一种人工合成的抗除草剂蛋白的制作方法

[0001]
本发明属于生物技术领域，涉及一种人工合成的抗除草剂蛋白。


背景技术：

[0002]
长久以来，农业生产上杂草危害十分严重，每年约有67％的棉田遭受杂草危害。受我国农耕方式的影响，田间杂草的防除主要依靠人工，棉花从出苗到封行前一般要除草4-5次，用工量特别大，导致目前棉花的生产成本高，且经济效益低。棉花是我国重要的经济作物之一，降低生产成本对提高农民植棉的积极性和保证棉花产量等有着非常重要的促进作用。通过培育抗除草剂的棉花品种达到提高杂草防治效率和生产简化的目的，对棉花产业意义重大。
[0003]
杂草的适应能力和生存竞争强，在与棉花营养生长上不断挤压棉花的空间，妨碍其生长。据美国农业部统计，农业中，病、虫和杂草造成的损失中，杂草排每一，占到了42％，远高于病和虫(27％和28％)所造成的损失。我国棉田杂草的危害也十分严峻，因杂草损失皮棉约25.5万吨，平均减产约15％。
[0004]
草甘膦是一类广谱除草剂，通过抑制植物芳香族氨基酸合成途径中的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)的活性，阻断芳香族氨基酸的合成，达到杀灭植物的效果。近年来，商业化具有抗草甘膦除草剂的玉米、大豆、棉花和油菜等作物的种植面积逐年增加，经济效益显著，但国内可用于商业化的抗草甘膦等除草剂的棉花尚未见报道。因此，为适应新的棉花生产竞争需求，培育具有自主权益的国内抗草甘膦棉花品种迫在眉睫。


技术实现要素：

[0005]
本发明的一个目的是提供一种植物抗除草剂蛋白。
[0006]
本发明所提供的一种蛋白，为如下(1)或(2)：
[0007]
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008]
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
[0009]
上述序列表中序列2是一种由硫氨素合成酶1(thi1)n-端转运信号肽(ts)(82个氨基酸)和具有抗除草剂蛋白epsps氨基酸特征的活性蛋白(455个氨基酸)组成的融合蛋白,共由539个氨基酸组成。其中，转运信号肽(ts)的作用是使epsps蛋白转运到叶绿体和线粒体中并在那里积累。
[0010]
为了使上述(1)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0011]
表1标签的序列
[0012]
标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhh
flag8dykddddkstrep-tag ii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl
[0013]
上述(2)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(2)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5
′
端和/或3
′
端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0014]
编码上述蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0015]
上述核酸分子是如下1)-4)中任一种的dna分子：
[0016]
1)编码区为序列表中序列1所示的dna分子；
[0017]
2)编码区为序列表中序列1自5
’
末端第253位至第1620位所示的dna分子；
[0018]
3)在严格条件下与1)或2)限定的dna序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的dna分子；
[0019]
4)与1)或2)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的dna分子。
[0020]
上述严格条件可为在6
×
ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交,然后用2
×
ssc,0.1％sds和1
×
ssc,0.1％sds各洗膜一次。
[0021]
上述dna分子是将编码抗除草剂蛋白epsps的野生型土壤农杆菌cp4菌株epsps基因进行改造后得到的优化epsps基因，改造的方法具体可为：采用植物偏好密码子，并去除会使mrna不稳定序列、polya加尾信号、和内含子剪切类似位点，同时使gc含量的提高等。
[0022]
含有上述核酸分子的重组载体(克隆载体或植物表达载体)、表达盒或重组微生物或重组转基因植物细胞系也属于本发明的保护范围。
[0023]
上述蛋白、上述核酸分子或上述重组载体、表达盒或重组微生物或重组转基因植物细胞系在在调控植物抗草甘膦中的应用也是本发明保护的范围。
[0024]
上述蛋白、上述核酸分子或上述重组载体、表达盒或重组微生物或重组转基因植物细胞系在培育抗草甘膦植物或高抗草甘膦植物中的应用也是本发明保护的范围。
[0025]
本发明另一个目的是提供一种培育草甘膦抗性提高的转基因植物的方法。
[0026]
本发明提供的方法，为如下1)或2)：
[0027]
1)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中上述蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；
[0028]
2)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中编码上述蛋白的核酸分子的表达，得到转基因植物；
[0029]
所述转基因植物的草甘膦抗性高于所述目的植物。
[0030]
上述方法中，所述提高目的植物中上述蛋白的含量和/或活性，或，提高目的植物中编码上述蛋白的核酸分子的表达，均通过将上述核酸分子导入目的植物实现。
[0031]
本发明人工合成一种植物抗除草剂基因，构建表达载体，利用农杆菌介导转化棉花，培育了一种在叶绿体中积累抗除草剂的转基因棉花。本发明采用植物偏好密码子，并去除会使mrna不稳定序列、polya加尾信号、和内含子剪切类似位点，同时使gc含量的提高，构
建了epsps的优化基因，还在该优化基因的5
’
末端融合了信号肽编码基因进而构建了融合基因ts-epsps，将这两种基因分别导入植物，并进行性能检测检测结果表明，两种基因均能提高植物中epsps蛋白的表达量，ts-epsps基因还能使epsps蛋白转运到叶绿体和线粒体中并在那里积累，进而达到提高epsps在植物体内的含量，显著提高植物的抗除草剂性，同时减轻epsps蛋白对植物细胞正常功能的干扰作用。进一步抗除草剂检测结果表明，导入融合基因ts-epsps的植株的抗除草剂比导入epsps的优化基因高，前者的高抗性为97.33％，大于后者的高抗性92.83％。因此本发明在植物抗除草剂领域将会有广阔的应用前景。
附图说明
[0032]
图1为植物表达载体pbi121-epsps的构建过程。
[0033]
图2为植物表达载体pbi121-ts-epsps的构建过程。
[0034]
图3为植物表达载体pbi121-acp1-epsps的构建过程。
[0035]
图4为转基因棉花的pcr鉴定结果。
[0036]
图5为转基因棉花的半定量rt-pcr鉴定。
具体实施方式
[0037]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0038]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039]
实施例1、epsps融合基因ts-epsps
[0040]
下述所有基因操作方法均参照《分子克隆》(sambrook j等人，1989)所述进行；所用限制性内切酶和其它工具酶均购自neb公司。
[0041]
一、epsps融合基因ts-epsps和融合基因acp1-epsps的获得
[0042]
1、epsps密码子优化改造和化学合成
[0043]
对野生型土壤农杆菌cp4菌株抗除草剂蛋白编码基因(epsps基因)序列的密码子优化策略主要包括：植物喜好密码子的应用；不稳定序列的改造；gc含量的提高等。野生型cp4菌株epsps基因的g+c含量非常低，a+t的含量很高，一方面，如果把这些序列导入植物基因组中可能会被误认为是植物基因控制序列(已知序列的a+t含量非常高)，同时在这些天然基因中会出现a+t富含区域，类似于基因启动子中的tata盒，会导致基因的异常转录；另一方面，在转录的mrna中聚腺苷酸化信号序列(aauaaa)、mrna的剪接相关的小rna互补序列会导致rna不稳定。因此在设计epsps基因人工改造序列时的一个主要目标是提高g+c的含量。另一个目标是对整个序列进行修饰，改变dna和转录成mrna中出现的不稳定结构，从而保证蛋白的翻译。另外，本发明改造基因的另一个重要内容是棉花密码子偏好性的应用，除了排除酶切位点和一些序列的修饰外，尽量应用棉花的优选第一选择密码子。
[0044]
基于以上原则，对野生型epsps基因进行改造,得到epsps优化基因。
[0045]
epsps优化基因共含有1368个核苷酸，编码455个氨基酸，其核苷酸序列如序列表中序列1自5
’
末端第253位至第1620位核苷酸所示。由上海捷瑞生物工程有限责任公司合成。
[0046]
2、融合基因ts-epsps的化学合成
[0047]
ts编码序列(其核苷酸序列是序列表中序列1自5
′
末端第1位至第246位核苷酸所
示)参照文献(chabregas,s.m.,luche,d.d.,van sluys,m.a.,menck,c.f.,and silva-filho,m.c.differential usage of two in-frame translational start codons regulates subcellular localization of arabidopsis thaliana thi1.j.cell sci.2003，116,285
–
291)报道的序列进行合成的，由上海捷瑞生物工程有限责任公司合成。在ts编码序列后加入酶切位点bamh i(ggatcc)，在酶切位点后，加上合成的epsps优化基因，将得到的一个246bp大小的ts片段与1368bp大小的epsps相连接的融合基因ts-epsps，该融合基因的核苷酸序列为序列表中序列1；其中序列1第1位至第246位为ts信号肽的编码序列，序列1中第247-252是bamh i酶切识别位点，第253位至第1620位核苷酸为epsps优化基因。
[0048]
该融合基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2，其中，序列2中第1-82位为ts引导肽，序列2中第83位至第84位为bamh i酶切位点肽段，序列2中第85位至第539位为蛋白epsps。
[0049]
3、融合基因acp1-epsps的化学合成
[0050]
acp1编码序列(其核苷酸序列是序列表中序列3自5
′
末端第1位至第162位核苷酸所示)由上海捷瑞生物工程有限责任公司合成。在acp1编码序列后加入酶切位点bamh i(ggatcc)，在酶切位点后，加上合成的epsps优化基因，将得到的一个162bp大小的acp1片段与1368bp大小的epsps相连接的融合基因acp1-epsps，该融合基因的核苷酸序列为序列表中序列3；其中，序列3第1-162位为acp1，第163-168位为bamh i酶切识别位点，第169-1536位为epsps优化基因。
[0051]
该融合基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4，其中序列4第1-54位为acp1引导肽，序列4中第55位至第56位为bamh i酶切位点肽段，第57位至第511位为蛋白epsps。
[0052]
二、pbi121-epsps重组表达载体、pbi121-ts-epsps重组表达载体和pbi121-acp1-epsps重组表达载体的构建
[0053]
1、构建pbi121-epsps重组表达载体
[0054]
将序列表中序列1自5
’
末端第253位至第1620位所示的epsps基因插入pbi121载体(湖南科爱医疗器械有限公司，no.vt1388)的xbai和saci位点之间构建成重组植物表达载体pbi121-epsps。其构建过程如图1所示(rb：右边界；kanr：卡那霉素基因nptii；camv 35s promoter：双增强子的camv35s启动子；nos terminator：终止子；lb：左边界)。
[0055]
将重组表达载体pbi121-epsps转化大肠杆菌dh5α(invitrogen,chicago,usa；cat.no:11319-019)后，挑选抗卡那霉素的阳性克隆，使用xbai和saci双酶切并且通过测序鉴定，结果表明pbi121-epsps载体中的epsps基因为序列表中序列1自5
’
末端第253位至第1620位核苷酸所示的epsps基因替换pbi121载体的xbai和saci位点间的片段得到的载体，表达蛋白epsps(序列2第85位至第539位)。
[0056]
2、构建pbi121-ts-epsps重组表达载体
[0057]
将序列表中序列1所示的ts-epsps基因插入pbi121载体(湖南科爱医疗器械有限公司，no.vt1388)的xbai和saci位点之间构建成重组植物表达载体pbi121-ts-epsps。其构建过程如图2所示(rb：右边界；kanr：卡那霉素基因nptii；camv 35s promoter：双增强子的camv35s启动子；nos terminator：终止子；lb：左边界)。
rep,1993,11:112-117)所示方法提取其dna。设计扩增epsps基因的pcr特异引物，pf:5'-caataccggaaaggctatgca-3'和pr:5'-ccctaccctccaacctaattgttc-3'由上海捷瑞生物工程有限公司合成，这一对引物的扩增产物为524bp左右的片段。
[0072]
pcr扩增条件是：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，32个循环；72℃延伸5min，16℃保存。
[0073]
同时以t0代转空载体棉花为对照。
[0074]
用琼脂糖凝胶电泳检测pcr结果，结果如图4所示，泳道m为dl2000plus dna marker；1为pbi121-epsps质粒；2为t0代转空载体棉花，3-5为t0代转epsps棉花；6-9为t0代转ts-epsps棉花；10-12为t0代转acp1-epsps棉花；可以看出，3-12所示的转基因棉花均得到524bp左右的片段，表明epsps和ts-epsps基因已整合到所检测的棉花植株的染色体组中。
[0075]
将得到524bp左右的片段的t0代转epsps棉花、t0代转ts-epsps棉花和t0代转acp1-epsps棉花命名为阳性t0代转epsps棉花、阳性t0代转ts-epsps棉花和阳性t0代转acp1-epsps棉花。
[0076]
收获阳性t0代转epsps棉花、阳性t0代转ts-epsps棉花和阳性t0代转acp1-epsps棉花种子，播种，得到t1代转epsps棉花、t1代转ts-epsps棉花和t1代转acp1-epsps棉花。
[0077]
3、半定量rt-pcr鉴定
[0078]
分别称取t1代转epsps棉花、t1代转ts-epsps棉花和t1代转acp1-epsps棉花新鲜的叶组织样品100mg，用液氮研磨至粉末状，根据pureplant rna reagent(invitrogen)的使用说明，采用trizol法提取总rna，加入20-30μl rnase-free water溶解总rna。
[0079]
反转录合成第一链cdna使用反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，北京，no.ae301)。半定量rt-pcr以反转录后稀释10倍的cdna为模板，加入引物qf:5'-cggttgtaggttgactatgggact-3'和qr:5'-gcagcaacagccaagataggata-3'进行半定量rt-pcr反应。pcr程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃延伸5min，16℃保存。
[0080]
使用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，结果如图5所示，泳道m为dl2000 dna marker；1为pbi121-epsps质粒；2为野生型棉花，3-5为t1代转epsps棉花；6-9为t1代转ts-epsps棉花；10-12为t1代转acp1-epsps棉花；表明得到702bp左右的片段为阳性t1代转epsps棉花、阳性t1代转ts-epsps棉花和阳性t1代转acp1-epsps棉花。
[0081]
二、转基因棉花草甘膦抗性测试
[0082]
实验组：上述一获得的2个epsps基因转化事件(阳性t1代转epsps棉花(ep3-ep4))、3个ts-epsps基因转化事件(阳性t1代转ts-epsps棉花(te5-te7))、3个acp1-epsps基因转化事件(阳性t1代转ts-epsps棉花(ae8-ae10))；
[0083]
对照组：t1代转空载体棉花(ev)和中棉35号(wt)
[0084]
将上述各组中各个株系棉花种子，用自来水润湿发苗，然后将棉花苖移栽(每个组每个事件均为50株)均匀地排放在同一实验区域(避免叶片重叠)。
[0085]
计算实验组和对照组的占地区域面积，根据区域面积，按1060克/公顷(0.106g/m2)为1x剂量来喷施草甘膦。2x剂量为2120克/公顷，5x剂量为5300克/公顷。根据上述的喷
洒浓度，取相应质量的市售的41％草甘膦异丙胺盐溶剂，然后用20倍体积水稀释后，均匀喷施在各实验组和对照组的植株上。喷洒1x草甘膦后，第10天统计各组植株的生长状况；并对存活的植株再喷洒2x草甘膦，第10天统计各组植株的生长状况；并对存活的植株再喷洒5x草甘膦，第10天统计各组植株的生长状况。实验重复三次。通过观察植株生长情况和叶片枯萎面积确认植株受害等级，按抗性等级统计植株数。
[0086]
草甘膦抗性等级的统计标准为：
[0087]
植株枯萎、死亡，为非草甘膦抗性植株(不具有草甘膦抗性)，用
“-”
表示；
[0088]
植株的叶片枯萎面积>75％，为低草甘膦抗性植株，用“+”表示；
[0089]
植株的叶片枯萎面积<75％,>25％，为中草甘膦抗性植株，用“++”表示；
[0090]
植株的叶片枯萎面积25％<，为高草甘膦抗性植株，用“+++”表示；
[0091]
植株没有任何的草甘膦损伤现象，生长正常，为特高草甘膦抗性植株，用“++++”表示。
[0092]
各个事件在不同剂量不同抗性下的株数统计如表2所示(每个事件均为三次重复实验的总株数)，与对照组wt和对照组ev的棉花相比，阳性t1代转epsps棉花ep、阳性t1代转ts-epsps棉花te和阳性t1代转acp1-epsps棉花ae对草甘膦具有抗性。其中ts-epsps棉花的草甘膦抗性最高，在喷施5x剂量的草甘膦的条件下，3个ts-epsps基因转化事件的“++++”级总存活株数均在122株以上；而对照组wt和对照组ev组的棉花存活为0；其他实验组(阳性t1代转epsps棉花和阳性t1代转acp1-epsps棉花)的总存活株数显著低于阳性t1代转ts-epsps棉花。
[0093]
表2为转基因抗草甘膦棉花植株试验结果表
[0094][0095]
其中，第3-12列为各个事件在不同剂量不同抗性下的三次重复实验的总株数。

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