规模化生产凝血酶调节蛋白的方法与流程

[0001]
本发明涉及蛋白分离提取技术领域，尤其是涉及规模化生产凝血酶调节蛋白的方法。


背景技术：

[0002]
人溶解型凝血酶调节蛋白(thrombomodulin，简称tm)主要存在于人血浆和人尿液中，是由557个氨基酸残基构成的糖蛋白，分子量约为60,300d，等电点约为3.8，最初由n.l.esmon等于1981年在实验中发现，其结构包括一个氨基端的植物凝集样结构域，6个重复排列的内皮生长因子(endothelial growth factor，egf)样结构域，一个丝氨酸/苏氨酸富集区(疏水区域)，一个跨膜区和一个短的细胞内尾端。临床上tm主要用于凝血系统紊乱而致的弥散性血管内凝血(dic)。
[0003]
1993年，已有文献报道可以从尿液中分离纯化tm。例如yamamoto等纯化tm的过程使用了qae交联葡聚糖，抗tm单克隆抗体柱，凝血酶作为配体的亲和柱和交联葡聚糖g-200，但由于此方法需要制备单克隆抗体，过程较为复杂。再如d.e.jackson等纯化tm时结合使用了deae琼脂糖凝胶，凝血酶作为配体的亲和柱和反向hplc，此方法中反向hplc产量低且不适于大规模纯化，另外，aoki等(日本专利申请公开no.sho-63-30423)和kunihiro等(日本专利申请公开no.sho-63-218399)报道了从新鲜尿液中纯化tm的方法，使用了离子交换色谱，凝血酶结合的亲和柱和凝胶渗透，结果证明当tm含量很低时，此方法不适用。综上可以看出目前从人尿中提取tm的各种纯化方法均表现为产量低且不适于大规模工业化生产，寻找适于工业化放大生产的分离纯化技术，实现规模化、高纯度的尿蛋白tm生产，成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供规模化生产凝血酶调节蛋白的方法，适于工业化放大生产凝血酶调节蛋白。
[0005]
为实现上述目的，本发明规模化生产凝血酶调节蛋白的方法采用的技术方案是：
[0006]
一种规模化生产凝血酶调节蛋白的方法，包括将凝血酶调节蛋白粗制品经过阴离子交换层析柱、亲和层析柱a、复合型亲和层析柱b、凝血酶亲和层析柱和疏水层析柱层析，收集洗脱峰，超滤浓缩得到凝血酶调节蛋白精制品。
[0007]
所述凝血酶调节蛋白粗制品是指经过硫酸铵沉淀的，比活性不低于1.0ug/e280的粗制品，上样前，超滤浓缩，调节ph为6.0-9.0，电导0.2-2ms/cm。
[0008]
阴离子交换层析柱平衡缓冲液平衡后，上样凝血酶调节蛋白粗品，冲洗液冲洗，洗脱液洗脱，收集样品洗脱液，平衡缓冲液为0.05-0.25mol/l磷酸盐缓冲液或tris缓冲液，含0-0.1mnacl，ph为6.0-9.0，冲洗液为0.05-0.25mol/l磷酸盐或者醋酸盐缓冲液，含0.1-0.3mol/l nacl，ph为6.0-9.0，洗脱液为0.10-0.30mol/l磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，含0.1-0.5mnacl，ph为5.0-6.0。
[0009]
作为优选，平衡液为0.10mol/l磷酸盐，含0.05mnacl，ph为6.0，洗脱液为0.20m醋酸盐缓冲液，含0.4mnacl，ph为5.0。冲洗液为0.15mol/l磷酸盐缓冲液，含0.2mol/l nacl，ph为6.0。
[0010]
凝血酶调节蛋白粗制品的上样液中以及阴离子交换层析柱纯化过程中的平衡缓冲溶液中均加入蛋白保护剂。作为优选，蛋白保护剂为10-20mm苄脒盐酸盐或10-25g/l甘露醇/甘氨酸。
[0011]
所述阴离子交换层析柱为弱阴离子交换树脂层析柱或强阴离子交换树脂层析柱。
[0012]
阴离子交换层析柱层析后的样品洗脱液经过10-30kda超滤膜超滤，调节ph为5.0-8.0，电导低于平衡液电导2-3ms/cm，上样平衡好的亲和层析柱a柱层析纯化，平衡液为0.02-0.2mol/l醋酸盐或磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液含0-0.5mol/lnacl，ph为4.0-7.0，收集样品穿透液。
[0013]
作为优选，平衡液为0.10mol/l醋酸盐缓冲液，含0.1mol/lnacl，ph为6.0。
[0014]
所述亲和层析柱a配基是活性染料的复合型亲和柱，活性染料为blue sepharose 6fast flow、af red-650ml。该类填料在亲和作用为主导的前提下，含有部分疏水和离子性质。
[0015]
亲和层析柱a的样品穿透液经过10-30kda超滤膜超滤，调节ph为5.0-8.0，电导低于平衡液电导2-3ms/cm，上样平衡液平衡好的复合型亲和层析柱b层析纯化，上样结束后用ph为5.0-8.0的平衡液冲洗，然后冲洗液继续冲洗，最后用洗脱液洗脱，收集样品洗脱液，平衡液为含有0-0.1m nacl的0.05m磷酸盐缓冲液；冲洗液为ph4.0-6.0的0.05m醋酸盐缓冲液，冲洗液含有0-0.2mol/l的氯化钠；洗脱液ph为4.0-6.0的0.05m醋酸盐缓冲液，洗脱液中含有0.1-0.5m nacl。
[0016]
作为优选，平衡液为0.05m磷酸盐缓冲液，ph7.0，含有0.05mnacl，冲洗液为0.05m磷酸盐缓冲液，ph6.0，含有0.1mnacl，洗脱液为0.05m醋酸盐缓冲液，ph5.0，含有0.3mnacl。
[0017]
所述复合型亲和层析柱b配基是苯甲脒的亲和层析柱。
[0018]
采用平衡好的凝血酶亲和层析柱，上样复合型亲和层析柱b层析后的样品洗脱液，上样前调节ph5.0-8.0，上样后利用冲洗液冲洗，最后用洗脱液洗脱，收集样品洗脱液，平衡液为ph5.0-8.0，0.02-0.2m醋酸或tirs缓冲盐，含有0-0.08mnacl，冲洗液为ph5.0-8.0，0.02-0.2m醋酸或tirs缓冲盐，含有0.05-0.15mnacl，洗脱液为ph5.0-8.0，0.02-0.2m醋酸或tirs缓冲盐，含有0.2-1.0mnacl。
[0019]
作为优选，平衡液为0.05mtris，ph7.0，含有0.05mnacl，冲洗液为0.05mtris，ph7.0，含有0.15mnacl，洗脱液为0.05mtris，ph7.0，含有1.0mnacl。
[0020]
所述凝血酶亲和层析柱配基是凝血酶，凝血酶为源于人血浆、牛血浆、猪血浆和细胞表达重组型凝血酶。
[0021]
凝血酶亲和层析柱，填料为琼脂糖-凝血酶偶联复合物，琼脂糖-凝血酶偶联复合物通过湿法装柱获得亲和色谱柱。
[0022]
采用平衡好的疏水层析柱，上样凝血酶亲和层析柱层析后的样品洗脱液，上样前调节ph5.0-8.0，上样后冲洗液冲洗，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱峰，平衡液为ph5.0-8.0，0.02-0.20m醋酸或磷酸盐缓冲液，含有0.8-1.2m硫酸铵，冲洗液为ph5.0-8.0，0.02-0.20m醋酸或磷酸盐缓冲液，含有1.5-2.0mnacl，洗脱液为ph5.0-8.0，0.02-0.20m醋酸或磷酸盐
缓冲液，含有0.5-1.4mnacl。
[0023]
作为优选，平衡液为0.05mpb，ph6.0，含有1.0m硫酸铵，冲洗液为0.05mpb，ph6.0，含有2.0mnacl，洗脱液为0.05mpb，ph6.0，含有0.8mnacl。
[0024]
所述疏水层析柱的配基是苯基、丁基、丁基硫和辛基的疏水性层析填料，该填料主体构架为琼脂糖、纤维素或聚合物中的任意一种。
[0025]
本发明与现有技术相比，步骤简单方便、成本低、收率高，可大规模工业化生产，能够得到生物活性高、质量稳定的凝血酶调节蛋白，具体优势如下：
[0026]
1、通过多步亲和层析不仅可以去除大多数杂蛋白，而且可以去除没有生物活性的目标蛋白降解片段，极大地提高了目标蛋白的纯度。
[0027]
2、纯化步骤衔接紧密，纯化速度快，利于工业化放大。
[0028]
3、粗制品纯化前期加入蛋白保护剂，很好的解决初期蛋白纯化过程中活性的保持问题，防止降解，提高收率。
附图说明
[0029]
图1为本发明制备凝血酶调节蛋白流程图。
[0030]
图2为本发明实施例3凝血酶调节蛋白精制品sec-hplc检测图谱。
具体实施方式
[0031]
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0032]
一种规模化生产凝血酶调节蛋白的方法，包括如下步骤：
[0033]
1、将凝血酶调节蛋白粗制品是指经过硫酸铵沉淀的，比活性不低于1.0ug/e280的粗制品，上样前，超滤浓缩，调节ph为6.0-9.0，电导0.2-2ms/cm，加入蛋白保护剂，蛋白保护剂为10-20mm苄脒盐酸盐或10-25g/l甘露醇/甘氨酸；
[0034]
2、上样阴离子交换层析柱，阴离子交换层析柱为弱阴离子交换树脂层析柱或强阴离子交换树脂层析柱，阴离子交换层析柱平衡缓冲液为0.05-0.25mol/l磷酸盐缓冲液或tris缓冲液，含0-0.1mnacl，ph为6.0-9.0，洗脱液为0.10-0.30mol/l磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，含0.1-0.5mnacl，ph为5.0-6.0，作为优选，平衡液为0.10mol/l磷酸盐，含0.05mnacl，ph为6.0，洗脱液为0.20m醋酸盐缓冲液，含0.4mnacl，ph为5.0；洗脱液洗脱之前加入冲洗步骤，冲洗液为0.05-0.25mol/l磷酸盐或者醋酸盐缓冲液，所述缓冲液含0.1-0.3mol/l nacl，ph为6.0-9.0，作为优选，冲洗液为0.15mol/l磷酸盐缓冲液，含0.2mol/l nacl，ph为6.0；缓冲溶液中均加入蛋白保护剂，蛋白保护剂为10-20mm苄脒盐酸盐或10-25g/l甘露醇/甘氨酸；
[0035]
3、上样亲和层析柱a，亲和层析柱a配基是配基是活性染料的复合型亲和柱，活性染料为blue sepharose 6fast flow、af red-650ml。该类填料在亲和作用为主导的前提下，含有部分疏水和离子性质。阴离子交换层析柱层析后洗脱液经过10-30kda超滤膜超滤，调节ph为5.0-8.0，电导低于平衡液电导2-3ms/cm，上样亲和层析柱a柱层析纯化，样结束后用ph为5.0-8.0的平衡液冲洗，平衡液为0.02-0.2mol/l醋酸盐或磷酸盐缓冲液，所述磷酸
4ff转移到含有凝血酶的偶联缓冲液中，得到琼脂糖-凝血酶偶联复合物；
[0046]
(4)封闭活性基团，步骤(3)所得琼脂糖-凝血酶偶联复合物，抽滤除去未反应的凝血酶，然后转入含有甘氨酸(0.1m)的偶联缓冲液(偶联缓冲液为0.1mol/l的nahco3，含有0.5mol/l的nacl,ph为8.3)中，封闭所有残留的活性基团；
[0047]
(5)洗涤，依次用含有nacl的醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1mol/l的醋酸-醋酸钠，内含0.5mol/l的nacl，ph为4.0)和含有nacl的tris-hcl缓冲液(0.1mol/l的tris-hcl，内含0.5mol/l的nacl，ph为8.0)分别洗涤步骤(4)所得琼脂糖-凝血酶偶联复合物，除去偶联后未偶联上的多余的配体；
[0048]
(6)凝血酶去活处理，用20mm tris-hcl，ph7.5缓冲液将aebsf溶解，将其加入步骤(5)所得琼脂糖-凝血酶偶联复合物，轻柔震荡1.5-2.5小时后使用纯水冲洗，制得凝血酶亲和填料；
[0049]
(7)装柱，采用湿法装柱，取空柱管，装好底层筛板，先将空柱管注满纯水，打开下端流出管，使水自然流出，排出柱底部气泡，步骤(6)获得的缓冲液悬浮的填料一次性倒入柱管内，连接好管路，冰箱4℃保存。
[0050]
实施例1：
[0051]
称取5g凝血酶调节蛋白粗制品，加入终浓度10mm的苄脒盐酸盐，10倍纯水搅拌溶解10min，4000rpm离心10min取上清液，调节ph6.0，电导低于平衡液电导2-3ms/cm，上样已平衡好的qae-琼脂糖凝胶柱，平衡缓冲液为ph 6.0 0.10m磷酸盐缓冲液，含0.05mnacl，10mm苄脒盐酸盐，上样结束后用平衡液冲洗4倍柱体积，再用冲洗液(ph6.0 0.15m磷酸盐缓冲液，含0.2m nacl，10mm苄脒盐酸盐)冲洗5倍柱体积，最后用洗脱液ph5.0 0.20m醋酸盐缓冲液，含0.4mnacl，10mm苄脒盐酸盐洗脱5倍柱体积。
[0052]
收集洗脱液，用30kd超滤膜浓缩，调节电导低于blue sepharose 6fast flow平衡液电导，ph为6.0，上样blue sepharose 6fast flow层析柱，平衡液为ph6.0，0.10m磷酸盐缓冲液，含0.1mnacl，上样结束后收集样品穿透液。
[0053]
将上述样品穿透液调节ph6.0，上样已平衡好的苯甲脒亲和层析柱，苯甲脒亲和层析柱预先用ph7.0，0.05m磷酸盐缓冲液，含有0.05mnacl的平衡液平衡，上样结束后用平衡液冲洗4倍柱体积，再用ph6.0，0.05m磷酸盐缓冲液含有0.1mnacl的冲洗液冲洗5倍柱体积，最后用ph5.0，0.05m醋酸盐缓冲液，含有0.3mnacl的洗脱液洗脱6倍柱体积，收集样品洗脱液。
[0054]
凝血酶亲和层析柱预先用平衡液平衡5-7倍柱体积，平衡液为ph7.0，0.05m tirs缓冲盐，含有0.05mnacl，上样，上样结束后用平衡液冲洗4倍柱体积之后，再用ph7.0，0.05m tirs缓冲盐，含有0.15mnacl的冲洗液冲洗5-6倍柱体积，再用ph7.0 0.05mtris，含有1.0mnacl的洗脱液洗脱5-10倍柱体积，收集洗脱峰。
[0055]
采用平衡好的疏水层析柱，上样凝血酶亲和层析洗脱液，调节ph6.0，平衡液为ph6.0 0.05m磷酸盐缓冲液，含有1.0m硫酸铵，上样结束后用平衡液冲洗3-5倍柱体积，再用ph6.0 0.05mpb，含有2.0mnacl的冲洗液冲洗5-6倍柱体积，最后用ph6.0 0.05mpb，含有0.8mnacl的洗脱液洗脱5倍柱体积，收集洗脱峰，将该洗脱峰用10kda超滤膜超滤浓缩得到凝血酶调节蛋白精制品。
[0056]
实施例2：
tirs缓冲盐，含有0.15mnacl的冲洗液冲洗5-6倍柱体积，再用ph7.0 0.05mtris，含有1.0mnacl的洗脱液洗脱5-10倍柱体积，收集洗脱峰。
[0067]
采用平衡好的疏水层析柱，上样凝血酶亲和层析洗脱液，调节ph6.0，平衡液为ph6.0 0.05m磷酸盐缓冲液，含有1.0m硫酸铵，上样结束后用平衡液冲洗3-5倍柱体积，再用ph6.0 0.05mpb，含有2.0mnacl的冲洗液冲洗5-6倍柱体积，最后用ph6.0 0.05mpb，含有0.8mnacl的洗脱液洗脱5倍柱体积，收集洗脱峰，将该洗脱峰用10kda超滤膜超滤浓缩得到凝血酶调节蛋白精制品。

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