复制的影响，不会滞留于宿主细胞内，而是经由主动出胞机制释放入血，因此在肝细胞崩解时不会发生活性hbv病毒颗粒被释放入血并发生感染的播散。这一推测已并被hbv dna和hbcab igm的阴性检测结果所证实。
[0283]
综上所述，发明人根据实验结果推测如下作用机制，sctil作为具有特异性抗原识别能力的异质性t淋巴细胞亚群组合，在发挥抗恶性实体肿瘤效应的同时，也可以附带清除既往感染后隐匿残留于部分靶细胞内的病毒成分，从而消除既往病毒感染在未来免疫力低下时复发的潜在风险。
[0284]
因此，本发明的经修饰的免疫细胞可以在治疗肿瘤患者的肿瘤疾病的同时，清除体内病毒、防止与病毒相关的疾病的复发。
[0285]
4.用途
[0286]
基于上述实验发现，以及sctil细胞治疗后出现假性hbv感染的临床意义，提出涉及本发明的sctil细胞治疗的如下场景和用途。
[0287]
4.1细胞治疗后假性hbv感染与真实hbv感染(见对照病例)的鉴别诊断
[0288]
sctil细胞治疗后假性hbv感染的特点：
[0289]
(1)hbv dna拷贝数低于阳性阈值；
[0290]
(2)肝酶谱与hbv抗原异常先期出现，持续1-2个月后恢复正常；
[0291]
(3)hbv抗体相对滞后出现并在较长时间内维持阳性。
[0292]
真实hbv感染的特点：
[0293]
(1)hbv dna拷贝数升高并发于抗原阳性，且呈现高滴度；
[0294]
(2)肝酶异常通常与hbv抗原的定量异常呈正相关。
[0295]
4.2使用sctil疗法清除残留hbv病毒成分
[0296]
既往hbv感染痊愈后，部分肝细胞内残留复制过程中的hbv成分，有可能在机体免疫力降低时导致感染复发。
[0297]
外周血pd-1阳性淋巴细胞中包含特定亚群，可特异性识别表达被提呈到肝细胞膜的hbv膜蛋白成分，但由于被继发性表达pd-l1所抑制而不能杀伤残留病毒成分的靶细胞。
[0298]
sctil的增强受体分子能够克服pd-l1导致的免疫逃逸，清除体内残留的hbv病毒成分，消除了未来感染复发的隐患。
[0299]
实施例7.增强受体修饰的pd-1
+
t细胞治疗与hpv病毒感染相关的疾病
[0300]
使用如实施例5中所述的方法，基于来自hpv阳性肿瘤患者的外周血样品分选促pd-1
+
t细胞并进而制备表达增强受体和任选的cd19 car的sctil细胞。将制备好的sctil细胞回输给患者用于治疗肿瘤并清除hpv感染。

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