一种重组融合蛋白及其制备的预防PCV2病毒感染的疫苗的制作方法

一种重组融合蛋白及其制备的预防pcv2病毒感染的疫苗
技术领域
[0001]
本发明属于生物疫苗技术领域，具体涉及一种重组融合蛋白pigfc-pcv2cap-il29，并进一步公开了表达该重组融合蛋白的重组cho细胞株，以及其制备的预防pcv2病毒感染的疫苗。


背景技术：

[0002]
猪圆环病毒（porcinecircovirus，pcv）是迄今发现的最小的动物病毒之一，感染猪的免疫系统会被完全破坏，丧失对其他疫苗的免疫应答能力，导致免疫失败，同时导致其他病原体的继发感染，所以猪圆环病毒又称为猪的“艾滋病”。现已知pcv有两个血清型，即pcv1和pcv2，pcv1为非致病性的病毒，pcv2为致病性的病毒，猪对pcv2具有较强的易感性。pcv2是断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎与肾病综合征等相关疾病的首要致病因子，给养猪业造成巨大的经济损失。我国在2000年首次报道了猪圆环病毒病，至今pcv2已在我国猪群中流行二十年。大量的流行病学研究表明，我国猪群中pcv2感染十分普遍，pcv2抗体阳性率高达80%以上，由猪圆环病毒引起的继发感染通常超过50%，死亡率达到40%以上。在2001-2012年期间，中国分离了258株pcv2株，其中有242株序列均为pcv2b基因亚型，约占比93.8%，证明我国近几年流行的毒株为pcv2b 亚型。
[0003]
目前，防控猪圆环病毒2型（pcv2）病毒病的主要方法即是接种疫苗。当前国内市场上使用的猪圆环病毒2型疫苗主要是pcv2全病毒灭活疫苗、pcv1-pcv2嵌和病毒灭活疫苗以及杆状病毒表达pcv2基因工程疫苗或者大肠杆菌表达pcv2基因工程苗。其中，全病毒灭活疫苗对机体刺激时间比较短，需2次接种，而且pcv2在细胞上增殖滴度低，制备费用高；基因工程亚单位疫苗相对于其他疫苗，疫苗抗体产生的更早，抗体水平稳定，能够有效阻止病毒的复制，保护力强。国内注册的只有青岛易邦的大肠杆菌表达系统表达的基因工程亚单位疫苗和武汉中博的昆虫杆状病毒表达系统的基因工程亚单位苗。但是，亚单位疫苗对佐剂的要求比较高，水佐剂疫苗虽然在市场上备受青睐，但水佐剂控缓释效果不如油佐剂，因此，改善水佐剂疫苗的缓释性能，使疫苗在抗体的产生时间、抗体水平和持续时间上大幅度提升显得至关重要。
[0004]
白细胞介素-29（interleukin-29，il-29）是新近发现的干扰素-λ（interferon-λ，ifn-λ）家族的新成员，它主要由成熟的树突状细胞和巨噬细胞产生。il-29作为干扰素家族的成员之一，近年来已被发现具有抗多种病毒活性、抗肿瘤增值活性、免疫调节等作用。il-29能够诱导tlr3的表达提高宿主抗病毒活性，同时il-29能够诱导靶细胞产生促炎症因子来激活天然免疫反应，进而启动体液免疫反应。研究还发现，il-29能够上调巨噬细胞中il-6、il-8、il-10表达，能够调节th1和th2的免疫应答。本申请方案通过将il-29与pcv2共表达，同时接种免疫集体，一方面期待能够调剂集体免疫系统应答，另一方面，在期待主动免疫未能彻底激活以前，可以非特异性的激活集体抗病毒机制，达到防病、抗病的目的。


技术实现要素：

[0005]
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种重组融合蛋白pigfc-pcv2cap-il29，即将猪免疫球蛋白fc片段、筛选的猪圆环病毒2型cap蛋白与具有免疫增强作用的白细胞介素-29蛋白通过lingker序列连接获得的融合蛋白；本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种基于所述重组融合蛋白pigfc-pcv2cap-il29制备的预防猪圆环病毒病的疫苗。
[0006]
为解决上述技术问题，本发明所述的一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白为将猪免疫球蛋白fc片段、猪圆环病毒2型cap蛋白与白细胞介素-29蛋白通过lingker序列连接获得的重组融合蛋白pigfc-pcv2cap-il29，包括如seq id no.2所示的氨基酸序列。
[0007]
具体的，所述的重组融合蛋白，在所述seq id no.2所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上选自如下组的标签：poly-arg、poly-his、flag、c-myc。
[0008]
具体的，所述的重组融合蛋白，其氨基酸序列为seq id no.1；在蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有pigfc-pcv2cap-il29活性的蛋白质。
[0009]
本发明还公开了一种编码所述重组融合蛋白的基因，包括如seq id no.1所示的核苷酸序列。
[0010]
本发明还公开了一种含有所述重组融合蛋白的编码基因的表达载体、细胞系或重组菌。
[0011]
本发明还公开了一种表达所述重组融合蛋白pigfc-pcv2cap-il29的重组cho细胞株。
[0012]
本发明还公开了一种构建所述重组cho细胞株的方法，包括如下步骤：（1）人工合成如seq id no.1所示的pigfc-pcv2cap-il29基因序列；（2）以hindⅲ和ecori酶切所得pigfc-pcv2cap-il29基因序列和真核质粒载体序列，回收酶切后的pigfc-pcv2cap-il29和真核质粒载体，经连接、转化、克隆pcr及测序验证，构建所需pigfc-pcv2cap
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il29表达载体；（3）将所述pigfc-pcv2cap-il29表达载体转染cho细胞株，通过培养、单克隆筛选获得高表达pigfc-pcv2cap-il29的细胞株cho-pigfc-pcv2cap-il29-88；（4）将所述cho-pigfc-pcv2cap-il29-88细胞株进行扩大培养，、驯化，能够完全悬浮无血清培养，即得。
[0013]
本发明还公开了一种预防猪圆环病毒2型病毒感染的亚单位疫苗，包括所述的重组融合蛋白pigfc-pcv2cap-il29和水性复合佐剂；所述疫苗中，控制所述重组融合蛋白pigfc-pcv2cap-il29的含量≥20μg。
[0014]
本发明所述亚单位疫苗用于对仔猪的免疫应答。
[0015]
具体的，所述的预防猪圆环病毒2型病毒感染的亚单位疫苗，控制所述重组融合蛋白pigfc-pcv2cap-il29与所述水性复合佐剂的质量比为80-90：10-20，优选为将85份融合蛋白抗原相与15份佐剂复合物相混合，低速搅拌均匀，即得到猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗。
[0016]
具体的，所述的预防猪圆环病毒2型病毒感染的亚单位疫苗，所述水性复合佐剂包含矿物油、铝胶、聚合物、皂素、cpg odn、γ-ifn、角鲨烷、vc、poly i:c、mpl-a、tween-80、
span-80、免疫刺激剂中的至少两种的混合物。
[0017]
具体的，所述的预防猪圆环病毒2型病毒感染的亚单位疫苗：所述皂素包括quila和/或qs21，控制其用量为20-400μg，优选为150μg；所述铝胶包括氢氧化铝和/或磷酸铝；所述聚合物包括聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物、卡波姆和/或泊洛沙姆；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、gm-csf和/或il-2。
[0018]
本发明所述重组融合蛋白，将猪免疫球蛋白fc片段、猪圆环病毒2型cap蛋白与具有免疫增强作用的白细胞介素-29蛋白通过lingker序列连接获得。由于igg类的免疫球蛋白是血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可高达21天，而fc片段是igg保持体内较长半衰期的主要原因，同时具有稳定蛋白的作用，本发明将该猪fc片段和pcv2 cap抗原蛋白融合，其氨基酸序列从n端到c端依次包括猪fc片段、柔性肽接头、pcv2cap抗原蛋白质和白细胞介素il-29，与现有pcv2cap相比，可有效克服在体内半衰期短且原核表达产物免疫活性低缺陷，其体内半衰期更长、免疫效果更好，只需要1次免疫且抗原免疫用量更少减少多次疫苗注射应激反应，可用于制备抗猪圆环病毒病疫苗。
[0019]
本发明所述抗猪圆环病毒病疫苗基于所述重组融合蛋白pigfc-pcv2cap-il29制得，通过构建出重组cho细胞株，经过培养、纯化、乳化工艺制备成猪圆环病毒亚单位灭活疫苗，该疫苗能够诱导机体产生显著体液免疫和细胞免疫，免疫原性良好，可以高效的引起仔猪的免疫应答，有效预防猪圆环病毒的感染。
附图说明
[0020]
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，图1为含有pigfc-pcv2cap-il29的编码基因的dna片段回收纯化结果；图2为所述获得的阳性重组菌的pcr鉴定阳性克隆结果；图3为所述重组融合蛋白动物免疫实验结果。
具体实施方式
[0021]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0022]
原始菌株以及载体：cho细胞、pcdna3.1表达载体，由本公司提供。融合基因按鼠类密码子偏好性合成，由北京梓熙生物公司合成。
[0023]
酶类及其他生化试剂：内切酶、连接酶购自takara公司，质粒提取试剂盒购自天跟生物，其它均为国产试剂。
[0024]
cho培养基：无血清培养基，cdm4cho培养基，牛血清培养培养基，购自hyclone公司。
[0025]
实施例1 pigfc-pcv2cap-il29突变体及其编码基因的获得为了提高野生型pcv2cap的长效性，将pcv2cap的蛋白质序列猪fc抗体片段融合，同时增加机体免疫应答效率，链接了il-29肽段。具体的融合蛋白质具体的蛋白质位点如表1所
示。
[0026]
表1融合蛋白质设计本实施例合成所示的pigfc-pcv2cap-il29基因，是将pcv2cap蛋白n端融合猪fc片段，c端链接il-29片段，其编码序列是seq id no.1的第22-1551位所示，编码seq id no.2所示的蛋白质pigfc-pcv2cap-il29。
[0027]
实施例2重组pigfc-pcv2cap-il29重组表达载体的构建利用nhei和xhoi双酶切pmd18
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pigfc-pcv2cap-il29载体得到seq id no.1所示的dna合成dna核酸分子，1500bp左右片段是目标片段，含有pigfc-pcv2cap-il29的编码基因的dna片段或突变编码基因的dna片段进行回收纯化，结果如图1。
[0028]
将纯化后的含有pigfc-pcv2cap-il29的编码基因的dna片段分别与nhei和xhoi双酶切真核表达载体pccnd3.1(-)酶切，合成基因于载体段连接（连接体系为0.5μl pccnd3.1(-)；4.5μl pigfc-pigscfve2酶切片段，2xt4快速连接酶，室温3小时）。连接产物转化dh5α感受态细胞，获得阳性重组菌，用pcr鉴定阳性克隆结果如图2。
[0029]
提取阳性载体nhei和xhoi双酶切验证，阳性验证正确的送去测序验证，将测序结果正确的是用seq id no.1第22-1551位所示的pigfc-pcv2cap-il29的编码基因替换pccnd3.1(-)的nhei和xhoi识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pccnd3.1(-)-pigfc-pcv2cap-il29；对测序正确菌株接种于100ml含氨苄lb培养基250ml三角瓶中，37℃条件下，220rpm摇床培养过夜，用天根无内毒试剂盒抽提载体。pvul酶切后用胶回收试剂盒回收酶切产物，回收产物准备转染哺乳细胞cho用。
[0030]
实施例3融合表达细胞cho获得的获得将上述经过pvul酶切后纯化产物，收集cho 细胞，进行融合表达，具体包括如下步骤：（1）转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上；转染时，细胞要达到90-95%的融合；（2）配制溶液1：240μl 无血清培养基+10μl lipofectamine 2000/孔（总体积250μl）（温育5min）；（3）配制溶液2：225μl无血清培养基+25μl（4μg）质粒 per well（总体积250μl）；（4）将溶液1与溶液2混合，室温下置20min；（5）与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml无血清培养
a：20mm pbs、0.15m nacl、ph7.2，电导18.128ms/cm平衡纯化柱子，用发酵液上样，buffer a淋洗平衡，随后用buffer b：4.5mm 柠檬酸钠、25mm柠檬酸ph3.0、电导1.27ms/cm洗脱。洗脱液用0.2m pb中和低ph纯化液，膜包换液到pbs中，经sds-page检测达到电泳纯。整个纯化工艺步骤衔接较好，上一步层析的洗脱液只需要稍微的调节便可作为下一步处理液，便于减少中间处理步骤，便于工业化操作和减少中间操作带来的污染。
[0036]
实施例7亚单位疫苗的制备将纯化所得的pcv2cap重组融合蛋白加入佐剂组成猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗。佐剂可以选用铝胶、卡波姆971、quila、cpg-odn、矿物油等，可选择加入细胞因子如猪α-干扰素、猪白细胞介素2等，其中，控制pigfc-pcv2cap-il29蛋白的有效成分浓度不低于25-500μg/ml，每剂量25-500μg。
[0037]
本实施例选用85重量份所述pigfc-pcv2cap-il29蛋白和15重量份的佐剂（质量比为10：1：1的卡波姆971、quila、猪α-干扰素复合佐剂）充分混合，制得所需疫苗。
[0038]
实施例8重组融合蛋白安全性实验取健康3周龄仔猪10头，分别随机分2个组，每组5头，共2组进行单剂量1次注射、单剂量2次注射，和超剂量1次注射，以接种安全性实验。
[0039]
实验期间，每天观测实验动物临床症状变化，包括精神、采食、活动、呼吸、饮水、注射部位炎症反应、排泄状况，每天体温检测，记录动物异常情况，如死亡，如果有死亡需解剖，观测病理变化，分析原因。
[0040]
经过2周和连续观测，对注射重组融合疫苗前后的临床症状进行比较，发现单剂量接种和单剂量重复接种组以及超剂量接种组，均饮食正常，精神无不良变化，呼吸及排泄未见异常，注射部位未发现发炎现象，实验期间没有遇到动物有任何不良反应，无死亡猪出现，注射后每天检测动物体温，发现个别组中猪有体温升高现象，但不超过3天，大部分猪体温维持39℃左右。我们对高剂量猪的肝脏肠道肾组织进行免疫组化，发现组织质地均匀，未见病理变化，而且，本发明中制备的疫苗蛋白即使以高剂量注射，也无明显副作用，是一种安全免疫蛋白，实施例9重组融合蛋白动物免疫实验将本发明实施制备的pigfc-pcv2cap-il29蛋白按照实施例7所述制备方法制备疫苗，使其有效抗原量为25μg/ml、50μg/、100μg/ml 3个梯度，按照兽用生物制品规程要求进行成品疫苗的检验，用合格制品进行动物试验。选择3-4周龄猪圆环病毒2型抗原及抗体双阴性猪30头雌雄各半，购自福建某猪场，分别随机分6个组，每组5头，共6组如下表3（设置试验疫苗3组25μg/ml；50μg/ml；100μg/ml；对照疫苗组1，对照疫苗组1，阴性对照组）。免疫后14天、21天、28天监测抗体，免疫后28天用pcv2 sx07株进行攻毒，攻毒剂量每头肌肉注射8ml，攻毒后4周采集血清监测病毒血症，攻毒后4周剖杀所有猪，采集淋巴结进行免疫组合检测；通过病毒血症和免疫组化检测结果分析抗原免疫效率。
[0041]
表3试验动物分组
试验结果如下表4及附图3中显示，疫苗免疫后，pcv2cap蛋白含量越低，抗体产生水平越慢，至免疫后4周，25μg剂量组仅s/p值偏低，50μg、100μg组抗体产生速率最好，二者之间差异不显著，对照疫苗组抗体产生良好，与50μg、100μg组无差异。pcv2攻毒后，病毒血症，攻毒对照组5/5阳性，对照疫苗组1和50μg组均为4/5阴性、对照疫苗组2、50μg组和100μg组均为5/5阴性；如图3所示，免疫组化检测，攻毒对照组5/5强阳性，对照疫苗组均5/5阴性，25μg组3/5阴性，50μg组4/5阴性，100μg组5/5阴性；攻毒保护试验结果显示，pcv2 cap融合蛋白制备的疫苗免疫后能够对仔猪产生抵御pcv2感染的主动免疫保护力。
[0042]
表4不同pcv2cap蛋白剂量疫苗免疫试验猪抗体监测结果
注：a，pcv2 elisa抗体阴阳性判断标准：s/p＜0.3阴性，0.3≤s/p＜0.4可疑，s/p≥0.4阳性；“+”弱阳性，“+++”强阳性。
[0043]
可见，本发明制备的重组融合蛋白制备的疫苗免疫后能够对仔猪产生抵御pcv2感染的主动免疫保护力。
[0044]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

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