一种强直性脊柱炎诊断标志物及应用的制作方法

[0001]
本发明属于分子诊断技术领域，更具体的是涉及强直性脊柱炎的分子标志物，可用于强直性脊柱炎的诊断。


背景技术：

[0002]
强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，as)是一种免疫相关的炎症反应性疾病，其病变主要累及中轴骨及骶髂关节。as起病隐匿，进展缓慢，常于青年时期起病，从发病到诊断往往会延迟5-10年，疾病发展到后期可出现关节的强直、纤维化最终导致残疾，给患者个人、家庭及社会带来极大负担。
[0003]
在不同国家及地区的研究中，as发病率不同，有研究表明在欧洲、亚洲、北美洲、拉丁美洲及非洲的as平均患病率分别为23.8例/10,000人、16.7例/10,000人、31.9例/10,000人、10.2例/10,000人及7.4例/10,000人。as多发于年轻人，它的平均诊断年龄为26岁，男女的发病比例是3-4：1。疾病将导致患者生活质量下降，造成家庭及社会经济损失，因此尽早诊断和治疗对患者预后的改善十分必要。
[0004]
现今临床工作中诊断as主要依据1984年修订的纽约标准：符合放射学标准和一项以上临床标准，可诊断为强直性脊柱炎。1、临床标准：
①
腰痛、晨僵3个月以上，活动改善，休息无改善；
②
腰椎额状面和矢状面活动受限；
③
胸廓活动度低于相应年龄、性别的正常人。2、放射学标准(骶髂关节x线)双侧骶髂关节炎≥2级或单侧骶髂关节炎3～4级：
①
0级：正常；
②
i级：可疑变化；
③
ii级：轻度异常，可见局限性侵蚀、硬化，但无关节间隙的改变；
④
iii级：明显异常，为中度或进展性骶髂关节炎，伴有以下1项或1项以上改变(侵蚀、硬化、关节间隙增宽或狭窄，或部分强直)；
⑤
iv级：严重异常，完全性关节强直。遗憾的是，该标准诊断的as患者常处于疾病较晚期的阶段，患者往往已受到不可逆的损伤，同时在治疗上也错过了最佳干预的时期。因此亟需发现一种更具敏感性、特异性、简便性的生物标志物，对as患者做出及时准确的诊断。
[0005]
环状rna(circle rna，circrna)是一类封闭环状的非编码rna，其主要的生物学功能是通过与微小rna(microrna，mirna)结合，发挥“海绵”作用，此外，还可调节蛋白质结合、参与转录调控和编码蛋白多肽，参与多种疾病的发生。在已有的研究中发现circrna在疾病和正常人群间存在差异表达，并且有成为生物标志物的潜能。发明人通过微阵列芯片技术对as测序数据进行进一步挖掘和整合分析，用生物信息学方法构建circrna-mirna相互作用的生物信息调控网络，并对circrna的来源基因分别进行g0功能分析和pathway分析，寻找参与调控as的关键分子，发现了hsa_circ_0007352。


技术实现要素：

[0006]
用于强直性脊柱炎诊断的circrna标志物在制备强直性脊柱炎诊断试剂盒中的应用。
[0007]
所述的circrna标志物为seq id no：1所示的hsa_circ_0007352。
[0008]
采用荧光定量pcr技术检测样本中hsa_circ_0007352的表达水平。
[0009]
所述hsa_circ_0007352在强直性脊柱炎患者的外周血中表达量升高。
[0010]
所述的circrna标志物的引物对为针对hsa_circ_0007352的特异性引物。
[0011]
所述的针对hsa_circ_0007352的特异性引物，包括如seq id no：2所示的上游引物，如seq id no：3所示的下游引物。
[0012]
所述试剂盒还包括反转录和pcr反应所需的酶和/或试剂。
[0013]
所述试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液、dntp、mgcl2、去核酸酶水、荧光染料、探针和/或taq酶。
[0014]
样本为外周血。
[0015]
本申请的优点：本发明利用微阵列芯片技术检测外周血单个核细胞中差异表达的circrna，并证实这些circrna在强直性脊柱炎患者和正常人中存在差异表达并且可以用作潜在的强直性脊柱炎诊断标志物，这将有助于探索as的发病机理，并为其诊断提供新的方向。通过对血液生物标志物和诊断试剂盒的研制与应用，仅需要病人的血液而不需要任何其他组织，通过扩增外周血circrna的表达水平，提高检测的灵敏度，可使得as的诊断和治疗更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果的评价奠定基础。
附图说明
[0016]
图1为差异表达的circrna的火山图分析。
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图2为差异表达的circrna的层级聚类图分析。
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图3为qrt-pcr检测has_circ_0007352在as患者外周血中表达上调。
[0019]
图4为外周血中has_circ_0007352单独诊断效能。
具体实施方式
[0020]
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0021]
实施例1微阵列芯片技术分析as患者与正常人间差异表达的circrna
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1.材料
[0023]
采用病例对照研究方法，收集来自医院风湿免疫科门诊或住院的as患者为病例组，所有患者诊断均符合1984年修订的纽约标准，且排除其他自身免疫性疾病和其他炎性疾病等可能干扰因素，排除合并感染、肿瘤等疾病以及在纳入前6个月内服用过激素、免疫抑制剂或其他影响免疫功能药物的患者。收集3周期在医院体检的健康人群为对照组，对照组的实验室指标均无异常，且无糖尿病、心脑血管疾病、肿瘤及传染性疾病等病史。所有研究对象在性别、年龄构成上差异无统计学意义。
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2.实验方法
[0025]
2.1总rna提取与质量检测
[0026]
使用肝素抗凝管采集所有研究对象清晨空腹外周血4ml，提取分离人pbmcs，按照trizol公司提供的提取rna步骤提取pmbcs中总rna，经紫外线分光光度仪检测rna的纯度和浓度，样品合格后分装保存于-80℃冰箱。
[0027]
2.2微阵列芯片技术分析
[0028]
将rna质量鉴定合格的3例活动期as，3例稳定期as和3例hc的总rna送至上海康城生物公司进行circrna微阵列芯片技术测序分析。使用arraystar super rna标记试剂盒将circrna扩增并标记，再通过arraystar human circrna array v2(8x15k，arraystar)进行杂交，用agilent扫描仪g2505c扫描阵列。扫描所得图像由agilent特征提取软件(版本11.0.1.1)分析，使用r语言limma软件包执行分位数归一化和后续数据处理，以倍数变化(fold change，fc)＞1.5且p＜0.05的标准来筛选差异表达的circrnas。发现as活动期组较hc组有800个显著差异表达的circrnas，其中466种上调，334种下调；as稳定期组较hc组有1149个显著差异表达的circrnas，其中589种上调，560种下调；as活动期组较稳定期组共有233个显著差异表达的circrnas，其中145种上调，88种下调。
[0029]
实施例2 rt-pcr验证as患者外周血单个核细胞中hsa_circ_0007352相对表达量
[0030]
1.引物设计
[0031]
hsa_circ_0007352引物：
[0032]
上游引物：5
’-
ggcagaagcttcaggaactggag-3
’
[0033]
下游引物：5
’-
cgtaagcagggcagagctccac-3
’
[0034]
目标基因扩增长度：2089bp。
[0035]
2.反转录
[0036]
取性别、年龄无统计学差异的30例as活动期、30例as稳定期和30例健康人的总rna标本进行反转录。按照pimescripttm rt reagent kit(perfect real time)rr037a(takara)说明书配置反转录反应体系。首先将各试剂进行瞬离，使用移液器依次添加至去rna酶的ep管中，充分混匀，置于循环器内孵育将rna反转为cdna，反转录条件为37℃15min，85℃5sec，最后4℃保存。按照takara公司逆转录试剂盒说明书操作，取2μl的总rna用于逆转录合成cdna。
[0037]
3.rt-pcr验证hsa_circ_0007352表达量
[0038]
在q12k flex型rt-qpcr仪上进行qpcr，反应体系为：12.5μl sybr green pcr master mix，rox dyeii0.4μl，上下游引物各0.15μl，2μl cdna，ddh20补充至20μl。反应条件为：95℃30s，95℃5s，60℃34s，共40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s共1个循环反应结束后作溶解曲线，每份标本均设复孔。以目的基因的ct值减去内参基因的ct值为δct，2-δct
值表示目的基因相对分子量，以判读不同样本之间目的基因表达的差异。
[0039]
4.统计学处理
[0040]
采用统计学软件spss 24.0软件进行统计分析，定量资料采用x
±
s描述。计量资料组间差异采用秩和检验，受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，roc曲线)评价生物标志物的诊断效能，以p＜0.05为差异有统计学意义。实时定量pcr扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，扩增曲线拐点清楚，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线为单峰，表明扩增产物唯一，是特异性扩增；rt-pcr的相对定量公式：2-δct
×
100％，结果显示：hsa_circ_0007352在as患者外周血单个核细胞中表达量明显高于健康对照组，差异具有统计学意义(p＜0.001)。roc曲线分析显示hsa_circ_0007352的表达水平在as组和hc组之间差异具有统计学意义(p＜0.05)，其roc曲线下面积(area under the roc，auc)(95％ic)为
0.966(0.936-0.996)显示hsa_circ_0007352是很好的辅助诊断分子标志物，可能具有很好的临床应用价值。

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