一种检测冠状病毒的反义RNA探针及其制备方法、检测冠状病毒的试剂盒与方法与流程

一种检测冠状病毒的反义rna探针及其制备方法、检测冠状病毒的试剂盒与方法
技术领域
[0001]
本发明属于核酸杂交技术领域，具体涉及一种检测冠状病毒的反义rna探针及其制备方法、检测冠状病毒的试剂盒与方法。


背景技术：

[0002]
2019新型冠状病毒(sars-cov-2)，其潜伏期长、侵染力强，主要攻击动物体的肺部，引起肺部感染。
[0003]
目前鉴定新型冠状病毒有荧光定量pcr法和抗体检测方法，其中核酸检测方法为检验病毒方法的金标准，但是现有方法中仍存在诸多问题，诸如：
[0004]
(1)荧光定量pcr能够鉴定疑似患者体内的核酸，该方法需要提取细胞中的rna，随后进行反转录，然后进行pcr鉴定，在这些实验操作中rna的损失比较多，如果疑似患者处于感染早期或者体内本身含有病毒量比较少，很容易导致rna在提取过程中丢失，导致假阴性结果出现。
[0005]
(2)由于新型冠状病毒是rna病毒，rna病毒变异速度快，并且该变异能够不断进行累积，荧光定量pcr实验对核酸序列要求比较高，尤其是在pcr引物覆盖的区域要求比较苛刻，如果该区域核酸发生突变，导致pcr扩增效率降低甚至不能扩增出来，从而产生假阴性结果。
[0006]
(3)荧光定量pcr实验未经过测序鉴定，有可能扩增出非目的片段，出现假阳性现象，造成了检测结果的不准确。
[0007]
因此，如何提供一种可以有效检测sars-cov-2的探针，并将其应用于检测sars-cov-2中是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的是为了提高sars-cov-2冠状病毒检测的准确性和特异性，为了解决检测sars-cov-2冠状病毒的准确性不高的问题，本发明提供了一种检测冠状病毒的反义rna探针，所述反义rna探针的序列如seq id no.4所示。
[0009]
本发明还提供了上述反义rna探针的制备方法具体步骤如下：
[0010]
(1)设计引物：
[0011]
covid-19-f1序列为5'-gatcaaaacaacgtcggccc-3'；covid-19-r1序列为5'-gcgtaatacgactcactatagggttctgtctctgcggtaaggc-3'；
[0012]
(2)构建重组载体：将冠状病毒sars-cov-2待测区域碱基序列如seq id no.1所示插入到质粒pcdna3.1-myc-hisa中bamhi和xbai之间，得到重组载体pcdna3.1-myc-hisa-covid-19；
[0013]
(3)pcr扩增冠状病毒sars-cov-2待测区dna序列：以步骤(2)得到的重组载体为模板，以步骤(1)的引物，利用pcr技术扩增序列，得到冠状病毒sars-cov-2待测区dna序列；
[0014]
(4)体外转录得到反义rna探针：以步骤(3)得到的冠状病毒sars-cov-2待测区dna片段为模板进行体外转录，得到反义rna探针。
[0015]
本发明还提供了一种检测冠状病毒试剂盒，所述试剂盒包括地高辛修饰的上述反义rna探针。
[0016]
进一步地限定，所述试剂盒还包括：预杂交液、阻断溶液、ap底物染色缓冲液、mabt溶液、50％甲酰胺/2
×
ssct缓冲液、2
×
ssct缓冲液、0.2
×
ssct缓冲液、检测缓冲液、冠状病毒sars-cov-2阴性对照和冠状病毒sars-cov-2阳性对照。
[0017]
进一步地限定，所述地高辛修饰的反义rna探针的浓度为2ng/μl。
[0018]
进一步地限定，所述预杂交液包括体积比50％甲酰胺、5
×
ssct、50μg/ml肝素、5mm edta、0.05mg/ml核糖体rna、1m柠檬酸和0.1％tween；所述阻断溶液包括1％羊血清、2％阻断剂、100mm顺丁烯二酸和150mmnacl；所述ap底物染色缓冲液包括氯化硝基四氮唑蓝、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐和左旋咪唑；所述mabt溶液包括顺丁烯二酸和nacl；所述检测缓冲液包括100mm nacl、50mm mgcl2、100mm三羟甲基氨基甲烷、体积分数为0.1％的tween-20和1mm左旋咪唑。
[0019]
进一步地限定，所述冠状病毒sars-cov-2阳性对照是1
×
105个带有冠状病毒sars-cov-2的hek293细胞；所述冠状病毒sars-cov-2阴性对照是1
×
105个不携带冠状病毒sars-cov-2的hek293细胞。
[0020]
本发明还提供了一种检测冠状病毒的方法，所述方法是利用上述的检测冠状病毒的试剂盒检测冠状病毒sars-cov-2，具体步骤如下：
[0021]
1)杂交预处理：在待检测的样本中加入蛋白酶k进行孵育，然后用pbst溶液漂洗，然后用多聚甲醛固定，然后用pbst溶液漂洗；
[0022]
2)预杂交反应：将预杂交液加入到步骤1)预处理后的待检测的样本中，进行孵育；
[0023]
3)杂交反应：除去步骤2)中的预杂交液，向待检测的样本中加入含有地高辛修饰的上述的反义rna探针的预杂交液，进行孵育；
[0024]
4)杂交后处理：除去步骤3)中的预杂交液，依次用50％甲酰胺/2
×
ssct缓冲液、2
×
ssct缓冲液和0.2
×
ssct缓冲液漂洗待测样本后和阻断溶液混合，室温培养，然后加入用阻断溶液1000-4000倍稀释的抗地高辛抗体，孵育培养，得到杂交样本；
[0025]
5)显色反应：将步骤4)得到的杂交样本加入到含有终体积分数为1％的羔羊血清的mabt溶液中，清洗后再以mabt溶液清洗，然后用检测缓冲液清洗，加入ap底物染色缓冲液进行室温避光孵育，当杂交样本着色后，用pbs溶液清洗杂交样本，然后用显微镜观察和照相得到检测冠状病毒sars-cov-2的结果。
[0026]
进一步地限定，步骤2)中的孵育是68℃条件下反应45分钟-240分钟；步骤3)中的孵育是在68℃条件下反应10小时；步骤4)中的孵育是在4℃条件下反应10小时，所述室温培养的时间是45分钟-240分钟。
[0027]
进一步地限定，所述室温避光孵育的时间为30分钟-120分钟，每隔15分钟检测一次信号，直到有目标信号出现。
[0028]
有益效果：
[0029]
1.有效避免由于rna病毒快速变异导致荧光定量pcr检测产生假阴性结果越来越多的问题，提高了检测结果的准确性；
[0030]
2.最大程度的节约了制备探针的时间成本。并且通过pcr扩增得到目的基因，稳定、不易出错、产量高、快速且高效。
[0031]
3.利用原位杂交技术对待测样本检测，所需样本小无需提取细胞中的rna，避免了rna的损失，可以有效避免荧光定量pcr检测中rna损失而导致假阴性结果的问题，灵敏度高，提高了检测结果的准确性。
附图说明
[0032]
图1为重组质粒pcdna3.1-myc-hisa-covid-19酶切位点示意图；
[0033]
图2为重组质粒验证电泳图，其中，1为重组质粒pcdna3.1-myc-hisa-covid-19(6695bp)，2为酶切后的pcdna3.1-myc-hisa部分载体(5432bp)和病毒基因片段及部分载体(1263bp)，m为marker；
[0034]
图3为pcr扩增产物胶回收纯化后电泳图；其中，1为胶回收产物，m为marker；
[0035]
图4为反义rna探针的电泳图；其中，1为反义rna探针，m为marker；
[0036]
图5为反义rna探针检测结果图，其中，a图为细胞转染pcdna3.1-myc-hisa空载体质粒4小时后原位杂交结果，b图为细胞转染pcdna3.1-myc-hisa-covid-19质粒4小时后原位杂交结果。
具体实施方式
[0037]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0038]
实验材料：hek293细胞是商业化购买的人胚胎肾细胞293。
[0039]
实施例中缩写说明和相关试剂配制方法：
[0040]
hyb：预杂交液，体积比50％甲酰胺；5
×
ssct；50μg/ml肝素；5mm edta；0.05mg/ml核糖体rna；920μl1m柠檬酸；0.1％tween。
[0041]
mabt：100mm顺丁烯二酸(马来酸)，150mmnacl；150mm nacl，0.1％tween；ph至7.4。
[0042]
edta：乙二胺四乙酸。
[0043]
pbst溶液：磷酸盐吐温缓冲液，在pbs溶液基础上加上0.1％的tween-20(v/v)。
[0044]
nbt：氯化硝基四氮唑蓝。
[0045]
bcip：5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐。
[0046]
阻断溶液：1％羊血清，2％阻断剂(roche,ref:11096176001)，溶解于mabt中。
[0047]
50％甲酰胺/2
×
ssct缓冲液：50％甲酰胺，0.3m nacl，0.03m柠檬酸钠和0.1％tween20。
[0048]2×
ssct缓冲液：0.3m nacl，0.03m柠檬酸钠和0.1％tween20，溶解于dh2o中，调节ph为7.0。
[0049]5×
ssct：0.75m nacl；0.075m柠檬酸钠，溶解到dh2o，调节ph为7.0。
[0050]
0.2
×
ssct缓冲液：0.03m nacl，0.003m柠檬酸钠和0.1％tween20，溶解于ddh2o中，调节ph为7.0。
[0051]
检测缓冲液：每50ml溶液中含有100mm nacl、50mm mgcl2、100mm三羟甲基氨基甲烷、0.1％v/v tween-20和1mm左旋咪唑。
[0052]
ap底物染色缓冲液：由3.5μlnbt、3.5μlbcip、4μl左旋咪唑和水定容至1ml。
[0053]
实施例所使用的试剂或克隆载体等材料如无特殊说明，均为本领域常用试剂，可通过商业化途径购买获得；未提及的实验方法均为常规实验方法。
[0054]
实施例1.检测冠状病毒的反义rna探针的制备方法
[0055]
1.设计引物：根据冠状病毒sars-cov-2待测区域碱基序列(gene bank：mn988668.1)，sars-cov-2待测区域碱基序列如seq id no.1所示，并利用premier 5.0软件以及ncbi的blast分析设计引物，得到引物covid-19-f1和covid-19-r1；
[0056]
covid-19-f序列如seq id no.2所示，即5'-gatcaaaacaacgtcggccc-3'；
[0057]
covid-19-r1序列如seq id no.3所示，即5'-gcgtaatacgactcactatagggttctgtctctgcggtaaggc-3'；
[0058]
2.构建重组载体：质粒pcdna3.1-myc-hisa购自北京擎科生物有限公司，由生物公司合成序列两端带有bamhi和xba i两个酶切位点的冠状病毒sars-cov-2待测区域碱基序列，然后将合成的序列插入到质粒pcdna3.1-myc-hisa中bamhi和xba i之间，得到带有sars-cov-2待测区dna序列的重组质粒即重组载体pcdna3.1-myc-hisa-covid-19，载体图如图1所示。
[0059]
验证重组载体的构建情况，对上述得到的pcdna3.1-myc-hisa-covid-19进行酶切，酶切结果如图2所示，泳道1为未经酶切处理的重组质粒pcdna3.1-myc-hisa-covid-19电泳图(质粒全长6695bp)；泳道2为bamhi和xba i双酶切结果图，pcdna3.1-myc-hisa质粒片段为5432bp，酶切产物片段大小为1263bp，得到的酶切产物就是sars-cov-2待测的dna序列。
[0060]
3.pcr扩增冠状病毒sars-cov-2待测区dna序列：以步骤2得到的重组载体pcdna3.1-myc-hisa-covid-19为模板，利用步骤1所述的上游引物covid-19-f1和下游引物covid-19-r1扩增得到sars-cov-2待测区dna，pcr扩增的反应体系参见表1：
[0061]
表1 pcr扩增的反应体系
[0062]
pcdna3.1-myc-hisa-covid-191μlcovid-19-f13μlcovid-19-r13μl5
×
enhancebuffer10μl2
×
pcrmix25μlddh2o8μl总体积50μl
[0063]
pcr扩增的反应程序为：98℃5min；98℃30s、59℃30s、72℃30s，30个循环；72℃4min。
[0064]
具体步骤如下：以pcdna3.1-myc-hisa-covid-19为模板，以covid-19-f1和covid-19-r1按照上述体系和程序对其进行扩增，并将扩增产物进行2％琼脂糖电泳，参照dna marker切取位置回收纯化扩增产物，参照dna marker切取位置在凝胶产物上1054nt处的条带，即为所需目的产物条带；将切取的目的产物条带，用胶回收试剂盒进行回收，得到纯化
的pcr扩增产物，对其进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，并测量其浓度(200ng/μl)，得到dna模板。
[0065]
4.体外转录得到反义rna探针：利用步骤3得到的dna模板进行体外转录，合成带有地高辛标记的反义rna探针，所述体外转录的体系参见表2：
[0066]
表2 体外转录的体系
[0067]
10
×
buffer2μl带有地高辛标记的rntp混合物(10mm)4μlt7 rna聚合酶mix2μldna模板4μlnuclease-free water8μl总体积20μl
[0068]
体外转录的方法如下：
[0069]
1)将上述体外转录体系加入到1.5ml ep管(离心管)中，混匀后，于37℃水浴2h。
[0070]
2)水浴结束后，加入dnase消化15min，然后以琼脂糖电泳检测，结果如图4所示，由于图中使用的为dna marker，dna为双链，由于rna为单链结构，在部分u碱基中掺入地高辛标记物，所以电泳结果中rna大小仅为其大小的一半多一点。
[0071]
3)用rneasy mini kit试剂盒(rna纯化试剂盒)纯化转录成功的rna，最终得到带有地高辛标记的反义rna探针，保存于-80℃环境中，所述反义rna探针核苷酸序列如seq id no.4所示。
[0072]
实施例2.
[0073]
1.一种检测新型冠状病毒sars-cov-2的试剂盒，由带有地高辛标记的反义rna探针、预杂交液、阻断溶液、ap底物染色缓冲液、mabt溶液、50％甲酰胺/2
×
ssct缓冲液、2
×
ssct缓冲液、0.2
×
ssct缓冲液、检测缓冲液、冠状病毒sars-cov-2阴性对照和冠状病毒sars-cov-2阳性对照组成，所述地高辛修饰的反义rna探针的浓度为2ng/μl；所述预杂交液包括体积比50％甲酰胺、5
×
ssct、50μg/ml肝素、5mm edta、0.05mg/ml核糖体rna、1m柠檬酸和0.1％tween；所述阻断溶液包括1％羊血清、2％阻断剂、100mm顺丁烯二酸和150mmnacl；所述ap底物染色缓冲液包括氯化硝基四氮唑蓝、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐和左旋咪唑；所述mabt溶液包括顺丁烯二酸和nacl；所述检测缓冲液包括100mm nacl、50mm mgcl2、100mm三羟甲基氨基甲烷、体积分数为0.1％的tween-20和1mm左旋咪唑；所述冠状病毒sars-cov-2阳性对照是1
×
105个带有冠状病毒sars-cov-2的hek293细胞；所述冠状病毒sars-cov-2阴性对照是1
×
105个不携带冠状病毒sars-cov-2的hek293细胞。
[0074]
2.利用上述检测检测新型冠状病毒sars-cov-2的试剂盒检测冠状病毒sars-cov-2，具体步骤如下：
[0075]
1)杂交预处理：在待检测的样本中加入蛋白酶k进行孵育，然后用pbst溶液漂洗，然后用多聚甲醛固定，然后用pbst溶液漂洗；
[0076]
2)预杂交反应：将预杂交液加入到步骤1)预处理后的待检测的样本中，进行孵育；
[0077]
3)杂交反应：除去步骤2)中的预杂交液，向待检测的样本中加入含有地高辛修饰的上述的反义rna探针的预杂交液，进行孵育；
[0078]
4)杂交后处理：除去步骤3)中的预杂交液，依次用50％甲酰胺/2
×
ssct缓冲液、2
×
ssct缓冲液和0.2
×
ssct缓冲液漂洗待测样本后和阻断溶液混合，室温孵育，然后加入用阻断溶液1000-4000倍稀释的抗地高辛抗体，得到杂交样本；
[0079]
5)显色反应：将步骤4)得到的杂交样本加入到含有终体积分数为1％的羔羊血清的mabt溶液中，清洗后再以mabt溶液清洗，然后用检测缓冲液清，加入ap底物染色缓冲液进行室温避光孵育，当杂交样本着色后，用pbs溶液清洗杂交样本，然后用显微镜观察和照相得到检测冠状病毒sars-cov-2的结果。
[0080]
采用下述实验验证效果：
[0081]
为了展示本发明所述的反义rna探针检测新型冠状病毒sars-cov-2的方法，本实施例首先制备了携带新型冠状病毒sars-cov-2的核酸序列的待测样本，带有如seq id no.1所示的序列，然后利用上述的反义rna探针进行检测，具体方法如下：
[0082]
一、hek293细胞的复苏和传代
[0083]
1.hek293细胞的复苏：
[0084]
(1)从液氮中取出冻存的hek293细胞，放入37℃恒温水浴锅中解冻1min，并不停摇晃冻存管；
[0085]
(2)将融化的细胞悬液移入预热好的新鲜dmem完全培养液中，轻轻吹打2次；
[0086]
(3)1000rpm离心3min，弃上清；
[0087]
(4)加入5ml新鲜dmem完全培养基，并移入新的培养瓶，放入37℃，5％co2的培养箱中培养；
[0088]
(5)24小时后更换新的培养液，继续传代。
[0089]
2.hek293细胞的传代：
[0090]
(1)当细胞生长汇合度达到95％～100％时，吸去旧的培养基，加入pbs洗一次；
[0091]
(2)加入胰蛋白酶，消化30s，并吸去；
[0092]
(3)加入预热的新鲜dmem终止消化，反复吹打至其为单细胞悬液；
[0093]
(4)取培养瓶，加入3ml新鲜dmem培养基，再加入1ml细胞悬液，于37℃，5％co2的培养箱中培养。
[0094]
3.用pcdna3.1-myc-hisa-covid-19质粒转染hek293细胞。
[0095]
1)取对数生长期的hek293细胞，用胰蛋白酶消化后，加入无双抗的dmem培养基稀释细胞，并移入24孔板中，每孔1ml，培养24h后，更换新的培养基；
[0096]
2)按照lipofectamine 2000reagent试剂盒进行转染，取两支1.5ml的离心管，分别加入250μl opti-mem培养基，其中一支再加入pcdna3.1-myc-hisa-covid-19质粒(2～4μg)；另一支加入6μl lipofectamine 2000室温孵育5min；
[0097]
3)将上述两支离心管进行混合，室温孵育20min，得到质粒-脂质体混合物，再加入1ml无双抗的dmem培养基；
[0098]
4)将上述混合液滴入24孔板中，混匀，于37℃，5％co2的培养箱中培养，得到带有冠状病毒sars-cov-2的hek293细胞。
[0099]
二、检测新型冠状病毒sars-cov-2的方法
[0100]
1.杂交预处理：
[0101]
(1)将培养好的1
×
105个hek293细胞中滴加200μl蛋白酶k(10ng/μl)，于37℃孵育30min；
[0102]
(2)用depc水配制的pbst溶液漂洗3次，每次5min；
[0103]
(3)用depc水配制的4％多聚甲醛固定20min；
[0104]
(4)用depc水配制的pbst溶液漂洗3次，每次5min；
[0105]
2.预杂交：
[0106]
在1
×
105个hek293细胞中滴加200μl预杂交液置于24孔培养皿，放入68℃水浴锅中孵育45分钟-240分钟，以孵育60min验证实验效果。
[0107]
3.杂交：
[0108]
吸掉预杂交液，滴加200μl杂交液(含有2ng/ul实施例1制备的地高辛标记物的反义rna的预杂交液)，将24孔培养皿置于68℃水浴锅中孵育10小时。
[0109]
4.杂交后处理：
[0110]
(1)吸出杂交液，加入200μl 68℃预热的50％甲酰胺/2
×
ssct缓冲液中洗2次，每次30min；
[0111]
(2)68℃预热的2
×
ssct缓冲液中洗1次，30min；
[0112]
(3)68℃预热的0.2
×
ssct缓冲液中洗2次，每次30min；
[0113]
(4)吸出液体，滴加阻断溶液，室温孵育45分钟-240分钟，以孵育60min验证实验效果。
[0114]
(5)加入用阻断溶液1000-4000倍稀释的地高辛抗体(anti-digoxigenin-ap,fab fragments)，4℃孵育10小时。以抗体稀释倍数为3000倍验证实验效果。
[0115]
5.显色和照相：
[0116]
(1)加入到1％热处理羔羊血清(heat treated lamb serum)的mabt溶液中，室温洗25min；
[0117]
(2)mabt洗3次，每次25min；
[0118]
(3)检测缓冲液洗2次，每次5min；
[0119]
(4)加入200ulap底物染色缓冲液，室温孵育30-120分钟，期间每隔15分钟观察一次结果，金属箔片包裹避光，直到目标着色。
[0120]
(5)当目标着色出现后，用pbs洗2次，每次5min，以停止反应；
[0121]
(6)显微镜观察、照相。
[0122]
6.结果
[0123]
结果如图5中的a所示，为转染了pcnda3.1myc-hisa空载体质粒的对照，没有信号，只有非常弱的背景；如图5中的b所示，为细胞转染4小时后原位杂交结果，箭头指出的有颜色的均为阳性信号，颜色深说明信号深，说明rna拷贝数多；颜色浅说明信号浅，说明rna拷贝数少，即使很少的rna拷贝数也能够检测出来。无色为阴性信号。图a和图b两张图片均为40
×
放大，可见，本发明能够在单细胞水平检测冠状病毒sars-cov-2的核酸，提高了检测的灵敏度。
[0124]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

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