基于西瓜花叶病毒保守区域的RPA检测引物、检测方法及其应用与流程

基于西瓜花叶病毒保守区域的rpa检测引物、检测方法及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，尤其涉及一种基于西瓜花叶病毒保守区域的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,rpa)检测引物、及基于所述rpa检测引物的西瓜花叶病毒的rpa快速检测方法、基于西瓜花叶病毒保守区域的rpa检测引物在制备西瓜花叶病毒检测试剂盒中的应用。


背景技术：

[0002]
大豆是世界上重要的植物油和蛋白来源，在其生长周期中，常常遭受多种病虫害的侵害。西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus,wmv)是一种对大豆危害较大的病毒性病害，严重影响大豆产量和品质。wmv侵染植株以后会导致叶片花叶、畸形、新生叶片扭曲、植株矮化及果实畸形等，造成大豆产量损失约35％-50％，甚至绝收。
[0003]
wmv属于马铃薯y病毒科(potyviridae)马铃薯y病毒属(potyvirus)，可由叶片汁液摩擦接种传毒，也可由蚜虫传毒进行非持久传毒。目前，生产上还没有特效药防治病毒病。因此，建立高效、快速、实用的病毒检测技术，加强对wmv的监测和诊断，对西瓜花叶病毒病的防控具有重要的意义。
[0004]
目前检测wmv的主要是传统的酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,elisa)检测方法和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)分子检测方法。传统的血清学检测假阳性率较高，pcr检测方法需要精密的多种专业仪器配合使用，且扩增时间较长。
[0005]
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,lamp)是一种快速、灵敏、特异和可视化的检测技术，该技术采用4条特异引物识别靶序列上6个特异区，利用dna链置换聚合酶在恒温条件下对靶基因扩增，具有便捷、快速、准确等优点，但lamp对引物的条件要求较高，且在检测过程中产生易气溶胶，出现假阳性。
[0006]
rpa是一项新型的等温扩增技术，其主要原理为利用重组酶和引物在模板上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链结合蛋白的帮助下使模板解链，引物与模板开始配对，并在聚合酶的作用下复制延伸。该方法仅需1对引物即可完成扩增，不需要复杂的引物设计过程，只需要37℃下恒温反应，不需要特殊的热循环设备，反应时间短，扩增产物有特定大小的条带，结果易于判断。rpa与荧光定量pcr技术(quantitative real-time pcr,qpcr)相结合，通过在反应体系汇总加入特定类型的荧光染料，可以达到实时荧光检测。
[0007]
wmv基因组全长10000多碱基，通过自身编码的蛋白酶切割加工，形成10个不同功能的成熟蛋白，从n端到c端依次为p1、hc-pro、p3、6k1、ci、6k2、nia-vpg、nia-pro、nib和cp。研究发现，不同地区基因组具有多样性，并且存在不同病毒种之间的基因重组。因此，通过鉴定wmv序列的保守片段，设计等温扩增引物，则会有效控制假阴性的出现，大大提高检测的准确性，能够更有效的筛查防控该病毒的发生危害。
[0008]
综上，由于rpa检测技术灵敏、特异、快速及不需要特殊仪器(恒温即可)等优点，在
植物病原菌检测上得到了广泛的应用。而应用该技术对侵染大豆的wmv进行检测还未见报道，因此建立基于wmv保守区域的rpa快速检测技术在大豆病毒快速诊断中具有广泛的应用前景。


技术实现要素：

[0009]
针对现有西瓜花叶病毒检测灵敏度低下的技术问题，本发明提供一种基于西瓜花叶病毒保守区域的rpa检测引物，一种基于所述rpa检测引物的西瓜花叶病毒的rpa快速检测方法、一种基于西瓜花叶病毒保守区域的rpa检测引物在制备西瓜花叶病毒检测试剂盒中的应用，所述rpa快速检测方法灵敏高、特异性强、检测速度快。
[0010]
本发明采用以下技术方案实现：
[0011]
一种基于西瓜花叶病毒保守区域的rpa检测引物，所述rpa检测引物包括上游引物f以及下游引物r；所述上游引物f的核苷酸序列为：5'-cttctataacatggcaattgaaaaggtttactcc-3'；所述下游引物r的核苷酸序列为：5'-cttcawttctyttatgcatgtgyacgaacgc-3'。
[0012]
作为上述方案的进一步改进，所述rpa检测引物是基于多条西瓜花叶病毒全基因组序列比对筛选得到的保守片段设计得到的。
[0013]
进一步地，所述设计方法为：
[0014]
通过对所述多条西瓜花叶病毒全基因组序列进行多序列比对鉴定筛选得到长度约300bp到500bp的保守片段；
[0015]
根据所述保守片段得到所述上游引物f与所述下游引物r。
[0016]
再进一步地，所述保守片段的筛选方式为：在ncbi数据库中检索获得多条西瓜花叶病毒全基因组序列，所述保守片段包含在每条西瓜花叶病毒全基因组序列中。
[0017]
本发明还提供一种西瓜花叶病毒的rpa快速检测方法，其利用上述任意一种基于西瓜花叶病毒保守区域的rpa检测引物来检测待测植物中的西瓜花叶病毒，所述检测方法包括以下步骤：
[0018]
rna提取及反转录；抽提样本即所述待测植物的rna并将其反转录成cdna；
[0019]
扩增反应：以cdna为模板采用所述rpa检测引物进行恒温扩增反应；
[0020]
判断：所述恒温扩增反应结束后判断所述待测植物的检测结果是阳性还是阴性。
[0021]
作为上述方案的进一步改进，所述恒温扩增反应的反应体系以cdna∶rpa缓冲液∶上游引物f∶下游引物r∶荧光定量试剂∶双蒸水∶280mmol/l醋酸镁溶液按照以下比例混合：2μl∶29.5μl∶2.2μl∶2.2μl∶6.6μl∶5.0μl∶2.5μl；将所述反应体系加入到冻干酶粉中。
[0022]
进一步地，所述恒温扩增反应的扩增条件：将加有所述反应体系的冻干酶粉放入等温扩增荧光反应。
[0023]
再进一步地，温扩增荧光反应的条件如下：第一步，39℃预热40s；第二步，40个循环，每个循环39℃持续30s。
[0024]
进一步地，所述恒温扩增反应结束后，如有扩增曲线出现，出峰时间≤15min，ct值≤35，则判断为阳性；如无扩增曲线出现，出峰时间>15min，ct值>35，判断为阴性。
[0025]
本发明还提供上述任意基于西瓜花叶病毒保守区域的rpa检测引物在制备西瓜花叶病毒检测试剂盒中的应用。
[0026]
本发明具有以下有益效果：
[0027]
1、本发明针对西瓜花叶病毒的保守结构，设计了rpa检测引物，即上游引物f以及下游引物r，与常规pcr设计的引物相比，本发明的引物具有特异性高、灵敏度好的明显优势，在大豆病毒快速诊断中具有广泛的应用前景。
[0028]
2、而且本发明针对西瓜花叶病毒全基因序列的保守片段，设计的基于rpa技术的引物，能有效控制假阳性、假阴性的出现，大大提高检测的准确性，能够更有效的筛查防控该病毒的发生危害。
[0029]
3、本发明建立在分子生物学基础上，先基于西瓜花叶病毒保守结构设计了特定引物，该区域不仅高度保守，而且对其它病原高度特异，再应用荧光型重组酶聚合酶扩增的方法完成了快速检测西瓜花叶病毒的操作，该技术敏感性高，特异性强，诊断准确，整个检测过程只需30分钟，结果的判定只需观察荧光扩增条带的结果即可，操作极其简便。
附图说明
[0030]
图1为本发明实施例提供的西瓜花叶病毒的rpa快速检测方法的流程图。
[0031]
图2为图1中扩增反应结束的结果图。
[0032]
图3为采用图1中rpa快速检测方法分别检测西瓜花叶病毒、大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,smv)、菜豆普通花叶病毒(bean common mosaic virus,bcmv)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,cmv)、番茄黄叶曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,tylcv)的结果图。
[0033]
图4为图1中采用不同浓度的cdna为模板进行扩增反应的结果图。序列表说明(序列表内容单独提供)
[0034]
seq id no.1所示为本发明实施例中上游引物f的核苷酸序列；
[0035]
seq id no.2所示为本发明实施例中下游引物r的核苷酸序列。
具体实施方式
[0036]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0037]
实施例1
[0038]
本实施例提供了一种基于西瓜花叶病毒保守区域的rpa检测引物，该rpa检测引物包括seq id no:1所示的上游引物f，以及seq id no:2所示的下游引物r。具体地，上游引物f的核苷酸序列为：5'-cttctataacatggcaattgaaaaggtttactcc-3'；下游引物r的核苷酸序列为：5'-cttcawttctyttatgcatgtgyacgaacgc-3'。
[0039]
所述rpa检测引物是基于多条西瓜花叶病毒全基因组序列比对筛选得到的保守片段设计得到的。所述设计方法为：通过对所述多条西瓜花叶病毒全基因组序列进行多序列比对鉴定筛选得到长度约300bp到500bp的保守片段；根据所述保守片段得到所述上游引物f与所述下游引物r。其中，所述保守片段的筛选方式为：在ncbi数据库中检索获得多条西瓜花叶病毒全基因组序列，所述保守片段包含在每条西瓜花叶病毒全基因组序列中。
[0040]
本发明针对西瓜花叶病毒的保守结构，设计了rpa检测引物，即上游引物f以及下游引物r，与常规pcr设计的引物相比，本发明的引物具有特异性高、灵敏度好的明显优势，
在大豆病毒快速诊断中具有广泛的应用前景。
[0041]
实施例2
[0042]
实施例1的rpa检测引物是基于多条西瓜花叶病毒全基因组序列比对筛选得到的保守片段设计得到的。在本实施例中，针对实施例1的rpa检测引物的设计方法做详细的介绍，应用该设计方法获得的rpa检测引物灵敏度高、对其它病原高度特异。
[0043]
该设计方法包括以下步骤。
[0044]
首先，通过对wmv基因组进行多序列比对鉴定筛选得到长度约300bp到500bp的保守片段。
[0045]
在本实施例中，通过对wmv基因组进行多序列比对鉴定筛选得到保守片段：在ncbi数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)通过对34条wmv全基因组序列进行比对分析(genbank id见表1)。
[0046]
表1 34个wmv全基因组序列genbank id
[0047]
eu660578.1jf273458.1km597071.1kt992092.1ku240105.1eu660580.1jf273459.1kt992072.1ku240095.1ku240106.1eu660582.1jf273461.1kt992075.1ku240098.1ku240108.1eu660587.1jf273462.1kt992076.1ku240101.1ku240109.1eu660589.1jf273469.1kt992078.1ku240102.1ku240110.1eu660590.1kc292915.1kt992081.1ku240103.1kx512320.1hq384216.1km597070.1kt992083.1ku240104.1 [0048]
通过muscle算法对34条wmv全基因组序列进行多序列比对，选择长度约300bp到500bp保守片段。本实施例中保守片段的结果鉴定到扩增长度369bp的片段。
[0049]
其次，根据所述保守片段得到所述上游引物f与所述下游引物r。
[0050]
应用primer 5.0引物设计软件对这一保守片段设计得到上游引物f与下游引物r：在ncbi数据库中检索获得多条西瓜花叶病毒全基因组序列，所述保守片段包含在每条西瓜花叶病毒全基因组序列中。上游引物与保守片段的序列完全匹配、下游引物有3个简并碱基。在生物学领域中，一个简并碱基能代替两个或两个以上的碱基。
[0051]
本发明针对西瓜花叶病毒全基因序列的保守片段，设计的基于rpa技术的引物，能有效控制假阳性、假阴性的出现，大大提高检测的准确性，能够更有效的筛查防控该病毒的发生危害。
[0052]
实施例3
[0053]
本实施例介绍了西瓜花叶病毒的rpa快速检测方法，所述rpa快速检测方法利用实施例1的基于西瓜花叶病毒保守区域的rpa检测引物来检测待测植物中的西瓜花叶病毒。
[0054]
该检测方法特异性强、诊断准确，整个检测过程只需30分钟，结果的判定只需观察扩增曲线的结果即可，操作极其简便。该rpa检测方法包括以下步骤。
[0055]
步骤一：rna提取及反转录；抽提样本即所述待测植物的rna并将其反转录成cdna。
[0056]
在本实施例中，提取待测植物的总rna，如利用全基因提取试剂盒(takara rna simple total rna kit)提取植物总rna。提取总rna的实验装置包括全基因提取试剂盒、研钵，研棒，枪头、微量离心管等。在提取总rna前要对实验装置进行预处理。该预处理包括：研钵与所述研棒放置在无水酒精中加热30分钟；枪头、微量离心管(eppendorf管)均用10％
depc水于37℃浸泡过夜，之后进行高压灭菌。该预处理能够避免实验装置中rna分解酶的污染，从而避免rna分解酶分解所要提取的总rna。然后，以所述总rna为模板，用于反转录获得cdna。
[0057]
步骤二：扩增反应：以cdna为模板采用所述rpa检测引物进行恒温扩增反应。
[0058]
所述恒温扩增反应的反应体系以cdna∶rpa缓冲液∶上游引物f∶下游引物r∶荧光定量试剂∶双蒸水∶280mmol/l醋酸镁溶液按照以下比例混合：2μl∶29.5μl∶2.2μl∶2.2μl∶6.6μl∶5.0μl∶2.5μl；将所述反应体系加入到冻干酶粉中。所述恒温扩增反应的扩增条件：将加有所述反应体系的冻干酶粉放入等温扩增荧光反应，其中，温扩增荧光反应的条件如下：第一步，39℃预热40s；第二步，40个循环，39℃持续30s。其中，39℃持续30s是指1个循环，之所以设置40个循环，是为了计算荧光定量的ct值，从而根据ct值判定扩增结果。
[0059]
本实施例中rpa扩增的反应体系包括50μl体系与冻干酶粉；所述50μl体系中cdna、rpa缓冲液、上游引物f、下游引物r、荧光定量试剂、双蒸水与280mmol/l醋酸镁溶液以2μl∶29.5μl∶2.2μl∶2.2μl∶6.6μl∶5.0μl∶2.5μl的比例混合；50μl体系加入到冻干酶粉中。
[0060]
本实施例中rpa扩增的反应条件为：rpa扩增的反应体系39℃预热40s后，在39℃下进行40次循环，40次所述扩增循环中每个循环的持续时间为30s。扩增循环次数可根据本领域技术人员的需要及经验设置。
[0061]
步骤三：判断：所述恒温扩增反应结束后判断所述待测植物的检测结果是阳性还是阴性。
[0062]
rpa扩增的反应结束后，直接观察扩增曲线，根据所述扩增曲线判断所述待测植物是否感染所述西瓜花叶病毒。所述判断方法为：请参阅图2，图2为该rpa检测方法建立的结果图，当扩增曲线中有典型的扩增曲线出现，出峰时间≤15min，ct值≤35，则该扩增曲线为西瓜花叶病毒的扩增曲线，判断所述待测植物感染所述西瓜花叶病毒；当扩增曲线中无扩增曲线出现，出峰时间>15min，ct值>35，则该扩增曲线为阴性对照的扩增曲线，判断所述待测植物未感染所述西瓜花叶病毒。在生物学领域中，ct值表示扩增过程中，扩增的产物的荧光信号达到设定的阙值时所经过的扩增循环次数。
[0063]
综上所述，在本实施例中，应用重组酶聚合酶(recombinase polymerase),在恒温条件下快速对靶基因进行rpa扩增检测。其中，具体步骤如下：
[0064]
步骤1：根据genbank公布的muscle算法获得的保守的wmv片段设计引物，所述引物对具体为：上游引物f：5'-cttctataacatggcaattgaaaaggtttactcc-3'，如seq id no:1所示；下游引物r：5'-cttcawttctyttatgcatgtgyacgaacgc-3'，如seq id no:2所示。上游引物与目标序列完全匹配、下游引物仅有3个简并碱基，由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。
[0065]
步骤2：rna提取：利用takara rna simple total rna kit提取植物总rna，rna提取前所有的枪头和eppendorf管都均用10％depc水于37℃浸泡过夜，高压灭菌；研钵，研棒等放于小托盘中用无水酒精烧30min。
[0066]
步骤3：反转录：以步骤2抽提的样本rna为模板，将其反转录成cdna。
[0067]
步骤4：rpa扩增：以经步骤3处理所得的cdna为模板，并以步骤1中获得的1对引物进行rpa扩增。
[0068]
步骤5：rpa反应的反应体系包括50μl体系与冻干酶粉；所述50μl体系中cdna、rpa
缓冲液、上游引物f、下游引物r、荧光定量试剂、双蒸水与280mmol/l醋酸镁溶液以2μl∶29.5μl∶2.2μl∶2.2μl∶6.6μl∶5.0μl∶2.5μl的比例混合；50μl体系加入到冻干酶粉中。扩增体系包括第一步，39℃预热40s；第二步，40个循环，39℃持续30s。rpa反应结束后，直接观察扩增曲线。具体实验结果如图2所示，其为rpa检测方法建立的结果图，图中的扩增曲线分别为：西瓜花叶病毒、阴性对照，rpa产物为具有明显扩增峰值的曲线，而阴性对照不产生扩增曲线。
[0069]
实施例4
[0070]
本实施例介绍了一种测试剂盒，其体现为实施例1的rpa检测引物在制备西瓜花叶病毒检测试剂盒中的应用。
[0071]
本实施例提供的rpa检测试剂盒适合在田间豆科或葫芦科植物生产中开展实地检测，快速、灵敏、特异性强地检测植物中是否感染西瓜花叶病毒，从而保障植物健康生产。
[0072]
实施例5
[0073]
本实施例通过对西瓜花叶病毒、大豆花叶病毒、菜豆普通花叶病毒、西瓜花叶病毒、番茄黄化曲叶病毒分别采用实施例3中的rpa检测方法，以特异性验证方式来证明本发明提供的基于西瓜花叶病毒保守区域的rpa检测方法的特异性。
[0074]
提取感染wmv阳性样品的总rna、smv阳性样品的总rna、bcmv阳性样品、cmv阳性样品、tylcv的阳性样品的总rna，将其反转录成cdna，利用rpa反应体系对其进行特异性检测。
[0075]
检测结果参阅图3所示，其为特异性实验结果图，图中的扩增曲线分别为：wmv、smv、bcmv、cmv、tylcv。图3中，只有wmv的检测结果有明显扩增峰值的曲线，其他样品不产生扩增曲线，说明建立的rpa检测方法对wmv的检测具有较好的特异性。
[0076]
实施例6
[0077]
为了考察本发明西瓜花叶病毒的rpa检测方法的灵敏度，申请人对实施例3的西瓜花叶病毒的rpa快速检测方法中步骤2的cdna样品采用10倍浓度系列稀释法将其稀释成浓度分别为101ng/μl、100ng/μl、10-1
ng/μl、10-2
ng/μl、10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl、和10-6
ng/μl共8个不同浓度梯度。按照实施案例3中的步骤2进行rpa反应即扩增反应。在rpa反应结束后，对荧光扩增曲线进行观察，如果出现rpa扩增曲线判断为阳性，没有出现扩增曲线判断为阴性。检测结果如图4所示，其为rpa灵敏度实验结果图，图中由左至右cdna的稀释度依次分别为101ng/μl、100ng/μl、10-1
ng/μl、10-2
ng/μl、10-3
ng/μl、10-4
ng/μl、10-5
ng/μl、和10-6
ng/μl。从图4中可知：西瓜花叶病毒rpa灵敏性检测，检测灵敏度可达10-4
ng/μl，具有很高的灵敏度。
[0078]
综上所述，本发明建立在分子生物学基础上，先基于西瓜花叶病毒保守结构设计了特定引物，该区域不仅高度保守，而且对其它病原高度特异，再应用荧光型重组酶聚合酶扩增的方法完成了快速检测西瓜花叶病毒的操作，该技术敏感性高，特异性强，诊断准确，整个检测过程只需30分钟，结果的判定只需观察荧光扩增条带的结果即可，操作极其简便。
[0079]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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