一种Msi1在制备用于治疗胃癌制剂及预测化疗药物耐受中的应用的制作方法

一种msi1在制备用于治疗胃癌制剂及预测化疗药物耐受中的应用
技术领域
[0001]
本发明属于医药领域，具体涉及一种msi1在制备用于治疗胃癌制剂及预测化疗药物耐受中的应用。


背景技术：

[0002]
已知msi1蛋白在恶性肿瘤细胞中表达异常，并且在介导肿瘤细胞的增殖，引起胃癌细胞对化疗耐受中具有重要的意义。但利用传统的体外细胞成瘤模型研究msil蛋白在胃癌中的作用，由于细胞系通常已经丢失了来源肿瘤组织的分子特征及肿瘤异质性,这将导致其对临床药物疗效的预测效果大打折扣。而pdtx裸鼠模型能够很好弥补这一缺陷，可以更为准确预测肿瘤药物疗效。
[0003]
胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症死亡的第二原因。化疗是转移性胃癌的主要治疗手段,但是进展期胃癌患者的中位生存时间仍较短(约8-11个月)。近年来，靶向治疗在包括乳腺癌、结直肠癌、肺癌等肿瘤中取得了不错的研究结果，并且已经相应获批投入临床使用，然而在胃癌方面的进展却较小。因此,寻找更为有效的用药策略尤其是通过靶向药物治疗是胃癌的重要的研究方向。
[0004]
为了更深入地研究肿瘤发展以及寻找更好的药物治疗方法,建立合适的肿瘤的模型特别是动物模型将具有非常重要的价值。传统的体外细胞成瘤模型被用作肿瘤的研究以及新药的评估已有一段时间。但是经过长期的体外培养和连续传代,导致了细胞株已经适应了培养基的环境，因而缺乏肿瘤微环境,如非肿瘤基质细胞、细胞外基质等，通常已经丢失了来源肿瘤组织的分子特征及肿瘤异质性,这将导致其对临床药物疗效的预测效果大打折扣。相比较体外细胞成瘤模型,人组织来源的肿瘤裸鼠移植瘤模型(patient derived tumor xenograft,pdtx)能很好的保留病人肿瘤组织的微环境和以及组织病理学等基本特性,为研究肿瘤提供了一个很好的体内模型。目前已经建立了大量的人肿瘤组织来源的裸鼠移植瘤模型，包括：乳腺癌，肺癌，结直肠癌等，pdtx模型作为进行药物评价的有效工具，已逐渐成为研究肿瘤生物学的金标准。
[0005]
msi1作为musashi家族的一员，除在哺乳动物的胚胎和成体神经干细胞中强表达外，于胃黏膜、肠、乳腺、表皮及毛囊中的上皮祖细胞亦有表达。msi1由362个氨基酸组成，基因定位于染色体12q24.1～31，蛋白分子量为39kd，首先在果蝇中得到鉴定。据报道，胃癌前病变(肠上皮化生和不典型增生)及腺癌msi1表达均升高。在肠上皮化生胃组织和肠型胃癌中表达率分别为85％和81％，并且发现msi1表达与tnm分期有关，晚期胃癌msi1表达水平较高，因此可能可以作为一个潜在的治疗靶标。


技术实现要素：

[0006]
解决的技术问题：针对上述现有的体外细胞成瘤模型通常已经丢失了来源肿瘤组织的分子特征及肿瘤异质性，导致其对临床药物疗效的预测效果大打折扣等技术问题，本
发明目的之一为提供一种msi1在制备用于治疗胃癌制剂及预测化疗药物耐受中的应用。msi1蛋白在恶性胃癌细胞中表达异常，并且在介导肿瘤细胞的增殖，引起胃癌细胞对化疗耐受中具有重要的意义，但其影响胃癌的进程的具体机制暂不明确，本发明旨在通过建立胃癌pdtx模型，评估胃癌患者瘤组织内msi1基因拷贝数及蛋白表达情况与临床化疗药物预后的关系，指导胃癌患者的个体化治疗。
[0007]
技术方案：
[0008]
一种msi1在制备用于治疗胃癌制剂及预测化疗药物耐受中的应用，通先通过体外细胞系结合体内建立胃癌细胞的pdtx裸鼠模型，再通过干扰和过表达msi1蛋白来确定msi1蛋白在治疗胃癌制剂发展中的作用。
[0009]
进一步的，所述胃癌细胞选用的是mkn45、hgc27细胞，pdtx裸鼠模型源自外科手术取下胃癌肿瘤组织移植到免疫缺陷的小鼠体内。
[0010]
进一步的，所述msi1蛋白在恶性肿瘤细胞中表达异常，并且在介导肿瘤细胞的增殖，引起胃癌细胞对化疗耐受；在过表达msi1后两种胃癌细胞的抗凋亡能力、增殖能力、迁移和侵袭能力均增强，而干扰msi1后两种胃癌细胞的抗凋亡能力、增殖能力、迁移和侵袭能力均被抑制，含有msi1的用于治疗胃癌制剂有效抑制肿瘤细胞的发展。
[0011]
进一步的，所述msi1在制备用于治疗胃癌制剂及预测化疗药物耐受中的应用，步骤为：
[0012]
第一步，胃癌细胞凋亡能力的检测：收集转染了过表达msi1、干扰msi1质粒的胃癌细胞，并用预冷的pbs清洗一遍；计数5x105个细胞，重悬于100ul的pbs缓冲液；于上述pbs缓冲液中加入5ul的annexin v和5ul的7-aad，室温避光孵育15min；加入400ul的荧光sa-flous溶液，置冰上避光保存，1h内上机检测；结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如pi有抗染性，坏死细胞则不能；细胞膜有损伤的细胞的dna被pi着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生；因此，在细胞凋亡的早期pi不会着染而没有红色荧光信号；正常活细胞与此相似；过表达msi1后两种胃癌细胞的凋亡数量明显下调，而干扰msi1后两种胃癌细胞的凋亡比例明显上调；
[0013]
第二步，胃癌细胞增殖能力检测：将转染过表达msi1、干扰msi1质粒的胃癌细胞48h后种植在96孔板，每组做三个复孔，每孔培养基为100μl，细胞数为5000个；种植后24小时，每孔加入20μl mtt，37℃、5％co2，饱和湿度条件下培养4h；吸去培养基，加入150μldmso，避光置于摇床上5r/min、振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪a570nm处双波长测得od值；od值在0.8-1.2，od越大说明细胞数量越多可以反映细胞的增殖能力较好，过表达msi1后两种胃癌细胞的od值明显高于其他组，说明增殖能力明显变强；干扰msi1后两种胃癌细胞的增殖能力收到抑制；
[0014]
第三步，胃癌细胞迁移和侵袭能力的检测：提前一天将基质胶铺在tanswell小室内，放置37℃培养箱内待用；收集转染过表达msi1、干扰msi1质粒的胃癌细胞，并于pbs缓冲溶液中调整细胞浓度为105个/ml，接种100ul细胞悬液于transwell上层小室内；下层放置含10％fbs胎牛血清的完全培养基；24h后取出小室并用pbs清洗两遍，加入4％甲醛溶液室温固定20分钟；pbs清洗3遍，对tranwell小室的下层膜结晶紫染色5分钟；pbs清洗3遍，晾干后显微拍照；通过计算吸附在膜下层的细胞数量即穿过膜的细胞数量来反应细胞迁移和侵袭能力，细胞数量越多细胞迁移和侵袭能力越强，反之，细胞迁移和迁移能力弱，过表达
msi1后穿过transwell膜的胃癌细胞数量明显多于其他组，说明迁移和侵袭能力明显变强；干扰msi1后穿过transwell膜的胃癌细胞数量明显低于其他组，说明迁移和侵袭能力受到抑制；
[0015]
第四步：体外细胞实验表明，干扰msi1制备用于治疗胃癌制剂可以有效抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移以及促进凋亡，从而阻止胃癌细胞的进一步生长，在制备用于治疗胃癌制剂的发展进程中发挥着重要的作用；
[0016]
第五步，建立了胃癌的pdtx模型用来评价抑制msi1在制备用于治疗胃癌制剂中的作用：获取病人胃癌标本前，告知病人获得同意后签署知情同意书，通过外科手术取下癌症患者的肿瘤组织，然后将组织块剪切成2-4mm的碎块，原位移植的方法，将剪切碎的肿瘤组织移植到免疫缺陷的小鼠体内，待受体鼠体内的肿瘤长到1000-1500mm3后进行传代；第一代命名为f0，而随后的几代分别连续编号如f1，f2；在每次进行传代操作的时候取一小块肿瘤组织进行组织学的检测，如he染色，与从病人体内取出的原代肿瘤的分子和表现进行比较，第3-7代的的胃癌pdtx模型被用于药物评价实验；当移植瘤的瘤体长至100-200mm3,将动物随机分组，每组5-6只，按照组别分别给予
①
：5-氟尿嘧啶(50mg/kg/day)，灌胃；
②
：顺铂(6.25mg/kg/day)，灌胃；
③
：顺铂(6.25mg/kg/day)联合氟尿嘧啶(50mg/kg/day)，灌胃；
④
:msi1抑制剂(50mg/kg/day)，腹腔注射；
⑤
：msi1抑制剂(50mg/kg/day)+顺铂(6.25mg/kg/day)；
⑥
：msi1抑制剂(50mg/kg/day)+5-氟尿嘧啶(50mg/kg/day)，治疗4周；小鼠的体重及肿瘤体积每3-5天测量一次；体积计算方法为：肿瘤体积＝(长径
×
短径2)/2；评估给药组与对照组的相对肿瘤抑制率，相对肿瘤抑制率(relative tumor growth inhibition,tgi)计算方法为:tgi＝1-t/c,t/c代表给药组的瘤体体积/对照组的瘤体体积；当肿瘤药物处理后体积减小并小于初始体积时,利用肿瘤消退率来评估，regression％＝100
×
(to-ti)/to,to代表治疗前的体积，ti代表治疗结束时的体积；干扰msi1联合使用化疗药物可以显著抑制肿瘤的生长，尤其是msi1抑制联合5-氟尿嘧啶给药效果最为显著；
[0017]
第六步：干扰msi1可以有效抑制胃癌细胞的增殖，迁移和侵袭，促进细胞凋亡，促进化疗药物的敏感，制备用于治疗胃癌制剂。
[0018]
进一步的，所述用于治疗胃癌制剂为msi1抑制剂、5-氟尿嘧啶、顺铂中的一种或几种组合物。
[0019]
有益效果：
[0020]
1、本发明旨在通过建立胃癌pdtx模型，评估胃癌患者瘤组织内msi1基因拷贝数及蛋白表达情况与临床化疗药物预后的关系，指导胃癌患者的个体化治疗。
[0021]
2、通过建立胃癌pdtx模型确定msi1蛋白在胃癌化疗中的作用，并为胃癌提供有效的治疗靶标。
[0022]
3、msi1蛋白在恶性肿瘤细胞中表达异常，并且在介导肿瘤细胞的增殖，引起胃癌细胞对化疗耐受；在mkn45、hgc27胃癌细胞中设计了一系列的实验来验证msi1在胃癌细胞的中的作用，发现在过表达msi1后两种胃癌细胞的抗凋亡能力、增殖能力、迁移和侵袭能力均增强，而干扰msi1后两种胃癌细胞的抗凋亡能力、增殖能力、迁移和侵袭能力均被抑制，从而有效抑制肿瘤细胞的发展。
[0023]
4、msi1基于pdtx模型在胃癌化疗耐受中的作用，利用来自患者的胃癌组织建立的pdtx体外模型，可以有效的模拟胃癌患者的体内环境，获得更接近患者本体的实验结果。结
合pdtx等一系列的体内外实验，本发明表明干扰msi1可以有效抑制胃癌细胞的增殖，迁移和侵袭，促进细胞凋亡，促进化疗药物的敏感，为胃癌的化疗及药物研究提供了新的思路。因此本专利的研究结果将为胃癌的化疗及药物研究提供新的思路，将在促进人类的健康事业方面发挥重要的作用。
[0024]
5、本发明建立了胃癌的pdtx模型，可有效模拟胃癌患者的体内环境，设计了msi1干扰联合化疗药物在胃癌治疗中效果的系列实验研究，阐述了在胃癌治疗过程中，敲减msi1对抑制胃癌进程有明显的促进作用，达到有效治疗的目的。
[0025]
6、本发明建立了胃癌的pdtx模型，可有效模拟胃癌患者的体内环境。之后建立了msi1的敲减和过表达细胞模型，设计了一系列的体内外实验。验证了msi1在胃癌进展及化疗中效果，确定干扰msi1后，可增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，抑制胃癌细胞的增殖和转移，为胃癌的化疗及药物研究提供了新的思路。
附图说明
[0026]
图1为本申请调节msi1后胃癌细胞凋亡情况图。
[0027]
图2为本申请调节msi1后胃癌细胞增殖情况图。
[0028]
图3为本申请调节msi1后胃癌细胞迁移和侵袭情况图。
[0029]
图4为本申请pdtx模型小鼠肿瘤生长情况图，其中图a为pdtx模型小鼠肿瘤成瘤体积图；图b为pdtx模型小鼠肿瘤体积生长曲线图；图c为pdtx模型小鼠肿瘤抑制率图。
具体实施方式
[0030]
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
[0031]
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0032]
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0033]
实施例1
[0034]
一种msi1在制备用于治疗胃癌制剂及预测化疗药物耐受中的应用，通过体外细胞系结合体内建立胃癌的pdtx裸鼠模型，通过干扰和过表达msi1蛋白来确定msi1蛋白在治疗胃癌制剂发展中的作用。
[0035]
通过建立胃癌pdtx模型确定msi1蛋白在胃癌化疗中的作用，并为胃癌提供有效的治疗靶标。所述msi1蛋白在恶性肿瘤细胞中表达异常，并且在介导肿瘤细胞的增殖，引起胃癌细胞对化疗耐受；在过表达msi1后两种胃癌细胞的抗凋亡能力、增殖能力、迁移和侵袭能力均增强，而干扰msi1后两种胃癌细胞的抗凋亡能力、增殖能力、迁移和侵袭能力均被抑制，含有msi1的用于治疗胃癌制剂有效抑制肿瘤细胞的发展。
[0036]
本发明采用的一个技术方案是：先通过体外细胞系结合体内建立胃癌细胞的pdtx裸鼠模型，再通过干扰和过表达msi1蛋白来确定msi1蛋白在治疗胃癌制剂发展中的作用。
[0037]
其中胃癌细胞选用的是mkn45、hgc27细胞，pdtx裸鼠模型源自外科手术取下胃癌肿瘤组织移植到免疫缺陷的小鼠体内。
[0038]
msi1蛋白在恶性肿瘤细胞中表达异常，并且在介导肿瘤细胞的增殖，引起胃癌细
胞对化疗耐受；在过表达msi1后两种胃癌细胞的抗凋亡能力、增殖能力、迁移和侵袭能力均增强，而干扰msi1后两种胃癌细胞的抗凋亡能力、增殖能力、迁移和侵袭能力均被抑制，含有msi1的用于治疗胃癌制剂有效抑制肿瘤细胞的发展。
[0039]
胃癌细胞凋亡能力的检测如下：收集转染了过表达msi1、干扰msi1质粒的胃癌细胞，并用预冷的pbs清洗一遍；计数5x105个细胞，重悬于100ul的pbs缓冲液；于上述pbs缓冲液中加入5ul的annexin v和5ul的7-aad，室温避光孵育15min；加入400ul的荧光(sa-flous)溶液，置冰上避光保存，1h内上机检测；结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如pi有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的dna可被pi着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期pi不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(fitc-/pi-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(fitc+/pi+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(fitc+/pi-)。所得实验结果如图1。可以明显看出过表达msi1后两种胃癌细胞的凋亡数量明显下调，而干扰msi1后两种胃癌细胞的凋亡比例明显上调。
[0040]
胃癌细胞增殖能力检测如下：将转染过表达msi1、干扰msi1质粒的胃癌细胞48h后种植在96孔板，每组做三个复孔，每孔培养基为100μl，细胞数为5000个；根据种植后24小时，每孔加入20μl mtt，37℃，5％co2，饱和湿度条件下培养4h；吸去培养基，加入150μldmso，避光置于摇床上5r/min振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪a570nm处双波长测的od值。od值一般在0.8-1.2左右，od越大说明细胞数量越多可以反映细胞的增殖能力较好，结果如图2，可以明显看出过表达msi1后两种胃癌细胞的od值明显高于其他组，说明增殖能力明显变强；干扰msi1后两种胃癌细胞的增殖能力收到抑制。
[0041]
胃癌细胞迁移和侵袭能力的检测如下：提前一天将基质胶铺在tanswell小室内，放置37℃培养箱内待用(检测迁移则无此步骤)；收集转染过表达msi1、干扰msi1质粒的胃癌细胞，并于pbs缓冲溶液中调整细胞浓度为105个/ml，接种100ul细胞悬液于transwell上层小室内；下层放置含10％fbs(胎牛血清)的完全培养基；24h后取出小室并用pbs清洗两遍，加入4％甲醛溶液室温固定20分钟；pbs清洗3遍，对tranwell小室的下层膜结晶紫染色5分钟；pbs清洗3遍，晾干后显微拍照。通过计算吸附在膜下层的细胞数量(即穿过膜的细胞数量)来反应细胞迁移和侵袭能力，细胞数量越多细胞迁移和侵袭能力越强，反之，细胞迁移和迁移能力弱，具体结果见图3。可以看出，过表达msi1后穿过transwell膜的胃癌细胞数量明显多于其他组，说明迁移和侵袭能力明显变强；干扰msi1后穿过transwell膜的胃癌细胞数量明显低于其他组，说明迁移和侵袭能力受到抑制。
[0042]
上述体外细胞实验表明，干扰msi1可以有效抑制胃癌细胞的增殖，侵袭和迁移以及促进凋亡，从而阻止胃癌细胞的进一步生长，在胃癌的发展进程中发挥着重要的作用。
[0043]
为了进一步验证msi1在胃癌发展进程中的作用，我们建立了胃癌的pdtx模型用来评价抑制msi1在胃癌化疗中的作用，具体如下：获取病人胃癌标本前，告知病人获得同意后签署知情同意书。通过外科手术取下癌症患者的肿瘤组织，然后将组织块剪切成2-4mm的碎块，原位移植的方法，将剪切碎的肿瘤组织移植到免疫缺陷的小鼠体内，待受体鼠体内的肿瘤长到1000-1500mm3后进行传代。通常第一代命名为f0，而随后的几代分别连续编号(f1，f2...)。在每次进行传代操作的时候取一小块肿瘤组织进行组织学的检测，如he染色等，与从病人体内取出的原代肿瘤的分子和表现进行比较。第3-7代的的胃癌pdtx模型被用于药
物评价实验。当移植瘤的瘤体长至100-200mm3,将动物随机分组(每组5-6只)，按照组别分别给予
①
：5-氟尿嘧啶(50mg/kg/day)，灌胃；
②
：顺铂(6.25mg/kg/day)，灌胃；
③
：顺铂(6.25mg/kg/day)联合氟尿嘧啶(50mg/kg/day)，灌胃；
④
:msi1抑制剂(50mg/kg/day)，腹腔注射；
⑤
：msi1抑制剂(50mg/kg/day)+顺铂(6.25mg/kg/day)；
⑥
：msi1抑制剂(50mg/kg/day)+5-氟尿嘧啶(50mg/kg/day)，治疗4周。小鼠的体重及肿瘤体积每3-5天测量一次。体积计算方法为：肿瘤体积＝(长径
×
短径2)/2。评估给药组与对照组的相对肿瘤抑制率，相对肿瘤抑制率(relative tumor growth inhibition,tgi)计算方法为:tgi＝1-t/c,t/c代表给药组的瘤体体积/对照组的瘤体体积。当肿瘤药物处理后体积减小并小于初始体积时,利用肿瘤消退率来评估，regression％＝100
×
(to-ti)/to,to代表治疗前的体积，ti代表治疗结束时的体积。结果如图4所示，n＝3。可以看出，干扰msi1联合使用化疗药物可以显著抑制肿瘤的生长，尤其是msi1抑制联合5-氟尿嘧啶给药效果最为显著。
[0044]
本申请msi1基于pdtx模型在胃癌化疗耐受中的作用，利用来自患者的胃癌组织建立的pdtx体外模型，可以有效的模拟胃癌患者的体内环境，获得更接近患者本体的实验结果。结合pdtx等一系列的体内外实验，本发明表明干扰msi1可以有效抑制胃癌细胞的增殖，迁移和侵袭，促进细胞凋亡，促进化疗药物的敏感，为胃癌的化疗及药物研究提供了新的思路。因此本专利的研究结果将为胃癌的化疗及药物研究提供新的思路，将在促进人类的健康事业方面发挥重要的作用。所述用于治疗胃癌制剂为msi1抑制剂、5-氟尿嘧啶、顺铂中的一种或几种组合物。

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