枯草芽孢杆菌N-42-2在防治芒果炭疽病中的应用的制作方法

枯草芽孢杆菌n-42-2在防治芒果炭疽病中的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及拮抗微生物对植物病害的防治，具体涉及一种枯草芽孢杆菌n-42-2在防治芒果炭疽病中的应用。


背景技术：

[0002]
芒果是我国亚热带及热带一种重要的经济作物，因其香气浓郁、汁多肉嫩、甜酸可口且营养价值高，深受人们的喜爱，素有“热带果王”之誉称。芒果中富含了维生素c和胡萝卜素，还含有较高的糖分、蛋白质等，具有很高的营养价值
[2]
。芒果除了有较高的营养价值，还具有很高的利用价值。在中国，芒果主要种植在海南、云南、四川、两广一带和福建、贵州等省份。
[0003]
芒果生产为我国的水果产业带来了很大的经济效益，但芒果病害也对芒果产业造成了严重的威胁，特别是采后病害。芒果炭疽病是芒果的第一大病害，在国内外芒果主产区普遍发生，可引起贮藏期间的30％-50％的芒果腐烂。炭疽病有时可引起60％以上的病果率，使得芒果品质降低，每年造成的经济损失高达8000万元以上，对芒果产业的发展造成了很大的影响。我国的芒果炭疽病主要是由胶孢炭疽菌(colletotrichum gloeosporioides)引起。
[0004]
目前，在芒果采后病菌抑制和保鲜方面，多采用化学防治，但化学防治的成本较高，且长期使用这些化学药剂会使病原菌产生抗药性。所以亟需探索绿色、环保、高效的防治方法。因此，运用生物防治手段控制芒果采后病害，显得尤为重要。通过对芒果炭疽病菌具有抑制作用的拮抗细菌的筛选，测定其对芒果采后炭疽病的防治效果，为今后采后芒果炭疽病的生物防治提供理论依据。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一株可用于防治芒果炭疽病的枯草芽孢杆菌n-42-2,不仅该枯草芽孢杆菌n-42-2发酵液能防治芒果炭疽病，而且其挥发性气体也能在防治芒果炭疽病的应用，而且该非接触性的防治效果更好，更有利于芒果采后病害防治。
[0006]
一种枯草芽孢杆菌n-42-2，其保藏编号为cgmcc no.20670。
[0007]
上述枯草芽孢杆菌n-42-2在防治植物炭疽病中的应用。
[0008]
所述植物炭疽病为芒果炭疽病。
[0009]
所述防治为将枯草芽孢杆菌n-42-2的发酵液喷施于芒果表面，实现对果树上芒果炭疽菌菌丝的抑制作用和对采后芒果炭疽病的室内防治。
[0010]
所述发酵液的活菌数为1
×
108cfu/ml。
[0011]
所述发酵液制备方法，步骤如下：
[0012]
(1)菌株活化：将枯草芽孢杆菌n-42-2接种于na固体培养基上，于27℃下培养1-2天；
[0013]
(2)菌株发酵液的制备：将上述活化菌株接种于nb液体培养基中，于27℃下振荡培
养12-24小时，制得枯草芽孢杆菌n-42-2的发酵液。
[0014]
步骤(1)中所述na固体培养基配方为：牛肉膏3g，蛋白胨粉5g，琼脂粉18g，蒸馏水1000ml，ph 7.0-7.2；
[0015]
步骤(2)中所述nb液体培养基配方为：牛肉膏3g，蛋白胨粉5g，蒸馏水1000ml,7.0-7.2。
[0016]
所述防治为将存活的枯草芽孢杆菌n-42-2置于芒果果实的存储空间内且枯草芽孢杆菌n-42-2菌株与芒果果实不直接接触，使枯草芽孢杆菌n-42-2产生的挥发性气体对果树上的芒果炭疽菌菌丝产生抑制作用及采后芒果炭疽病的室内防治。
[0017]
所述存活的枯草芽孢杆菌n-42-2为枯草芽孢杆菌n-42-2接种于na固体培养基。
[0018]
本申请人从芒果表皮中筛选到一株枯草芽孢杆菌n-42-2，保藏编号为cgmcc no.20670。
[0019]
本发明通过试验研究发现，枯草芽孢杆菌n-42-2的发酵液在实验室条件下，其挥发性气体对芒果炭疽病病原菌菌丝的抑制率达到87.47％；浓度为1
×
108cfu/ml枯草芽孢杆菌n-42-2发酵液对离体芒果炭疽菌菌丝的抑制作用达67.21％，对采后芒果炭疽病的室内防治有很好的效果。枯草芽孢杆菌n-42-2不需要直接接触芒果，只需要将活性菌株与芒果存放在同一个空间，就可以达到芒果采后炭疽病的防治作用，即所述的枯草芽孢杆菌n-42-2对采后的芒果炭疽病进行自然熏蒸处理，能够有效的抑制芒果炭疽病的发生，其防治效果达67.57％。
[0020]
本发明的有益效果是：所述枯草芽孢杆菌n-42-2发酵液不仅能防治芒果炭疽病，而且枯草芽孢杆菌n-42-2的挥发性气体也能对芒果炭疽病进行室内防治中，而且效果更好，该挥发性气体的防治采用与枯草芽孢杆菌n-42-2发酵液不同的防治方法，比如熏蒸，菌株不需要与芒果果实直接接触，减少了枯草芽孢杆菌n-42-2发酵液或枯草芽孢杆菌n-42-2对芒果的二次污染。与现有的药剂防治相比，微生物在防治芒果采后炭疽病的应用中具绿色、无污染，无残留的特性，具有较好的效果和前景，能够作为生物农药开发的资源。
[0021]
枯草芽孢杆菌n-42-2菌株保藏信息：
[0022]
菌种分类命名：枯草芽孢杆菌bacillus subtilis。
[0023]
菌种保藏号：cgmcc no.20670。
[0024]
保藏地址：中国微生物菌种菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0025]
保藏日期：2020年9月18日
附图说明
[0026]
图1为枯草芽孢杆菌n-42-2在na平板上的菌落形态；
[0027]
图2为革兰氏染色后观察枯草芽孢杆菌n-42-2菌体形态；
[0028]
图3为平板对扣法中，枯草芽孢杆菌n-42-2挥发性气体对芒果炭疽菌菌丝生长的抑制作用；
[0029]
其中：a为炭疽菌正常菌丝形态，b为枯草芽孢杆菌n-42-2挥发性气体对芒果炭疽菌菌丝的抑制情况；
[0030]
图4为枯草芽孢杆菌n-42-2发酵液对离体芒果果实炭疽病的防治效果；
[0031]
其中：a为无菌水处理的离体芒果果实发病情况；b为枯草芽孢杆菌n-42-2发酵液
处理后的离体芒果果实发病情况；
[0032]
图5为枯草芽孢杆菌n-42-2挥发性气体对离体芒果果实炭疽病的防治效果；
[0033]
其中：a为无菌水处理的离体果实发病情况；b为枯草芽孢杆菌n-42-2挥发性气体处理的离体果实发病情况。
具体实施方式
[0034]
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0035]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036]
实施例1枯草芽孢杆菌n-42-2的分离、筛选及鉴定
[0037]
1.1细菌的分离
[0038]
取健康的芒果表皮，在超净工作台中，首先用75％酒精消毒10s，然后用浓度为2％的naclo消毒1min，最后用无菌水漂洗3次，剪成约3
×
3mm的组织块，晾干后。放置3-4个组织块在pda培养基上，置于25℃培养箱中培养3-5d。待组织块长出菌落，则挑取不同菌落形态的细菌在pda培养基上进行纯化培养并标号。
[0039]
1.2细菌的初筛
[0040]
初筛：采用平板对峙法，以一株芒果炭疽菌作为指示菌在pda平板上对1.1中分离纯化得到的细菌菌株进行筛选，将具有拮抗作用的菌株保存备用。
[0041]
复筛：采用平板对扣法对初筛中效果较好的细菌进行筛选，将具有拮抗作用的菌株保存备用。
[0042]
其中，菌株n-42-2对芒果炭疽菌菌丝具有较好的抑制效果，因此可将其进行下一步的防效试验。
[0043]
1.3细菌的鉴定
[0044]
采用形态学、生理生化鉴定和分子生物学分析对菌株n-42-2的种类进行了鉴定，结果表明，菌株n-42-2在na培养基上菌体呈乳白色，质地粘稠，单菌落为圆形或椭圆形，边缘不规则。革兰氏染色显示阳性，在显微镜下观察到菌体呈杆状。生理生化测定结果表明，该菌株在甲基红试验中呈阳性，在v-p试验中结果呈阳性，可以在葡萄糖培养基中进行氧化发酵，能够利用淀粉并将其水解，还具明胶液化明显呈阳性的特征，不能产生硫化氢，能够利用果糖、葡萄糖、甘露醇、半乳糖、蔗糖等多种碳源。根据形态学观察、生理生化测定，结合16s rdna和grya基因进行分子系统发育分析，菌株n-42-2被鉴定为枯草芽孢杆菌bacillus subtilis。见图1所示。保藏编号：cgmcc no.20670。
[0045]
1.4枯草芽孢杆菌n-42-2发酵液制备
[0046]
将枯草芽孢杆菌n-42-2在na固体培养基上划线培养，于27℃下培养1-2天；挑取n-42-2单菌落接种于nb液体培养基中，于27℃下振荡培养12-24小时，制得枯草芽孢杆菌的发酵液，将浓度调至108cfu/ml备用。
[0047]
实施例2枯草芽孢杆菌n-42-2产生的挥发性气体对芒果炭疽菌菌丝的影响
[0048]
采用对扣法，在na平板的中央放至直径为5mm的无菌滤纸片，滴加50μl的n-42-2发酵液；用直径为5mm的打孔器在培养5-7d的芒果炭疽菌colletotrichum fructicola菌落边
缘打取菌饼，将菌饼接种在pda平板中央。将接种芒果炭疽菌的pda平板与接种细菌发酵液的na平板对扣，密封。以不接种细菌发酵液的na平板作为对照，每个处理设3个重复，27℃恒温培养。对照的菌落长满平板时，用十字交叉法对病原菌菌落直径进行测量，计算平均值和抑菌率。抑菌率＝(1-处理组菌落直径/对照组菌落直径)
×
100％。结果表明，枯草芽孢杆菌n-42-2的在平板中产生的挥发性气体对芒果炭疽菌具有抑制作用，抑菌率为87.47％。见图3所示。
[0049]
实施例3拮抗细菌发酵液对芒果炭疽病的防效实验
[0050]
选择表面无创伤、生理成熟度和大小尽可能均匀的芒果果实。分别用75％乙醇表面消毒10s，1％naclo表面消毒1min，用无菌水冲洗3次，风干。将果实表面进行刺伤，接种20μl的n-42-2发酵液(108cfu/ml)，晾干10-30分钟。然后接种20μl浓度为106个/ml的炭疽菌(colletotrichum fructicola)真菌孢子悬浮液。放在无菌的保鲜盒中，置于25℃的条件下培养7天后观察发病情，并测量病斑直径，每个处理由5个果实组成，每个处理三个重复。
[0051]
通过研究细菌发酵液对芒果果实的防治效果，从发病率进行分析，ck组全部发病，发病率为100％；经浓度108cfu/ml的细菌发酵液处理的芒果发病率仅有33.33％。在细菌发酵液对芒果果实的防治效果中，枯草芽孢杆菌n-42-2在108cfu/ml浓度处理中防治效果达67.21％。见图4所示。
[0052]
实施例4拮抗细菌挥发性物质对芒果炭疽病的防效实验
[0053]
选取新鲜采摘、健康且大小和成熟度接近的芒果，表面消毒处理：经75％酒精处理10s，1％naclo消毒1min，无菌水洗3次，风干。每一个水表面用针刺伤6个小孔，形成直径约5mm的圆环，在刺伤处接种20μl的芒果炭疽菌colletotrichum fructicola分生孢子菌悬浮液(106个/ml)。将5个接种的果实放置在6.5l的容器中，每5个为一组，10个拮抗病原菌各一组，设置三个重复。提前将20ml n-42-2发酵液(1
×
108cfu/ml)接种于na培养基上，27℃培养24h，将6个培养物置于容器中，与芒果无直接接触。对照组用相同体积的无菌水代替拮抗物培养。25℃培养7天后，十字交叉法测定病斑直径，对比室内防治效果，防治效果＝100
×
(对照组芒果的病斑直径-处理组病斑直径)/(对照组病斑直径)。
[0054]
在细菌产挥发性物质对离体芒果炭疽病的试验中，经菌株n-42-2处理后的芒果炭疽病平均病斑直径只有0.60cm，防治效果为67.57％。见图5所示。

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