TSG-6基因在预测结直肠癌转移及预后方面的应用的制作方法

2021-02-02 06:02:47|

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tsg-6基因在预测结直肠癌转移及预后方面的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及肿瘤生物诊断及治疗技术领域，具体涉及tsg-6基因在预测结直肠癌转移及预后方面的应用。

背景技术：

[0002]
结直肠癌(colorectal cancer，crc)的发病率和致死率均排在恶性肿瘤的第三位，全球每年新发的患者约为120万例，死亡近70万例；约30％的患者最后会发展为转移性结直肠癌(mcrc)，而mcrc是导致肠癌患者死亡的主要原因。局部晚期的结直肠癌患者常用化疗药物或者靶向药物治疗防止转移的发生。然而，仍有大约30％的结直肠癌患者最终出现转移，并且转移性结直肠癌患者的五年生存率仅有约13％。转移一旦发生，将严重影响患者的预后。但目前关于结直肠癌转移的分子机制尚不明确，尚未找到能够有效预测结直肠癌转移的分子标记物。因此，急需寻找能够有效预测结直肠癌转移的标志物。
[0003]
人tsg-6基因位于人染色体2q23.3，mrna全长1439bp，其76-909nt核苷酸编码一个由277个氨基酸残基组成的蛋白，分子量大小约为31kd。tsg-6(tumor necrosis factor alpha stimulate gene 6)也称肿瘤坏死因子α-刺激基因6，是一种细胞因子，其主要表达于软骨细胞、滑膜细胞、单核细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞以及具有分化潜能的干细胞中。已有的研究显示，tsg-6基因参与多种机体炎症反应应答，作为一种抑炎因子，其主要通过下调炎症因子的表达、减轻细胞外基质病理反应而发挥作用。但是tsg-6基因在肿瘤中的作用却鲜有报道。因此，本发明人研究了tsg-6基因与结直肠癌的相关性，验证其是否能作为有效预测结直肠癌转移的新的标志物。

技术实现要素：

[0004]
本发明针对目前临床结直肠癌及其转移缺乏有效诊断标记物的情况，提供了一种能够用于预测结直肠癌转移早期诊断及预后评估的分子标记物——分泌型蛋白tsg-6，通过检测tsg-6基因的表达水平从而达到对结直肠癌转移进行早期诊断及预后评估的目的。
[0005]
为了实现上述技术问题，本发明采用以下技术方案实现：
[0006]
本发明利用oncomine以及tcga在线数据库分析了tsg-6的表达水平与结直肠癌的相关性，发现tsg-6在结直肠癌中显著高表达(图1)，并且在cms4型结直肠癌中表达最高(图2)，cms4型肠癌是与转移密切相关的一种分型。另外，生存分析提示tsg-6的高表达的患者拥有更低的生存率(图3)。本发明人对结直肠癌患者的肠癌组织以及配对的癌旁组织进行了rna的提取，用rt-qpcr技术检测了组织中tsg-6的mrna表达水平，结果显示肠癌组织中tsg-6的mrna水平显著高于癌旁组织(图4)。另外，相较于非转移患者，转移患者肠癌组织中tsg-6的mrna水平显著升高(图5)。接着，我们对结直肠癌病人的肠癌标本制作的病理切片和组织芯片进行了免疫组化染色，证实tsg-6在结直肠癌组织中的高表达(图6，图7)；根据tsg-6免疫组化评分结合临床生存资料分析，发现tsg-6的高表达与较差的生存预后相关(图8)，与数据库的生存分析结果一致；并且tsg-6的表达水平与肠癌患者的较晚分期和发
生复发或转移呈正相关(图9)。然后，对过表达tsg-6的结直肠癌细胞进行功能实验的验证，qpcr验证过表达效果(图10)，结果显示tsg-6不影响肠癌细胞的增殖(图11)，但能够促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力(图12)。
[0007]
本发明人通过上述研究发现：tsg-6在crc中显著高表达，且与生存预后显著相关；tsg-6高表达可以激活结直肠癌细胞的上皮间质转化(emt)这一过程，从而促进肿瘤细胞迁移侵袭。因此，发明人通过上述研究获得结论：tsg-6有潜在的可能成为预测结直肠癌转移的重要分子标记物，以及其作为不良预后的个体生物标记。
[0008]
基于上述研究的结果，本发明提出了tsg-6作为分子标记物在制备用于结直肠癌转移的早期诊断以及预后评估的试剂或试剂盒中的用途。
[0009]
进一步的，本发明还提出了用于检测tsg-6表达水平的试剂在制备用于结直肠癌转移的早期诊断以及预后评估的试剂或试剂盒中的用途。
[0010]
优选的，所述的用于检测tsg-6表达水平的试剂包括从rna水平以及蛋白水平检测的试剂。
[0011]
优选的，所述的从rna水平检测的试剂包括用于tsg-6qrt-pcr检测所需的引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，在本发明的一个具体实施例中，所述的上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0012]
当然，依据人类tsg-6基因序列所设计的所有引物均应在本发明的保护范围之内。
[0013]
优选的，所述的从蛋白水平检测的试剂包括抗tsg-6蛋白的抗体。
[0014]
本发明的有益效果为：本发明针对tsg-6在临床结直肠癌患者中存在表达差异并与转移发生和不良预后存在相关性的情况，利用tsg-6相关序列及蛋白抗体，通过mrna及蛋白表达水平的检测，分析结直肠癌组织中tsg-6的表达情况，从而进行结直肠癌转移诊断及患者预后评估。将tsg-6序列及其相关抗体应用于临床结直肠癌转移诊断及预后评估中，能够为结直肠癌及其转移的发生提供新的早期诊断及预后评估方案，对于结直肠癌的临床治疗具有重要意义。
附图说明
[0015]
图1为正常肠组织与结直肠癌临床样本中tsg-6的mrna表达水平示意图。
[0016]
图2为tsg-6在cms1、cms2、cms3、cms4四种亚型中表达水平示意图。
[0017]
图3为tsg-6的表达水平与结直肠癌患者总体生存率和无疾病生存率的相关性示意图。
[0018]
图4为tsg-6在结直肠癌组织，癌旁组织以及正常肠组织的mrna表达水平示意图。
[0019]
图5为tsg-6在转移患者和非转移患者的肠癌组织中mrna表达水平示意图。
[0020]
图6为tsg-6在结直肠癌组织病理切片和正常组织中免疫组化结果示意图。
[0021]
图7为tsg-6在结直肠癌组织芯片中蛋白表达情况示意图。
[0022]
图8为tsg-6在组织芯片中表达水平(高表达vs低表达)的预后生存曲线图。
[0023]
图9为tsg-6在组织芯片中表达水平与肿瘤较晚分期以及发生复发转移相关性示意图。
[0024]
图10为过表达细胞与对照组细胞中tsg-6的mrna表达水平示意图。
[0025]
图11为tsg-6过表达对肿瘤细胞的增殖影响示意图。
[0026]
图12为过表达tsg-6与结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力相关性示意图。
具体实施方式
[0027]
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。
[0028]
实施例1分析tsg-6与结直肠癌及其预后的相关性
[0029]
通过oncomine数据库以及tcga在线数据库分析结直肠癌临床样本中tsg-6的mrna表达水平，结果如图1所示，tsg-6在肠癌组织中的mrna水平显著高于正常组织。并且tsg-6在cms4的亚型中表达量最高，提示其可能与转移相关(图2)。对tcga数据库的数据进行分析，发现高表达tsg-6的结直肠癌患者具有更低的总体生存率和无疾病生存率(图3)，提示tsg-6与预后不良相关。
[0030]
实施例2临床样本的检测
[0031]
1、样本
[0032]
39例临床配对的结直肠癌组织，癌旁组织以及正常肠组织；4例临床病理标本石蜡切片以及206例结直肠癌患者的组织芯片
[0033]
2、方法
[0034]
2.1组织样本中tsg-6 mrna水平的检测
[0035]
2.1.1组织样本中的rna提取
[0036]
(1)取2ml ep管，加入100mg冰冻组织，100ul 0.5mm硅酸锆珠子，1mltrizol。
[0037]
(2)置于组织破碎仪中，最大速度破碎5min。
[0038]
(3)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡30s，冰上静置3-5min。
[0039]
(4)4℃离心，12000g，15min。
[0040]
(5)弃去上清，75％冰乙醇洗涤rna沉淀。4℃离心，12000g，5min。
[0041]
(6)小心弃去上清，rna沉淀室温风干，5-10min中待沉淀半透明后溶于30uldepc水，测浓度待用。
[0042]
2.1.2逆转录
[0043]
依据上述测定的浓度调整样品的总rna浓度为1ug/ul，采用toyobo公司的revertra ace qpcr rt kit逆转录试剂盒，按照说明书提供的方法逆转录合成cdna。
[0044]
cdna反应体系及反应条件:
[0045]
4xdnamix 4ul
[0046]
总rna 1ul
[0047]
加depc水11ul
[0048]
37℃5min
[0049]
再加5xrt master mix 4ul
[0050]
37℃15min，98℃5min
[0051]
所得cdna备用或者-80℃保存。
[0052]
2.1.3实时定量pcr
[0053]
用扩增目的基因的引物，以上述组织样本的cdna为模板进行扩增，引物系列如下：
[0054]
上游引物：5
’-
gatgcctattgctacaacccac-3
’
(seq id no：1)
[0055]
下游引物：5
’-
ggtgaatacgctgaccatacttga-3
’
(seq id no：2)
[0056]
反应体系及反应条件：
[0057]
roche faststart sybr green master(2x)10ul
[0058]
cdna 1ul
[0059]
上游引物(10μmol/l)+下游引物(10μmol/l)1ul
[0060]
depc水8ul
[0061]
95℃10min
[0062]
95℃10s,60℃10s,72℃10s，45cycles
[0063]
2.2临床结直肠癌样本中tsg-6蛋白水平的表达情况检测
[0064]
2.2.1免疫组化方法检测石蜡切片及组织芯片中结直肠癌组织的tsg-6蛋白表达情况
[0065]
(1)石蜡切片及组织芯片制备
[0066]
(2)脱蜡、水化：60℃烤片过夜，二甲苯脱蜡三次，每次15min，然后酒精水化(逐级梯度100％-95％-80％)
[0067]
(3)抗原修复：ph＝9 tris-edta高温修复10min
[0068]
(4)室温静置，冷却1h，pbs洗三次，每次5min
[0069]
(5)阻断内源性过氧化物酶：3％h2o2室温孵育10min，pbs洗三次，每次5min
[0070]
(6)封闭：1％山羊血清封闭1h
[0071]
(7)一抗孵育：按照说明书对tsg-6抗体用一抗稀释液进行稀释，均匀滴在组织上，4℃过夜。
[0072]
(8)37℃温箱复温15min，pbs洗三次，每次5min
[0073]
(9)加二步法检测试剂，按说明书孵育
[0074]
(10)pbs洗三次，每次5min
[0075]
(11)dab显色，30s-60s(视染色情况而定)，pbs洗三次，每次5min
[0076]
(12)苏木素染色2min，流水冲洗反蓝
[0077]
(13)1％盐酸酒精分化3s，pbs洗一次
[0078]
(14)流水冲洗10min
[0079]
(15)风干，中性树脂封片
[0080]
(16)全自动玻片扫描仪扫描玻片
[0081]
(17)染色结果判读
[0082]
3、结果
[0083]
3.1检测结直肠癌组织中tsg-6的mrna水平
[0084]
通过对39例临床配对的结直肠癌组织(tumor)，癌旁组织(paretumor)以及正常肠组织(normal)的mrna表达水平进行rt-qpcr检测，发现结直肠癌组织中的tsg-6mrna水平显著高于癌旁和正常组织(图4)，转移患者(yes)的肠癌组织中tsg-6的mrna水平显著高于非转移患者(no)(图5)。
[0085]
3.2免疫组化检测结直肠癌组织中tsg-6的蛋白表达情况
[0086]
图6和图7分别为免疫组化检测结直肠癌组织病理切片以及组织芯片中tsg-6的蛋白表达情况，结果显示相较于正常肠组织，肠癌组织中tsg-6蛋白高表达。
[0087]
3.3tsg-6的表达情况与结直肠癌患者生存预后的关系
[0088]
图8为采用kaplan-meier法单因素分析(log-rank)绘制的生存曲线，结果显示肠癌患者中tsg-6的高表达与较差的生存预后(较低的总体生存率以及无进展生存率)相关。另外，通过分析tsg-6免疫组化评分结合临床数据分析，发现tsg-6的高表达与肿瘤较晚分期以及发生复发转移呈正相关(图9)。
[0089]
实施例3tsg-6高表达与结直肠癌细胞的迁移侵袭能力的相关性
[0090]
1、细胞的培养：
[0091]
结直肠癌细胞系hct116、dld1由中山大学胃肠病学研究所保存，hct116用含10％胎牛血清(invitrogen，usa)的mccoy's 5a medium modified(gibco，usa)培养基，dld1用含10％胎牛血清(invitrogen，usa)的rpmi1640(gibco，usa)培养基，置于含5％二氧化碳的37℃恒温潮湿的培养箱中培养。
[0092]
2、肠癌细胞系过表达tsg-6：
[0093]
首先构建tsg-6过表达质粒，接着转染tsg-6过表达质粒到肠癌细胞系，通过qpcr验证tsg-6基因过表达的效果，具体操作如下：
[0094]
构建tsg-6过表达质粒，先设计引物将tsg-6的目的片段用pcr扩增，然后用限制性核酸内切酶将目标载体质粒pcdna3.1切开，再用dna重组酶将带有tsg-6蛋白质编码区(cds)的目的片段与质粒pcdna3.1进行重组，将重组的质粒转化涂板，挑选单克隆菌落进行摇菌，最后送测序以确认质粒构建成功。
[0095]
接种约2
×
106个细胞至含有适量完全培养基的六孔板中，使转染时的细胞密度能够达到30％-50％，使用tsg-6的过表达质粒及对照组空载质粒瞬时转染hct116与dld1，质粒用量为3ug/孔。转染6-8小时后更换新鲜完全培养基。转染细胞培养48h后提取细胞总rna进行rt-pcr检测tsg-6mrna表达水平的变化，结果显示过表达组tsg-6的表达水平明显高于对照组(图10)。
[0096]
在确定了肠癌细胞系过表达tsg-6的效果后，我们做了增殖和迁移侵袭实验以确定tsg-6对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。
[0097]
增殖实验：在结直肠癌细胞转染tsg-6过表达质粒48h后消化细胞，用完全培养基重悬细胞，稀释为2.5
×
104个/ml，接种重悬液200ul于96孔板中，然后将96孔置于37℃、5％co2培养箱内的incucyte仪器内进行时时观察过表达tsg-6对细胞增殖的影响。结果显示，tsg-6过表达对肿瘤细胞的增殖没有影响(图11)。
[0098]
迁移和侵袭实验：用corning公司的matrigel 1:10稀释，包被transwell小室底部的膜的上室面(迁移实验不需要matrigel包被)，置于37℃培养箱1h使matrigel聚合成凝胶，使用前进行基底膜水化。消化已经转染过表达tsg-6质粒24h的肿瘤细胞，用pbs洗两遍，然后用无血清培养基重悬，调整细胞密度为hct116 1.0
×
106个/ml或者dld1 4.0
×
105个/ml，取细胞重悬液100μl加入transwell小室，transwell下室加入500μl含20％fbs的培养基，常规培养24-48h(依肿瘤细胞的侵袭能力而定)，用4％多聚甲醛固定，用0.1％的结晶紫染色5min，用棉签轻轻擦掉上层未能侵袭过去的细胞，用pbs洗3遍，200倍显微镜下随机拍取五个视野，而后用image j进行分析细胞数目，而后用spss软件进行统计分析。结果显示：过表达tsg-6促进了hct116与dld1的迁移和侵袭能力(图12)。
[0099]
上述结果说明tsg-6高表达能够促进结直肠癌细胞的迁移侵袭能力，但对细胞的
增殖没有影响。综上所述，本发明发现的tsg-6基因及其表达水平的高低与结直肠癌细胞的迁移和侵袭密切相关，tsg-6基因以及表达的蛋白可作为治疗或预后评估结直肠癌转移的分子标记。
[0100]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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