一种精原干细胞的体外培养液的制作方法

[0001]
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种精原干细胞的体外培养液。


背景技术：

[0002]
精原干细胞(spermatogonial stem cells, sscs)是哺乳动物体内唯一可将遗传信息传递给子代的二倍体体细胞,对于其体外增殖及其诱导分化的研究不仅可为哺乳动物遗传信息的保存提供技术支持,也可为哺乳动物精子发生的研究提供重要的理论依据。体外建立快速、有效的培养方法以获得满足临床治疗应用的精原干细胞，是进行精原干细胞移植有待解决的主要问题。


技术实现要素：

[0003]
为解决上述问题，本发明提供了一种精原干细胞的体外培养液，可以实现精原干细胞的稳定和高效增殖。
[0004]
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种精原干细胞的体外培养液，由基础培养液、睾丸组织液、肉苁蓉甙、卡琪花蒂玛黄酮、维甲酸（ra）、表皮生长因子（egf）组成，所述基础培养液以含l-谷氨酰胺的高糖dmem/f12细胞培养基为基础，在其中加入10%体积的胎牛血清和5%体积的双抗。
[0005]
优选地，基础培养液占总培养液体积的70%，表皮生长因子（egf）的添加量为20～40 ng/ml、维甲酸（ra）的添加量为2～7μg/l、肉苁蓉甙的添加量为100～200mg/l，卡琪花蒂玛黄酮的添加量为50～100mg/l，余量为睾丸组织液。
[0006]
优选地，基础培养液占总培养液体积的70%，表皮生长因子（egf）的添加量为20～30 ng/ml、维甲酸（ra）的添加量为2～6μg/l、肉苁蓉甙的添加量为120～180mg/l，卡琪花蒂玛黄酮的添加量为50～80mg/l，余量为睾丸组织液。
[0007]
优选地，基础培养液占总培养液体积的70%，表皮生长因子（egf）的添加量为20～25 ng/ml、维甲酸（ra）的添加量为2～5μg/l、肉苁蓉甙的添加量为140～160mg/l，卡琪花蒂玛黄酮的添加量为60～70mg/l，余量为睾丸组织液。
[0008]
本发明发现肉苁蓉甙、卡琪花蒂玛黄酮可以应用于促进精原干细胞增殖，进而为精原干细胞的培养提供了一种新的培养液，可以实现精原干细胞的稳定和高效增殖。
具体实施方式
[0009]
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0010]
实施例1一种精原干细胞的体外培养液，由基础培养液、睾丸组织液、肉苁蓉甙、卡琪花蒂玛黄
酮、维甲酸（ra）、表皮生长因子（egf）组成，基础培养液占总培养液体积的70%，表皮生长因子（egf）的添加量为20～40 ng/ml、维甲酸（ra）的添加量为2～7μg/l、肉苁蓉甙的添加量为100～200mg/l，卡琪花蒂玛黄酮的添加量为50～100mg/l，余量为睾丸组织液；所述基础培养液以含l-谷氨酰胺的高糖dmem/f12细胞培养基为基础，在其中加入10%体积的胎牛血清和5%体积的双抗。
[0011]
实施例2一种精原干细胞的体外培养液，由基础培养液、睾丸组织液、肉苁蓉甙、卡琪花蒂玛黄酮、维甲酸（ra）、表皮生长因子（egf）组成，基础培养液占总培养液体积的70%，表皮生长因子（egf）的添加量为20～30 ng/ml、维甲酸（ra）的添加量为2～6μg/l、肉苁蓉甙的添加量为120～180mg/l，卡琪花蒂玛黄酮的添加量为50～80mg/l，余量为睾丸组织液；所述基础培养液以含l-谷氨酰胺的高糖dmem/f12细胞培养基为基础，在其中加入10%体积的胎牛血清和5%体积的双抗。
[0012]
实施例3一种精原干细胞的体外培养液，由基础培养液、睾丸组织液、肉苁蓉甙、卡琪花蒂玛黄酮、维甲酸（ra）、表皮生长因子（egf）组成，基础培养液占总培养液体积的70%，表皮生长因子（egf）的添加量为20～25 ng/ml、维甲酸（ra）的添加量为2～5μg/l、肉苁蓉甙的添加量为140～160mg/l，卡琪花蒂玛黄酮的添加量为60～70mg/l，余量为睾丸组织液；所述基础培养液以含l-谷氨酰胺的高糖dmem/f12细胞培养基为基础，在其中加入10%体积的胎牛血清和5%体积的双抗。
[0013]
实施例4一种精原干细胞的体外培养液，由基础培养液、睾丸组织液、肉苁蓉甙、卡琪花蒂玛黄酮、维甲酸（ra）、表皮生长因子（egf）组成，基础培养液占总培养液体积的70%，表皮生长因子（egf）的添加量为20ng/ml、维甲酸（ra）的添加量为2μg/l、肉苁蓉甙的添加量为140mg/l，卡琪花蒂玛黄酮的添加量为60mg/l，余量为睾丸组织液；所述基础培养液以含l-谷氨酰胺的高糖dmem/f12细胞培养基为基础，在其中加入10%体积的胎牛血清和5%体积的双抗。
[0014]
实施例5一种精原干细胞的体外培养液，由基础培养液、睾丸组织液、肉苁蓉甙、卡琪花蒂玛黄酮、维甲酸（ra）、表皮生长因子（egf）组成，基础培养液占总培养液体积的70%，表皮生长因子（egf）的添加量为25 ng/ml、维甲酸（ra）的添加量为5μg/l、肉苁蓉甙的添加量为160mg/l，卡琪花蒂玛黄酮的添加量为70mg/l，余量为睾丸组织液；所述基础培养液以含l-谷氨酰胺的高糖dmem/f12细胞培养基为基础，在其中加入10%体积的胎牛血清和5%体积的双抗。
[0015]
实施例6一种精原干细胞的体外培养液，由基础培养液、睾丸组织液、肉苁蓉甙、卡琪花蒂玛黄酮、维甲酸（ra）、表皮生长因子（egf）组成，基础培养液占总培养液体积的70%，表皮生长因子（egf）的添加量为22 ng/ml、维甲酸（ra）的添加量为3μg/l、肉苁蓉甙的添加量为150mg/l，卡琪花蒂玛黄酮的添加量为65mg/l，余量为睾丸组织液；所述基础培养液以含l-谷氨酰胺的高糖dmem/f12细胞培养基为基础，在其中加入10%体积的胎牛血清和5%体积的双抗。
[0016]
对比例1由基础培养液、睾丸组织液组成，基础培养液占总培养液体积的70%，睾丸组织液占总
培养液体积的30%，其中，基础培养液以含l-谷氨酰胺的高糖dmem/f12细胞培养基为基础，在其中加入10%体积的胎牛血清和5%体积的双抗。
[0017]
对比例2由基础培养液、睾丸组织液、表皮生长因子（egf）组成，基础培养液占总培养液体积的70%，表皮生长因子（egf）的添加量为22 ng/ml，余量为睾丸组织液，其中，基础培养液以含l-谷氨酰胺的高糖dmem/f12细胞培养基为基础，在其中加入10%体积的胎牛血清和5%体积的双抗。
[0018]
对比例3由基础培养液、睾丸组织液、维甲酸（ra）、表皮生长因子（egf）组成，基础培养液占总培养液体积的70%，表皮生长因子（egf）的添加量为22 ng/ml，维甲酸（ra）的添加量为3μg/l，余量为睾丸组织液，其中，基础培养液以含l-谷氨酰胺的高糖dmem/f12细胞培养基为基础，在其中加入10%体积的胎牛血清和5%体积的双抗。
[0019]
对比例4由基础培养液、睾丸组织液、维甲酸（ra）、表皮生长因子（egf）、卡琪花蒂玛黄酮组成，基础培养液占总培养液体积的70%，表皮生长因子（egf）的添加量为22 ng/ml，维甲酸（ra）的添加量为3μg/l，卡琪花蒂玛黄酮的添加量为65mg/l，余量为睾丸组织液，其中，基础培养液以含l-谷氨酰胺的高糖dmem/f12细胞培养基为基础，在其中加入10%体积的胎牛血清和5%体积的双抗。
[0020]
对比例5由基础培养液、睾丸组织液、维甲酸（ra）、表皮生长因子（egf）、肉苁蓉甙组成，基础培养液占总培养液体积的70%，表皮生长因子（egf）的添加量为22 ng/ml，维甲酸（ra）的添加量为3μg/l，肉苁蓉甙的添加量为150mg/l，余量为睾丸组织液，其中，基础培养液以含l-谷氨酰胺的高糖dmem/f12细胞培养基为基础，在其中加入10%体积的胎牛血清和5%体积的双抗。
[0021]
实验例将实施例4、实施例5、实施例6作为实验组1、实验组2、实验组3的培养液，对比例1-5作为对照组1、对照组2、对照组3、对照组4、对照组5的培养液进行精原干细胞的培养。
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结果显示：实验组、对照组共培养7 d后,细胞生长迅速,细胞生长形态呈集落样和葡萄串样,细胞团数量增加明显,符合精原干细胞的增殖特征。
[0023]
精原干细胞活性率：实验组3＞实验组2＞实验组1＞对照组5＞对照组4＞对照组3＞对照组2＞对照组1,组间两两比较,差异均有显著性意义(p〈0.05)。
[0024]
综上所述，本发明的体外培养液可以促进精原干细胞的稳定和高效增殖。
[0025]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

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