一种表达腺苷蛋氨酸合酶的枯草芽孢杆菌及应用的制作方法

[0001]
本发明涉及一种表达腺苷蛋氨酸合酶的枯草芽孢杆菌及应用，具体涉及利用枯草芽孢杆菌异源表达酿酒酵母来源的腺苷蛋氨酸合酶，属于基因工程技术领域。


背景技术：

[0002]
腺苷蛋氨酸(s-adenosyl-l-methionine,sam)是一种存在于生物体中的必须分子，是蛋氨酸的一种活性形式，在体内为氨基酸、蛋白质和dna等物质的合成充当甲基供体，它也是谷胱甘肽(glutathione,gsh)转硫和多胺合成过程中必不可少的前体物，因此它在人体中有着至关重要的作用，s-腺苷蛋氨酸主要用于医疗行业，在肝脏、骨关节炎以及神经疾病治疗方面表现突出。
[0003]
枯草芽孢杆菌是目前用于目的蛋白异源表达的常用宿主。与大肠杆菌相比，该宿主细胞壁中没有能引发炎症的内毒素，是常用的食品安全性菌株。并且该菌株生长所需培养基相对简单，可在大量获得目的蛋白的同时尽可能降低生产成本，是适合工业化生产的菌株。因此，目的蛋白sam合酶可能适合在枯草芽孢杆菌中表达。为了尽可能积累目的蛋白，将b.subtilis168的六个胞外蛋白酶基因敲除获得菌株b.subtilis wb600，该菌株已成功对多种外源蛋白进行了异源表达，如角蛋白酶、海藻糖酶、转谷氨酰胺酶等，但是尚无文献报道sam合酶在枯草芽孢杆菌中的表达。


技术实现要素：

[0004]
本发明提供了一种在枯草芽孢杆菌中异源表达酿酒酵母来源的腺苷蛋氨酸合酶并提高其表达量的方法，在枯草芽孢杆菌中异源表达腺苷蛋氨酸合酶的基础上，通过启动子适配性改造，构建一株高水平表达腺苷蛋氨酸合酶的枯草芽孢杆菌，并对其进行发酵条件优化，进一步提高其腺苷蛋氨酸合酶表达水平。
[0005]
本发明的第一个目的是提供编码腺苷蛋氨酸合酶的基因，含有seq id no.2所示的核苷酸序列。
[0006]
本发明的第二个目的是提供携带所述基因的表达载体。
[0007]
在一种实施方式中，所述表达载体为质粒pma5。
[0008]
在一种实施方式中，所述表达载体含有启动子trnq、sigx、yola、gapb、cdd、veg、epr、apre、bpr、nprb、pst、gsib或srfa。
[0009]
本发明的第三个目的是提供一种产腺苷蛋氨酸合酶的重组枯草芽孢杆菌，表达了seq id no.1所示的腺苷蛋氨酸合酶。
[0010]
在一种实施方式中，所述腺苷蛋氨酸合酶是由seq id no.2所示的基因编码的。
[0011]
在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌通过启动子trnq、sigx、yola、gapb、cdd、veg、epr、apre、bpr、nprb、pst、gsib或srfa表达所述腺苷蛋氨酸合酶。
[0012]
在一种实施方式中，所述启动子trnq的核苷酸序列如seq id no.3所示；启动子sigx的核苷酸序列如seq id no.4所示；启动子yola的核苷酸序列如seq id no.5所示；启
动子gapb的核苷酸序列如seq id no.6所示；启动子cdd的核苷酸序列如seq id no.7所示；启动子veg的核苷酸序列如seq id no.8所示；启动子epr的核苷酸序列如seq id no.9所示；启动子apre的核苷酸序列如seq id no.10所示；启动子bpr的核苷酸序列如seq id no.11所示；启动子nprb的核苷酸序列如seq id no.12所示；启动子pst的核苷酸序列如seq id no.13所示；启动子gsib的核苷酸序列如seq id no.14所示；启动子srfa的核苷酸序列如seq id no.15所示。
[0013]
本发明的第四个目的是提供一种在枯草芽孢杆菌中异源表达酿酒酵母来源的腺苷蛋氨酸合酶的方法，是将seq id no.2所示的编码腺苷蛋氨酸合酶的基因连接至质粒pma5上，构建重组质粒pma5-sam2，再转化至b.subtilis wb600细胞中。
[0014]
在一种实施方式中，所述重组质粒还连接有启动子trnq、sigx、yola、gapb、cdd、veg、epr、apre、bpr、nprb、pst、gsib或srfa。
[0015]
本发明的第五个目的是提供一种产腺苷蛋氨酸合酶的方法，将所述重组枯草芽孢杆菌接种至tb培养基中，于25～42℃发酵至少24h。
[0016]
在一种实施方式中，所述培养基还含有葡萄糖葡萄糖、麦芽糖、蔗糖或果糖。
[0017]
在一种实施方式中，所述葡萄糖的浓度为10～20g/l。
[0018]
在一种实施方式中，所述发酵培养基的ph为6～8。
[0019]
在一种实施方式中，所述发酵培养基含有：蛋白胨12g/l，酵母粉24g/l，葡萄糖15g/l，kh2po
4 17mmol/l，k2hpo
4 72mmol/l。
[0020]
在一种实施方式中，所述发酵温度为37℃，发酵培养基的初始ph为7。
[0021]
本发明还要求保护所述方法在医疗行业制备肝脏、骨关节炎或神经疾病的药物方面的应用。
[0022]
有益效果：
[0023]
1、本发明所选择的启动子在表达时无需添加诱导剂，可使酶活由0.0725u/ml提高至0.198u/ml～0.6175u/ml；所选p
nprb
启动子改造的重组菌wb600/pma5-p
nprb-sam2的sam合酶酶活可达0.617u
·
ml-1
。
[0024]
2、本发明通过发酵优化，使sam合酶的酶活达到0.925u
·
ml-1
，较出发菌株提高了180％。
附图说明
[0025]
图1为启动子筛选体系构建示意图；
[0026]
图2为启动子改造重组菌的腺苷蛋氨酸合酶酶活；
[0027]
图3为不同培养基成分下重组菌的腺苷蛋氨酸合酶产量；tbg：20g
·
l-1
甘油；tbp：20g
·
l-1
葡萄糖；tbn：20g
·
l-1
牛肉膏；tbm：20g
·
l-1
麦芽糖；tby：20g
·
l-1
玉米浆；tbz：20g
·
l-1
蔗糖；tbt：20g
·
l-1
果糖；
[0028]
图4为不同葡萄糖浓度下重组菌的腺苷蛋氨酸合酶产量；
[0029]
图5为不同发酵温度下重组菌的腺苷蛋氨酸合酶产量；
[0030]
图6为不同培养基初始ph下重组菌的腺苷蛋氨酸合酶产量。
具体实施方式
[0031]
ypd培养基：蛋白胨20g/l，醇母粉10g/l，葡萄糖20g/l(固体培养基添加20g/l琼脂粉)。
[0032]
tb培养基：蛋白胨12g/l，酵母粉24g/l，甘油4g/l，kh2po
4 17mmol/l，k2hpo
4 72mmol/l。
[0033]
反应母液的配置:l-蛋氨酸100mmol/l，三磷酸腺苷100mmol/l，还原型谷胱甘肽80mmol/l。
[0034]
酶活缓冲液:kcl 0.5mol/l，mgcl2·
6h2o 0.2mol/l，tris-hcl 0.5mol/l，ph为8.0。
[0035]
反应体系:200μl 100mmol/l三磷酸腺苷、200μl 100mmol/l l-蛋氨酸、100μl酶活缓冲液、100μl 80mmol/l还原型谷胱甘肽、400μl去离子水，振荡混匀后，37℃条件下反应1h后加入体积分数为20％的高氯酸溶液终止反应。37℃，1个酶活单位(u)为1h、1ml溶液中生成1μmol sam所需要的酶量。
[0036]
hplc分析腺苷蛋氨酸产量：色谱柱为hypercil goldtm aq c18(4.6mm
×
250mm)，流动相为：0.01mol
·
l-1
甲酸铵和3％(v/v)的甲醇水溶液，用甲酸调节ph为3.0，流速1.0ml
·
min-1
，检测波长254nm，进样量为10μl。采用外标法，根据不同浓度的sam标准品所对应峰面积所作标准曲线定量样品sam的含量。
[0037]
实施例1携带酿酒酵母来源的腺苷蛋氨酸合酶的重组质粒
[0038]
(1)对酿酒酵母来源的seq id no.1所示腺苷蛋氨酸合酶的编码基因进行优化，获得seq id no.2所示的基因序列。
[0039]
(2)将步骤(1)所述的基因片段与质粒pma5分别用nhe i和mlu i限制性内切酶在37℃进行双酶切，双酶切体系及条件如表1所示，反应结束将产物进行电泳验证回收。
[0040]
表1双酶切反应体系与反应条件
[0041][0042]
将纯化回收后的的目的基因与质粒用t4连接酶在16℃的金属浴进行连接，目的片段:载体＝7:1的摩尔比例进行添加，反应结束后得到重组质粒。
[0043]
(3)将(2)所述连接产物转化至e.coli jm109感受态细胞中，涂布带有amp抗生素的lb固体培养基，于恒温箱倒置培养8-12h长出转化子。挑取转化子，采用pma5质粒通用引物进行菌落pcr验证。
[0044]
通用引物序列为：
[0045]
pma5-f：5
’-
ttgtgccacctaaaaaggagcg-3
’
[0046]
pma5-r：5
’-
tcaccgtcatcaccgaaacgcg-3
’
。
[0047]
将菌落pcr验证阳性的转化子挑取至含amp抗性的lb培养基中培养8-12h，提取质粒后进行双酶切验证。随后将上述验证正确的转化子进一步进行测序验证。
[0048]
实施例2表达腺苷蛋氨酸合酶的重组枯草芽孢杆菌的构建
[0049]
将实施例1验证正确的重组质粒pma5-sam2约1μg添加至感受态细胞b.subtilis wb600中，吹吸均匀后在37℃、125rpm摇床中培养30min，再将转速调至250rpm继续培养1.5h后，在转速8000rpm下离心1min，弃部分上清，吹吸剩余菌体涂布于带有抗性的lb平板进行培养筛选，所有操作在超净工作台中进行，将得到的重组菌进行测序验证后，得到正确的重组菌b.subtilis wb600/pma5-sam2。
[0050]
实施例3对重组枯草芽孢杆菌的启动子适配性改造
[0051]
(1)启动子分析和引物设计
[0052]
从枯草芽孢杆菌b.subtilis 168基因组选取了部分启动子，查找ncbi数据库获得其碱基序列(accession：nc_000964)，利用softberry在线网站(http://www.softberry.com/berry.phtml)对这些启动子的-35区和-10区进行预测。本发明中所选择的启动子均在表达时都无需添加诱导剂，它们分别是trnq、sigx、yola、gapb、cdd、veg、apre、epr、bpr、nprb、pst、gsib、srfa基因的启动子，根据这些基因的启动子序列，引物设计见表2。
[0053]
表2引物设计
[0054][0055]
注：下划线部分为酶切位点
[0056]
(2)启动子改造重组菌的构建
[0057]
提取b.subtilis 168基因组进行启动子序列扩增，所用引物如表2所示，反应条件如表3所示。将纯化回收得到的启动子片段如实施例1所述通过酶切、连接的操作整合至实施例1构建的pma5-sam2上，其构建示意图如图1所示。经测序验证后将得到的正确的质粒转
化至b.subtilis wb600中可获得一系列的用于筛选的重组枯草芽孢杆菌。
[0058]
表3 pcr反应体系和条件
[0059][0060]
(3)重组菌的发酵产酶研究
[0061]
以tb作为培养基，将得到的一系列含不同启动子的重组菌株发酵培养28h后，取2ml发酵液在4℃下8000rpm离心5min，菌体用pbs洗涤2-3次以除去残留发酵液，离心收集菌体进行全细胞酶活检测。其中由p
nprb
启动子改造重组菌b.subtilis wb600/nprb-sam2酶活表达水平最高为0.618u
·
ml-1
，是出发菌株初始酶活(0.330u
·
ml-1
)的1.86倍(图2)。
[0062]
实施例4对重组枯草芽孢杆菌产腺苷蛋氨酸合酶发酵条件优化
[0063]
对实施例3中sam合酶表达水平提高最多的重组菌b.subtilis wb600/nprb-sam2进行进一步发酵条件优化。
[0064]
(1)不同营养组分对重组菌发酵产酶的影响
[0065]
分别用甘油、麦芽糖、蔗糖、牛肉膏、玉米浆、葡萄糖和果糖配制培养基，分别得到含量20g/l的甘油(tbg)、麦芽糖(tbm)、蔗糖(tbz)、牛肉膏(tbn)、玉米浆(tby)、葡萄糖(tbp)及果糖(tbt)的tb发酵培养基，挑取单菌落接入带有抗性lb(10ml)种子培养液中于37℃、220rpm过夜培养，将重组菌种子液以2％接种量接种至上述含不同营养组分的25ml/250ml含抗性tb发酵培养基中，在相同的条件下进行发酵产酶，28小时测定酶活及od
600
，以确定适合于重组菌产酶的营养组份。结果如图3所示，以未添加任何其他营养组分的tb培养基作为对照，所有添加碳源的实验组的酶活性都得到了提高，其中添加葡萄糖的tbp培养基酶活相对较高，可达0.904u
·
ml-1
，较初始培养基tb中的酶活提高了46.5％，因此选择葡萄糖进行进一步浓度梯度的优化。
[0066]
(2)不同葡萄糖浓度对重组菌发酵产酶的影响
[0067]
将重组菌种子液以2％接种量接种至25ml/250ml添加了不同浓度葡萄糖(5g/l、10g/l、15g/l、20g/l、25g/l)的含抗性tb培养基中发酵产酶，28小时后测定酶活及od
600
，以确定适合于重组菌产酶的培养基。以未额外添加葡萄糖的tb培养基作为对照，如图4所示，添加15g
·
l-1
葡萄糖发酵培养时重组菌生长最好，od
600
能达到18.04，且酶活相对较高，可达0.912u
·
ml-1
，因此后期实验将葡萄糖的初始浓度定为15g
·
l-1
。
[0068]
(3)不同温度对重组菌发酵产酶影响
[0069]
将重组菌种子液以2％接种量接种至25ml/250ml含15g/l葡萄糖的含抗性tb培养基中，在不同温度(20，25，30，37，42℃)下发酵产酶，28小时后测定酶活及od
600
，以确定适合
于重组菌产酶的温度。结果如图5所示，随着发酵温度升高，重组菌株的菌体量与目的蛋白的表达量均有所增高，37℃时酶活与菌体量均达到最高，温度为30℃时发酵液的生物量与酶活水平分别为22.335和0.683u/ml；42℃时发酵液的生物量与酶活水平分别为20.91和0.652u/ml。
[0070]
(4)不同ph对重组菌发酵产酶影响
[0071]
将重组菌种子液以2％接种量接种至25ml/250ml不同的ph(5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0)含15g/l葡萄糖的tb培养基中发酵，在37℃发酵28小时后测定酶活及od
600
。重组菌在初始ph为7的培养基中菌体量最大，相对酶活最高，可达0.925u
·
ml-1
。ph的过高或过低都使得菌体量与酶活下降。
[0072]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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