一种CAR-NK细胞的培养方法与流程

一种car-nk细胞的培养方法
技术领域
[0001]
本发明涉及细胞培养领域，特别涉及一种car-nk细胞的培养方法。


背景技术：

[0002]
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，缩写car)修饰的免疫细胞使用遗传工程手段修饰免疫细胞使其表达外源性抗肿瘤基因。car基因主要包括细胞外识别域和细胞内信号转导结构域：前者用于识别肿瘤表面特异性分子，后者用于启动识别肿瘤表面分子后的免疫细胞应答，发挥细胞毒作用。这是一个出现了很多年，但是近几年才被改良使用到临床上的新型细胞疗法。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。
[0003]
自然杀伤(natural killer，缩写nk)细胞是非特异性免疫系统的重要组成部分，先天免疫系统反应的关键性介质细胞。nk细胞是一种广谱免疫细胞，具有快速发现和摧毁异常细胞(如癌症或病毒感染的细胞)的特异功能，而且不需要提前致敏或hla配型，即可展示强大的溶解异常细胞的活性。使用免疫细胞(包括nk细胞)来治疗癌症是近年来新趋势，这种新疗法有望为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治愈希望。但nk细胞数量较少，在外周血中仅占淋巴细胞的10％-15％，在脐带血中nk的含量更低，只有5％左右，正常人体外周血中和脐带血中nk细胞含量远远不能满足临床治疗的需要。nk细胞的数量和纯度是临床疗效的重要影响因素，nk细胞数量太少不能达到治疗的效果，纯度低则会影响对肿瘤的杀伤作用。
[0004]
经过car结构修饰后的nk细胞，能够高效的识别肿瘤细胞，并通过释放杀伤介质、诱导靶细胞凋亡等多种手段杀伤肿瘤细胞。但是现有技术制备car-nk细胞存在制备方法操作复杂，制备的细胞活性不够、数量少的问题。


技术实现要素：

[0005]
针对上述问题，本发明提供了一种car-nk细胞的培养方法，具体按以下步骤实现：
[0006]
s1、采集健康供者的外周血，分离得到外周血单个核细胞；
[0007]
s2、从外周血单个核细胞中分选出nk细胞；
[0008]
s3、将带有嵌合抗原受体基因的慢病毒载体感染步骤s2的nk细胞；
[0009]
s4、将步骤s3的nk细胞移入无血清的dmem培养基培养24～48h后，将细胞密度调整为(1～3)
×
10个/ml并转移到car-nk细胞扩增培养基中进行扩增培养，培养21～28d，得car-nk细胞；其中，car-nk细胞扩增培养基为含有5～12％体积比自体灭活血清、120～180ng/ml白细胞介素-2、0.012～0.020g/l肌醇、0.1～0.6g/l槲皮素葡萄糖苷、0.02～0.06g/l芒柄花苷、0.3～0.8g/l羊胎盘素、0.1～0.8g/l半乳糖的dmem培养基。
[0010]
优选的，步骤s2为将外周血单个核细胞的细胞浓度稀释为(1～2)
×
107个/ml，吸取稀释后的细胞3～5ml接入被10～15μg/ml的抗cd16单抗体包被的培养瓶中进行分化培养，培养1～3d后补充100～150ng/ml白细胞介素-12、50～70ng/ml白细胞介素3、0.3～
0.7g/l卵磷脂、0.01～0.02g/l谷胱甘肽，继续培养4～6d，分选出nk细胞；将分选出的nk细胞进行nk细胞扩增培养。
[0011]
优选的，分化培养为将培养瓶置于温度为30～35℃，co2体积浓度为4～5％的培养箱中培养。
[0012]
优选的，分化培养1～3d后补充120～130ng/ml白细胞介素-12、55～60ng/ml白细胞介素3、0.4～0.5g/l卵磷脂、0.01g/l谷胱甘肽。
[0013]
优选的，nk细胞扩增培养为用无血清的dmem培养基培养24～48h，将nk细胞的细胞密度调整为(1～3)
×
10个/ml，再转移到nk细胞扩增培养基中进行扩增培养，培养7～10d；所述nk细胞扩增培养基为含有5～12％体积比自体灭活血清、140～200ng/ml白细胞介素-2、0.03～0.05g/l的巴豆环氧素、0.12～0.16g/l羊胎盘素、0.02～0.03g/l芒柄花苷、0.4～0.8g/l半乳糖的dmem培养基。
[0014]
优选的，扩增培养为将培养基置于温度36～37℃，co2体积浓度为4～5％的培养箱中培养。
[0015]
优选的，步骤s4扩增培养为培养至第6～8d，对细胞密度进行调整，调整细胞密度至(1～3)
×
10个/ml，并将细胞转移到新的car-nk细胞扩增培养基中继续培养，继续培养为每隔3～4d，对细胞密度进行调整，并将细胞转移到新的car-nk细胞扩增培养基中培养。
[0016]
优选的，car-nk细胞扩增培养基为含有8～10％体积比自体灭活血清、120～150ng/ml白细胞介素-2、0.014g/l肌醇、0.2～0.6g/l槲皮素葡萄糖苷、0.03g/l芒柄花苷、0.6g/l羊胎盘素、0.5g/l半乳糖的dmem培养基。
[0017]
本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
[0018]
本发明通过从外周血中分离外周血单个核细胞，再分选出高纯度的nk细胞，进行nk细胞扩增培养；用带有嵌合抗原受体基因的慢病毒载体感染nk细胞获得car-nk细胞，将car-nk细胞接入含有白细胞介素-2、肌醇、槲皮素葡萄糖苷、芒柄花苷、羊胎盘素、半乳糖的培养基进行扩增培养，获得大量的car-nk细胞。本发明在培养过程中通过提高nk细胞的纯度、数量和car-nk细胞的数量来获得杀伤活性高的car-nk细胞。
[0019]
本发明在培养瓶中补充的卵磷脂、谷胱甘肽对白细胞介素-12、白细胞介素3促进外周血细胞分化为nk细胞具有协同促进作用，再结合分化培养的条件能够提高nk细胞的纯度；nk细胞扩增培养基中添加的巴豆环氧素、芒柄花苷，能够促进nk细胞增殖，提高nk细胞数量；car-nk细胞扩增培养基中的羊胎盘素、半乳糖和自体灭活血清为细胞扩增提供细胞增殖所需物质，白细胞介素-2与肌醇、槲皮素葡萄糖苷、芒柄花苷合用能够增强car-nk细胞的增殖作用，促进car-nk细胞的快速增殖，提高细胞杀伤活性。
[0020]
本发明的car-nk细胞培养方法操作简单，培养获得的nk细胞纯度高达99％，car-nk细胞数量多、杀伤活性高达92.58％。
具体实施方式
[0021]
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
[0022]
实施例1
[0023]
一种car-nk细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0024]
s1、采集健康供者的外周血，分离得到外周血单个核细胞；
[0025]
s2、将外周血单个核细胞的细胞浓度稀释为1
×
107个/ml，吸取稀释后的细胞3ml接入被10μg/ml的抗cd16单抗体包被的培养瓶中，将培养瓶置于温度为32℃，co2体积浓度为5％的培养箱中培养3d后，补充120ng/ml白细胞介素-12、55ng/ml白细胞介素3、0.5g/l卵磷脂、0.01g/l谷胱甘肽，继续培养5d，分选出nk细胞，检测nk细胞纯度；
[0026]
将分选出的nk细胞用无血清的dmem培养基培养24h，将nk细胞的细胞密度调整为3
×
10个/ml，再转移到nk细胞扩增培养基中进行扩增培养，将培养基置于温度为37℃，co2体积浓度为5％的培养箱中培养7d，检测nk细胞的扩增倍数；所述nk细胞扩增培养基为含有8％体积比自体灭活血清、160ng/ml白细胞介素-2、0.03g/l的巴豆环氧素、0.14g/l羊胎盘素、0.02g/l芒柄花苷、0.5g/l半乳糖的dmem培养基；
[0027]
s3、将带有嵌合抗原受体基因的慢病毒载体感染步骤s2的nk细胞；
[0028]
s4、将步骤s3的nk细胞移入无血清的dmem培养基培养24h后，将细胞密度调整为1.8
×
10个/ml并转移到car-nk细胞扩增培养基中进行扩增培养，将培养基置于温度为37℃，co2体积浓度为5％的培养箱中培养，培养至第6d，对细胞密度进行调整，调整细胞密度至1.8
×
10个/ml，并将细胞转移到新的car-nk细胞扩增培养基中继续培养，之后每隔4d对细胞密度进行调整，并将细胞转移到新的car-nk细胞扩增培养基中培养，培养至第21d，得car-nk细胞，检测car-nk细胞扩增倍数；
[0029]
其中，car-nk细胞扩增培养基为含有8％体积比自体灭活血清、130ng/ml白细胞介素-2、0.014g/l肌醇、0.5g/l槲皮素葡萄糖苷、0.013g/l芒柄花苷、0.6g/l羊胎盘素、0.5g/l半乳糖的dmem培养基。
[0030]
实施例2
[0031]
实施例2与实施例1的区别在于:
[0032]
步骤s2所述分化培养为将培养瓶置于温度为37℃，co2体积浓度为4％的培养箱中培养。
[0033]
实施例3
[0034]
实施例3与实施例1的区别在于：
[0035]
步骤s2所述扩增培养为将分选出的nk细胞用无血清的dmem培养基培养36h，将nk细胞的细胞密度调整为1.5
×
10个/ml，再转移到nk细胞扩增培养基中进行扩增培养，将培养基置于温度为37℃，co2体积浓度为5％的培养箱中培养7d，检测nk细胞的扩增倍数；所述nk细胞扩增培养基为含有10％体积比自体灭活血清、140ng/ml白细胞介素-2、0.4g/l半乳糖的dmem培养基。
[0036]
实施例4
[0037]
实施例4与实施例1的区别在于：
[0038]
步骤s4所述扩增培养为将步骤s3的nk细胞移入无血清的dmem培养基培养48h后，将细胞密度调整为1
×
10个/ml并转移到car-nk细胞扩增培养基中进行扩增培养，将培养基置于温度为37℃，co2体积浓度为5％的培养箱中培养，培养至第9d，对细胞密度进行调整，调整细胞密度至1
×
10个/ml，并将细胞转移到新的car-nk细胞扩增培养基中继续培养，之后每隔5d对细胞密度进行调整，并将细胞转移到新的car-nk细胞扩增培养基中培养，培养至第28d，得car-nk细胞。
[0039]
实施例5
[0040]
实施例5与实施例1的区别在于：
[0041]
步骤s4所述car-nk细胞扩增培养基为含有5％体积比自体灭活血清、120ng/ml白细胞介素-2、0.020g/l肌醇、0.6g/l槲皮素葡萄糖苷、0.02g/l芒柄花苷、0.8g/l羊胎盘素、0.1g/l半乳糖的dmem培养基。
[0042]
实施例6
[0043]
实施例6与实施例1的区别在于：
[0044]
所述扩增培养为将培养基置于温度为35℃，co2体积浓度为3％的培养箱中培养。
[0045]
实施例7
[0046]
实施例7与实施例1的区别在于：
[0047]
步骤s2为将外周血单个核细胞的细胞浓度稀释为1
×
107个/ml，吸取稀释后的细胞3ml接入被16μg/ml的抗cd16单抗体包被的培养瓶中，将培养瓶置于温度为32℃，co2体积浓度为5％的培养箱中培养3d后，补充120ng/ml白细胞介素-12、55ng/ml白细胞介素3、0.6g/l大豆磷脂、0.01g/l谷氨酰胺，继续培养4～6d，分选出nk细胞，检测nk细胞纯度，将分选出的nk细胞进行扩增培养。
[0048]
对比例1
[0049]
一种car-nk细胞的常规培养方法，包括以下步骤：
[0050]
s1、采集健康供者的外周血，分离得到外周血单个核细胞；
[0051]
s2、从外周血单个核细胞中分选出nk细胞；
[0052]
s3、将带有嵌合抗原受体基因的慢病毒载体感染步骤s2分选出的nk细胞；
[0053]
s4、将步骤s3的nk细胞的细胞密度调整为1
×
10个/ml并转移到car-nk细胞扩增培养基中进行扩增培养，将培养基置于温度为37℃，co2体积浓度为5％的培养箱中培养，每隔4d按细胞密度为1.0
×
10个/ml进行补液，培养至第21d，得car-nk细胞，检测car-nk细胞扩增倍数；所述car-nk细胞扩增培养基为含有8％体积比自体灭活血清、130ng/ml白细胞介素-2的dmem培养基。
[0054]
对比例2
[0055]
对比例2与实施例1的区别在于：
[0056]
步骤s4所述car-nk细胞扩增培养基为含有8％体积比自体灭活血清、130ng/ml白细胞介素-2、0.02g/l甘露醇、0.6g/l羊胎盘素、0.5g/l半乳糖的dmem培养基。
[0057]
对比例3
[0058]
对比例3与实施例1的区别在于：
[0059]
步骤s4所述car-nk细胞扩增培养基为含有13％体积比自体灭活血清、110ng/ml白细胞介素-2、0.010g/l肌醇、0.1～0.6g/l槲皮素葡萄糖苷、0.08g/l芒柄花苷、0.2g/l羊胎盘素、0.9g/l半乳糖的dmem培养基。
[0060]
细胞纯度采用流式细胞术检测；
[0061]
细胞扩增倍数采用细胞计数法进行检测；
[0062]
细胞杀伤活性检测采用mtt法，调整细胞浓度为105个/ml，按效应细胞：靶细胞＝20:1的比例放入96孔板，另设单独靶细胞和效应细胞组，每组设3个复孔。孵育24h，每孔加入mtt溶液，继续培养孵育4h，平板离心机去掉悬液，每孔加入二甲亚砜溶液150ml，振荡，在酶标仪上测定吸收值(结果用均值表示)a，根据杀伤活性计算公式计算杀伤活性，结果见下
表。其中，效应细胞为外周血分离的单个核细胞，靶细胞为体外传代细胞株k562。
[0063]
杀伤活性(％)＝[靶细胞a值-(效应细胞a值-实验组a值)]/靶细胞a值
×
100％
[0064][0065]
由上述实验结果可知，通过本发明培养方法培养的nk细胞纯度高、细胞数量多，car-nk细胞扩增倍数多、杀伤活性高，培养瓶中添加的卵磷脂、谷胱甘肽和分化培养的条件对外周血细胞分化为nk细胞具有促进作用，nk细胞扩增培养基中的巴豆环氧素巴豆环氧素、芒柄花苷能够促进nk细胞增殖，car-nk细胞扩增培养基中的肌醇、槲皮素葡萄糖苷、芒柄花苷对car-nk细胞增殖具有促进作用。
[0066]
实施例1～7与对比例1，表明采用本发明的car-nk细胞培养方法较常规培养方法，获得的nk细胞纯度、扩增倍数高，car-nk细胞的扩增倍数和杀伤活性也比较高。实施例1～7与对比例2，表明本发明的肌醇、槲皮素葡萄糖苷、芒柄花苷与白细胞介素-2合用可以显著增强car-nk细胞的增殖作用，在提高car-nk细胞的扩增倍数的同时，增强了car-nk细胞的杀伤活性。实施例1～7与对比例3，表明采用本发明car-nk细胞扩增培养基各组分的用量为本发明促进car-nk细胞增殖的最佳用量范围。
[0067]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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