齐整小核菌内源小核菌胶水解酶及应用的制作方法

[0001]
本发明涉及齐整小核菌内源小核菌胶水解酶及应用，属于酶工程技术领域。


背景技术：

[0002]
小核菌胶(又称硬葡聚糖，scleroglucan)是一种非离子型的水溶性微生物胞外多糖，由β-d-1,3吡喃葡萄糖和β-d-1,6吡喃葡萄糖残基交替连接而成，平均每3个β-1,3糖苷键连接的主链单元连接1个β-1,6糖苷键的侧链。这种重复单元结构使小核菌胶分支度达0.33左右。小核菌胶除了具有大多数β-1,3葡聚糖共有的生物活性特征外，高分支化频率使其具有高水溶性特点。由于独特的化学结构和高分子量特性，小核菌胶具有良好的水溶性、假塑性、保湿性、耐盐性和粘度稳定性，广泛应用于食品、生物医药、石油化工和化妆品等行业。
[0003]
目前，小核菌胶主要以微生物发酵的方式生产。齐整小核菌sclerotium rolfsii是最主要的生产菌株，其可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖和糖蜜等进行发酵生产。针对齐整小核菌生产小核菌胶的研究主要集中在提高小核菌胶产量和产率等方面。小菌核属真菌发酵法生产的小核菌胶分子量较高，从而导致其溶解性、流动性、分散性较差，为其工业应用带来困难。小核菌胶的活性通常与粘度及分子量密切有关，分子量过大时水溶性差，分子量过低则会使小核菌胶失去生理活性。如何选择合适的降解方法对小核菌胶进行改性，获得理想的分子量，在保持活性的基础上提高其水溶性，从而扩大其工业应用是目前亟待解决的问题。
[0004]
已有研究表明，将来源于环状芽孢杆菌(bacillus circulans)、类芽孢杆菌(paenibacillus)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)和嗜碱拟诺卡氏菌(alkaliphilic nocardiopsis)的β-1,3葡聚糖酶基因bglm、pgla、exg1和bglf在大肠杆菌和毕赤酵母中的重组表达，经4个酶粗酶液处理过后对小核菌胶几乎没有水解作用。另外，小核菌胶在水中溶解会形成刚性的三重螺旋结构，侧链的葡萄糖基均匀分布于螺旋结构的外侧，通过静电力作用防止螺旋聚集，这样既可以稳定多糖结构，同时还能降低小核菌胶的胶凝能力。三重螺旋结构对热非常稳定，只有当分散在二甲亚砜(dmso)中或在ph值大于12.5时，小核菌胶才可溶解形成无规则卷曲的单链结构。小核菌胶的这种三维结构使糖苷连接键被包裹，大大影响了葡聚糖水解酶的结合和水解作用效率，前期研究发现，常规β-葡聚糖酶都不能起到水解小核菌胶从而改善其分子量的效果。因此，筛选具有小核菌胶降解能力的水解酶对于制备低分子量的小核菌胶具有重要的意义。


技术实现要素：

[0005]
本发明从保藏编号为cctcc no：m2017646的齐整小核菌wsh-g01中筛选获得了具有小核菌胶水解能力的小核菌胶水解酶及编码该酶的基因，为小分子量小核菌胶的大规模生产提供了研究基础。
[0006]
本发明的第一个目的是提供一种小核菌胶水解酶，含有seq id no.1所示的氨基
酸序列。
[0007]
本发明的第二个目的是提供编码所述小核菌胶水解酶的基因。
[0008]
在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0009]
本发明的第三个目的是提供携带所述基因的表达载体。
[0010]
在一种实施方式中，所述表达载体为ppic9k。
[0011]
本发明的第四个目的是提供表达所述小核菌胶水解酶的重组微生物细胞。
[0012]
在一种实施方式中，所述微生物为毕赤酵母。
[0013]
在一种实施方式中，所述毕赤酵母为毕赤酵母gs115。
[0014]
本发明还要求保护所述小核菌胶水解酶在制备低分子量小核菌胶方面的应用。
[0015]
本发明还提供一种水解小核菌胶的方法，是将所述小核菌胶水解酶加入至含小核菌胶的体系中，于28～30℃反应至少2h。
[0016]
本发明还提供含有所述小核菌胶水解酶的酶制剂。
[0017]
本发明还提供所述小核菌胶水解酶在食品、生物医药、石油化工和化妆品领域的应用。
[0018]
在一种实施方式中，所述应用包括但不限于制备多糖、药物或日化产品。
[0019]
有益效果：本发明从齐整小核菌中挖掘出14个潜在的β-葡聚糖酶基因，在毕赤酵母中对成功扩增的10个潜在的水解酶基因进行异源表达并进行功能验证，筛选获得了对小核菌胶具有正向水解效果的小核菌胶水解酶及其编码基因。该小核菌胶水解酶在毕赤酵母中表达的β-1,3-葡聚糖酶酶活达8.64u/ml，能够对小核菌胶进行正向水解，使数均分子量由2.748
×
107da降低至1.923
×
107da，表明在酸性条件(ph 6左右)下该酶能克服小核菌胶三维结构的束缚直接对糖苷键进行切割。
附图说明
[0020]
图1齐整小核菌wsh-g01的进化树分析；
[0021]
图2两种产酶培养基体系中的胞外酶活；
[0022]
图3差异基因go富集和kegg数据库富集；
[0023]
图4目标多糖水解酶的sds-page凝胶图；1,ppic9k；2,gme9629_g；3,gme9263_g；4,gme2879_g；5,gme10818_g；6,gme8597_g；7,gme7035_g；8,gme9860_g；9,gme3016_g；10,gme9076_g；11,gme2686_g；
[0024]
图5内源β-1,3-葡聚糖酶对小核菌胶分子量的影响；1,gme7035；2,gme2686；3,gme9076；4,gme9263；5,gme9860；6,2g/l小核菌胶。
具体实施方式
[0025]
(1)菌株与质粒
[0026]
齐整小核菌wsh-g01为发明人所在课题组筛选获得，现保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2017646，并于公开号为cn108441429b的专利中公开。
[0027]
大肠杆菌escherichia coli jm109为商业化菌株，用于重组酶表达时质粒的复制。
[0028]
毕赤酵母gs115为商业化菌株，用于重组酶的表达与发酵，
[0029]
质粒ppic9k为商业化质粒，用于毕赤酵母中蛋白的分泌表达。
[0030]
(2)培养基
[0031]
齐整小核菌种子培养基(g/l)：葡萄糖30.0，kh2po
4 1.0，nano
3 3.0，酵母粉1.0，kcl 0.5，mgso4·
7h2o 0.5，ph 4.0。
[0032]
齐整小核菌发酵培养基(g/l)：葡萄糖55.0，kh2po
4 1.0，nano
3 3.0，酵母粉0.5，kcl 0.5，mgso4·
7h2o 0.5，柠檬酸1.5，ph 4.0。
[0033]
毕赤酵母md培养基(1l)：琼脂20g，10
×
ynb溶液100ml(ynb溶液终浓度为13.4g/l)，10
×
葡萄糖溶液100ml(葡萄糖终浓度为20g/l)，500
×
生物素2ml(生物素终浓度为4
×
10-4
g/l)。
[0034]
毕赤酵母诱导表达bmgy培养基(1l)：酵母提取物10g，蛋白胨20g，k2hpo
4 3g，kh2po
4 11.8g，10
×
ynb溶液100ml(ynb溶液终浓度为13.4g/l)，500
×
生物素1ml(生物素终浓度为4
×
10-4
g/l)，甘油10ml。
[0035]
毕赤酵母诱导表达bmmy培养基(1l)：酵母提取物10g，蛋白胨20g，k2hpo
4 3g，kh2po
4 11.8g，100
×
ynb溶液100ml(ynb溶液终浓度为13.4g/l)，500
×
生物素1ml(生物素终浓度为4
×
10-4
g/l)，甲醇5ml。
[0036]
(3)主要试剂
[0037]
柱式rna快速抽提试剂盒、柱式质粒小量提取试剂盒、pcr产物回收试剂盒、t4 dna连接酶及所有限制性内切酶、卡纳抗生素、氨苄抗生素和g418硫酸盐等购于生工生物工程(上海)股份有限公司。其他化学试剂均购自上海国药集团。
[0038]
(4)检测方法
[0039]
β-葡聚糖酶粗酶液酶活的检测：量取一定发酵液，4℃、4 000r/min离心10min，收集上清液，即粗酶液。1ml反应液含粗酶液500μl、0.5％昆布多糖500μl和20mmol hac-naac缓冲液(ph 6.0)，30℃水浴30min，加入1ml dns溶液终止反应，100℃加热5min，冷却至室温，取上清测定od
540
，以灭活的酶作为对照计算酶活力。1个酶活力单位定义为在反应条件下每分钟释放1.0μmol还原糖(以葡萄糖为标准)所需要的酶量。
[0040]
齐整小核菌菌体干重和粗多糖的提取及产量测定见参考文献liu l,zang yj,xu cz,et al.a modified ctab method for isolating genome dna from fungus with abundant polysaccharose.chin biotechnol,2014,34(5):75
–
79。
[0041]
重组蛋白sds-page检测：取1ml重组蛋白发酵液，12 000r/min离心5min，去上清，加入适量蒸馏水使菌液od
600
为5.0左右，超声破碎，取30μl蛋白破碎液与10μl上样缓冲液混合，99℃加热15min。使用10％的bis-tris protein gels与mes缓冲液进行电泳，电压120v。
[0042]
实施例1齐整小核菌wsh-g01中多糖降解酶基因分析
[0043]
1、齐整小核菌培养
[0044]
挑取齐整小核菌wsh-g01的单个菌核接种于pda平板，30℃静置培养4d至长出丰富菌丝。刮取1cm2的菌丝接种于装有50ml小核菌种子培养基的250ml摇瓶中，28℃、220r/min条件下培养72h获得一级种子液。将一级种子液以5％的接种量转接至装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，30℃、220r/min条件下培养72h获得二级种子液。将二级种子液以5％的接种量接种至发酵培养基中发酵。
[0045]
2、齐整小核菌基因组提取
[0046]
将菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)活化4d，刮取新鲜菌丝转接至覆盖有玻璃纸的pda培养基，5d后刮取玻璃纸上的新鲜菌丝进行dna提取。由于齐整小核菌产生大量胞外多糖，dna提取较困难，本实验参考刘丽等改良的十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium ammonium bromide,ctab)进行dna提取。
[0047]
3、齐整小核菌基因分析
[0048]
选取步骤2提取获得的浓度范围在50
–
150μg/μl之间，od
260
/od
280
范围在1.8
–
2.0之间的dna样品进行基因组测序。利用pacbio平台进行全基因组测序，结合illumina平台测序结果进行基因组拼接，获得大小为38mb的齐整小核菌wsh-g01基因组，包括116个contigs和42个scaffolds，gc含量为46.51％。基于获得的全基因组序列，根据ncbi检索与数据处理，分析出了齐整小核菌wsh-g01与其他典型白腐菌的近源关系(图1)。
[0049]
对比典型的具有多糖降解活性的白腐菌，发现齐整小核菌wsh-g01与裂褶菌schizophyllum commune和灰盖鬼伞菌coprinopsis cinerea okayama亲缘关系较近，裂褶菌产生的胞外多糖在结构上与小核菌胶高度相似。对菌株wsh-g01葡聚糖降解酶相关基因进行功能注释后，发现其拥有与葡聚糖降解酶相关的基因200个，包括碳水化合物结合域(carbohydrate-binding modules)家族基因68个、碳水化合物酯酶(carbohydrate esterase)基因14个、糖苷水解酶(glycoside hydrolase)基因82个、糖苷转移酶(glycosyl transferase)基因30个、糖苷裂解酶(polysaccharide lyase)基因6个(表1)。结果表明齐整小核菌wsh-g01具有小核菌胶降解潜力。
[0050]
表1齐整小核菌wsh-g01多糖降解酶基因分布
[0051][0052]
实施例2齐整小核菌wsh-g01在不同产酶体系下的酶活分析
[0053]
设计表2所示的两种不同的齐整小核菌的培养体系，将按照实施例1步骤1培养的齐整小核菌wsh-g01种子液分别以5％的接种量接种至高产酶体系和低产酶体系中，在相同的环境下(30℃)培养。
[0054]
表2不同产酶培养体系
[0055][0056]
检测发酵过程β-葡聚糖酶活性发现，在保证不同培养体系中生物量相同的前提下，培养至3d时，胞外β-葡聚糖水解酶的酶活差异显著，低产酶培养体系中几乎未检测出酶活，高产培养体系中β-葡聚糖酶酶活达8.62u/ml(图2)。表明在高产酶培养体系中，菌体在以多糖为唯一碳源时易被诱导表达多糖水解酶以获得足够的能源物质。两种产酶活性具有明显差异的培养体系的设计为小核菌胶水解酶基因挖掘提供了理论依据。
[0057]
实施例3在两种产酶体系中齐整小核菌wsh-g01的转录组测序及分析
[0058]
选取实施例2培养3d时产酶差异显著的高酶活(he)与低酶活(le)样本，分别提取总rna并构建原始cdna文库。
[0059]
齐整小核菌rna提取：参照生工生物工程(上海)股份有限公司柱式rna提取试剂盒的提取方法进行提取。
[0060]
齐整小核菌cdna文库的构建：以高质量的齐整小核菌wsh-g01 rna为模板，参照takara公司的反转录试剂盒的方法进行反转录操作。
[0061]
测序并对数据进行优化，以得到的基因组为参照进行序列分析，he和le样本的比对率分别达69.28％和70.95％。通过比对he和le样本的基因表达水平差异性，最终从9 086个基因中，筛选出2 584个具有显著差异的基因(p<0.01&|log2fc|≥1)，其中显著上调表达基因1 054个，显著下调表达基因1 530个。
[0062]
应用go富集对获得的2 584个显著差异基因进行功能注释，获得go富集词条32个。由图3a可知，具有最显著富集差异的基因具有分子活性功能，富集率最高的两类基因具有分子催化功能与分子结合功能。葡聚糖水解酶通常在结构上同时具备糖苷键水解的催化活性以及底物结合活性，这两类基因的显著差异富集说明两种不同培养体系的样本中具有差异表达的小核菌胶水解酶基因。应用kegg进行分析，发现差异基因富集到kegg的pathway共130条，显著富集的有21条，其中最显著富集的代谢途径为碳水化合物代谢途径(图3b)。说明不同培养体系中齐整小核菌wsh-g01碳源代谢途径发生改变，可能是he样品中的菌丝产生了更多的小核菌胶水解酶所引起的。
[0063]
表3齐整小核菌wsh-g01中预测的内源小核菌胶水解酶基因
[0064][0065][0066]
注：fpkm,fragments per kilobase per million。
[0067]
基于齐整小核菌wsh-g01转录组测序结果，对比基因组多数据库的基因注释以及两种产酶条件下的转录组差异性分析，从转录组数据中分析得到的具有显著差异的2 584个基因中，挖掘出了14个疑似的小核菌胶糖苷水解酶基因，包括1个外切葡聚糖酶(exo-glucanase)基因和13个内切葡聚糖酶(endo-glucanase)基因(表3)。
[0068]
实施例4小核菌胶水解酶在毕赤酵母中重组表达
[0069]
提取高产酶培养体系中菌株的总rna，利用反转录酶构建cdna文库。根据预测获得的14个水解酶的cds序列，设计引物扩增14个水解酶的基因片段，成功扩增出10个基因片段(分别如sqe id no.2～11所示)。将得到的10个片段dna同源重组至毕赤酵母表达载体ppic9k，重组载体线性化后，电转化法转化毕赤酵母gs115。
[0070]
毕赤酵母的转化及转化子筛选：将含有目标多糖水解酶基因的毕赤酵母表达载体ppic9k线性化，采用电转化方式转化至毕赤酵母gs115感受态细胞中，在md平板上进行筛选，30℃培养3d。将生长良好的单菌落挑选至最高2mg/ml g418的ypd平板进行筛选，筛选抗高浓度g418的his
+
转化子，再经mut
+
型筛选后，pcr验证阳性转化子。
[0071]
挑取阳性转化子接种于装有2ml ypd培养基的试管中，30℃、220r/min培养24h，以2％接种量转接至含50ml bmgy培养基的250ml摇瓶中，30℃、220r/min培养至od
600
＝2
–
6，离心收集菌体，生理盐水洗涤两次后，全部接入至含50ml bmmy培养基的250ml摇瓶中，30℃、220r/min培养，每24h向培养基中添加甲醇至终浓度为0.5％，取样、离心，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和蛋白最佳收获时间，用sds-page及活性实验检测并鉴定重组蛋白的表达。
[0072]
结果如图4所示，共获得10个具有表达能力的重组菌株。将所有获得的胞外表达蛋白以昆布多糖为底物进行水解酶活性的测定，发现10个可溶表达的重组酶中有5个具有昆
布多糖水解活性，均为β-1,3-葡聚糖酶，根据其基因序列分别翻译获得氨基酸序列，如表4所示。
[0073]
表4潜在的内源小核菌胶水解酶对昆布多糖水解活性
[0074][0075][0076]
n.a表示未检测到酶。
[0077]
实施例5齐整小核菌内源水解酶对小核菌胶的水解
[0078]
利用实施例4制备的5个具有昆布多糖水解活性的内源葡聚糖酶对小核菌胶进行水解，具体步骤为：1ml反应液含粗酶液500μl和500μl小核菌胶，反应体系初始ph＝6，30℃水浴6h，100℃沸水浴5min灭活，以灭活酶作对照，用高效液相色谱(hpgpc)测定多糖分子量。利用shodex sb-806m hq凝胶色谱柱检测，检测条件为：示差检测器，流动相0.1mol/l nano3溶液，流速0.6ml/min，柱温40℃，进样量50μl。
[0079]
结果如图5所示。水解酶gme9860对小核菌胶水解后，小核菌胶的平均分子量有一定降低，出峰时间由10.382min推迟至11.036min，数均分子量由2.748
×
107da降低至1.923
×
107da，而其他4个水解酶(seq id no.12～15所示)对小核菌胶没有降解作用。此外，seq id no.1所示的gme9860酶水解后的小核菌胶的分散度较处理前更高，表明酶反应体系中发生了高分子量多糖的降解和部分低分子量多糖的产生，使得多糖的分子量分布变得更宽。
[0080]
实施例6齐整小核菌内源水解酶制备酶制剂
[0081]
收集实施例4表达的小核菌胶水解酶gme9860，浓缩，再将浓缩酶液与辅料和/或保护剂混合后进行喷雾干燥，即可得到小核菌胶水解酶的固体酶制剂。
[0082]
所述辅料和/或保护剂为：麦芽糊精、水溶性淀粉、蔗糖、海藻糖或山梨醇中的一种或多种的混合，其添加量为100～300g/l浓缩酶液。
[0083]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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