一种耐高温酸性脂肪酶LIP及其基因和应用的制作方法

一种耐高温酸性脂肪酶lip及其基因和应用
技术领域
[0001]
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温酸性脂肪酶lip及其基因、包含该基因的重组载体和应用。


背景技术：

[0002]
脂肪酶(lipase ec 3 1.1.3)又叫甘油酯水解酶，催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油二酯或甘油一酯或甘油。微生物脂肪酶，又称三酰基甘油酰基水解酶，是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯键的酶。脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，只作用于异相系统，即只在油水界面上作用，而且只有当底物以微粒、小聚合分散状态或呈乳化颗粒时，脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用。脂肪酶的最佳作用条件与酶的来源关系很大。微生物脂肪酶的最适用条件为ph7.0，温度37℃，可被钙离子、低浓度胆盐激话。而动物性脂肪酶的最佳条件是ph9.0,温度37℃，可被油酸钙、白朊和胆盐激活。脂肪酶广泛存在于自然界，几乎所有的动物器官中都含有脂肪酶，脂肪酶还存在于许多植物、细菌和真菌中。脂肪酶的生产方法有三种：提取法，化学合成法和发酵法。化学合成法由于实验技术等条件的限制，目前尚处于研究阶段，提取法由于动植物器官和组织较少而大受限制，而微生物发酵法是脂肪酶生产的主要方法。
[0003]
微生物脂肪酶发挥活力一般不需要辅因子，但是二价阳离子，如钙离子经常能刺激酶活，这是由于钙离子能促进长链脂肪酸钙盐的形成。此外，脂肪酶的活力还被重金属离子，如钴离子、镍离子和锡离子强烈抑制，但被锌离子和镁离子轻微抑制。gupta等(2001)把微生物脂肪酶可分为三大类∶即非特异性脂肪酶、特异选择性脂肪酶和底物特异性基础上的脂肪酸特异性脂肪酶。非特异性脂防酶随机作用于甘油三酯、甘油三酯被完全水解为脂防酸和甘油。与此相反，特异性脂肪酶是1.3位特异性脂防酶，只水解甘油三酯c1和c3酯键，从而产生游离脂肪酸、1.2-甘油二酯、2、3-甘油二酯和2-甘油单脂。细菌胞外脂肪酶是特异性的脂肪酶。第三类脂肪酶包含脂肪酸特异性的脂肪酶，它表现为明显的脂肪酸优先水解性。
[0004]
虽然许多研究者在通过微生物筛选获取优质的脂肪酶方面已取得令人满意的结果。但将来使用基因工程菌生产脂肪酶会占主导地位，因为工程菌将实现为特定应用领域生产适合的具有显著特性的脂肪酶。目前脂肪酶虽然已经有商品出售，但是由于产量较低，生产成本高，使得其应用受到限制。因此开发酶活力高、性质优良及生产成本低的脂肪酶就成了当务之急。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种能够高效应用的耐高温酸性脂肪酶。
[0006]
本发明的再一目的是提供编码上述耐高温酸性脂肪酶的基因。
[0007]
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0008]
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0009]
本发明的另一目的是提供一种制备上述耐高温酸性脂肪酶的基因工程方法。
[0010]
本发明的另一目的提供上述耐高温酸性脂肪酶的应用。
[0011]
本发明从黑曲霉aspergillus niger cicc 2103中克隆得到一个新的脂肪酶基因，其编码的脂肪酶在酸性和中性条件下具有较高的酶活力，并且其最适温度为55℃，最适ph为4.5，且在70℃条件下具有较好的热稳定性。
[0012]
本发明提供了一种耐高温酸性脂肪酶lip，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0013]
seq id no.1：
[0014][0015]
其中，该酶基因编码287个氨基酸和一个终止密码子，n端19个氨基酸为其预测的信号肽序列“mfsgrfgvll talaalsaa”(seq id no.3)。因此，成熟的脂肪酶lip的理论分子量为29.5kda，其氨基酸序列如seq id no.2所示：
[0016][0017][0018]
本发明的脂肪酶lip具有较好的热稳定性，在偏酸性和中性的范围内均具有较高活性，最适反应ph 4.5，最适反应温度55℃。
[0019]
本发明提供了编码上述脂肪酶基因lipl75。具体地，该基因的碱基序列如seq id no.4所示：
[0020][0021]
本发明通过pcr的方法分离克隆了脂肪酶基因lipl75，全序列分析结果表明，脂肪酶lip的结构基因lipl75全长873bp。其中，信号肽的碱基序列为：atgttttctg gtagatttgg tgttttgttg actgctttgg ctgctttgtc tgctgct(seq id no.6)。因此，成熟的脂肪酶lip基因长816bp，其碱基序列如seq id no.5所示：
[0022]
[0023][0024]
将脂肪酶基因lipl75序列及推导出的氨基酸序列在genbank中进行blast比对，该基因与来源于aspergillus niger cbs 513.88的脂肪酶氨基酸序列一致性为72％。说明本发明的脂肪酶lip是一种新的脂肪酶。
[0025]
本发明还提供了包含上述脂肪酶基因lipl75的重组载体，优选为ppic-lipl75。将本发明的脂肪酶基因去掉信号肽后插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的脂肪酶基因插入到质粒ppic9上的ecor i和not i限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于aox1启动子的下游并受其调控，得到重组脂肪酶表达质粒ppic9-lipl75。
[0026]
本发明还提供了包含上述脂肪酶基因lipl75的重组菌株，所述重组菌株优选为包含脂肪酶基因lipl75的大肠杆菌、酵母菌(毕赤酵母菌、红冬孢酵母菌等)、芽孢杆菌或乳酸杆菌，进一步地优选可以为重组毕赤酵母菌株gs115/lipl75。
[0027]
本发明还提供了一种制备脂肪酶lip的方法，包括以下步骤：
[0028]
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0029]
2)培养重组菌株，诱导重组脂肪酶表达；
[0030]
3)回收并纯化所表达的脂肪酶lip。
[0031]
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母、红冬孢酵母细胞，优选将重组表达质粒转化毕赤酵母细胞(pichia pastoris)gs115，得到重组菌株gs115/lipl75。
[0032]
本发明还分别提供了上述耐高温酸性脂肪酶lip、耐高温酸性脂肪酶基因lipl75、包含耐高温酸性脂肪酶基因lipl75的重组载体与重组菌株的应用，尤其是在饲料、食品、洗涤、酿造及烘焙等领域中应用。
[0033]
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、洗涤、酿造及烘焙中应用新型脂肪酶。本发明的脂肪酶最适ph为4.5，属于酸性脂肪酶，更适宜在动物饲料中使用，并且在ph4～7都有较高的酶活性；ph稳定性好。在70℃条件下具有较好的热稳定性，解决了目前脂肪酶耐热性差的问题，具有更好的热稳定性和储存稳定性。
附图说明
[0034]
图1为本发明重组脂肪酶的最适ph。
[0035]
图2为本发明重组脂肪酶的ph稳定性。
[0036]
图3为本发明重组脂肪酶的最适温度。
[0037]
图4为本发明重组脂肪酶的热稳定性。
具体实施方式
[0038]
试验材料和试剂
[0039]
1、菌株及载体：本发明从黑曲霉aspergillus niger cicc 2103(购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(北京市朝阳区霄云路32号，中国食品发酵工业研究院，100027)，其保藏编号为：cicc no.2103)中分离得到一种新的脂肪酶lip。毕赤酵母表达载体ppic9及菌株gs115购自于invitrogen公司。
[0040]
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自takara公司，连接酶购自invitrogen公司。可溶性淀粉购自sigma公司，其它均为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
[0041]
3、培养基：
[0042]
(1)黑曲霉aspergillus niger cicc 2103培养基为pdb培养基：1000ml马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，ph自然。
[0043]
(2)大肠杆菌培养基lb(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％nacl,ph自然)。
[0044]
(3)bmgy培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.00004％biotin，1％甘油(v/v)。
[0045]
(4)bmmy培养基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均与bmgy相同，ph4.0。
[0046]
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第四版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0047]
实施例1黑曲霉aspergillus niger cicc 2103富集培养
[0048]
将黑曲霉富集培养(富集培养基：(nh4)2so
4 5g/l，kh2po
4 1g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，cacl
2 0.2g/l，可溶性淀粉20g/l，ph 4.5)，按常规稀释后涂布于产酶培养基((nh4)2so
4 5g/l，kh2po
4 1g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，cacl
2 0.2g/l，可溶性淀粉2％，1.5％琼脂糖，ph 4.5)平板上，30℃培养3～4d,挑取菌落在培养基平板划线分离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化。
[0049]
实施例2黑曲霉aspergillus niger cicc 2103脂肪酶编码基因的克隆
[0050]
提取aspergillus niger cicc 2103基因组dna：
[0051]
将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，液氮研磨，加入5ml裂解液，然后将研磨液置于50ml离心管中，65℃水浴锅裂解120min，每隔10min混匀一次，在4℃下12000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于-20℃下静置20min后，4℃下12000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量te溶解，置于-20℃备用。
[0052]
以黑曲霉aspergillus niger cicc 2103总dna为模板进行pcr扩增。pcr反应参数为：95℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。将基因该片段回收后与peasy-t3载体相连送测序。
[0053]
实施例3重组脂肪酶的制备
[0054]
将表达载体ppic9进行双酶切(ecor i+not i)，同时将编码脂肪酶的基因lipl75双酶切(ecor i+not i)，切出编码成熟脂肪酶的基因片段与表达载体ppic9连接，获得含有黑曲霉aspergillus niger cicc 2103脂肪酶基因lipl75的重组质粒ppic-lipl75并转化毕赤酵母gs115，获得重组毕赤酵母菌株gs115/lipl75。
[0055]
取含有重组质粒的gs115菌株，接种于300ml bmgy培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150ml bmmy培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定脂肪酶的活力。重组脂肪酶的表达量为9600u/ml。重组脂肪酶在毕赤酵母中得到了表达，重组脂肪酶的比活为6890u/mg。
[0056]
实施例4重组脂肪酶lip的性质测定
[0057]
1、重组脂肪酶lip的最适ph和ph稳定性的测定方法如下：
[0058]
将实施例3的重组脂肪酶在不同的ph下进行酶促反应以测定其最适ph。底物用不同ph的0.1mol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中55℃下进行脂肪酶活力测定。结果(图1)表明，重组酶lip的最适ph为4.5，在ph4.0～5.0有50％以上的相对酶活性。脂肪酶于上述各种不同ph的缓冲液中37℃处理60min，再在ph4.5缓冲液体系中55℃下测定酶活性，以研究酶的ph耐性。结果(图2)表明脂肪酶在ph4.0～7.0之间均很稳定，在此ph范围内处理60min后剩余酶活性在80％以上，这说明此酶在酸性和中性范围内具有较好的ph稳定性。
[0059]
2、脂肪酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：
[0060]
脂肪酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph 4.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为脂肪酶在不同温度下处理不同时间，再在55℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为55℃。酶的热稳定性试验表明(图4)，lip具有良好的热稳定性，在70℃下温育2h，能保持80％以上的酶活。
[0061]
3、不同金属离子化学试剂对lip酶活的影响测定如下：
[0062]
在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1和5mmol/l。在55℃、ph 4.5条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂在浓度为1mmol时重组脂肪酶的活力没有明显变化，只有sds微弱抑制其活力。当cu
2+
，ag
+
，和β-巯基乙醇浓度为5mmol时可以部分抑制lip酶活力，5mmol sds使其活力全部丧失。
[0063]
4、脂肪酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力测定如下：
[0064]
用ph2.0 kcl-hcl缓冲液配制0.1mg/ml胃蛋白酶，ph7.0 tris-hcl缓冲液配制0.1mg/ml胰蛋白酶。取ph2.0 kcl-hcl缓冲液稀释后的0.5ml纯化的酶液加入0.5ml胃蛋白酶，ph7.0 tris-hcl缓冲液稀释后的0.5ml纯化的酶液加入0.5ml胰蛋白酶混合，蛋白酶/脂肪酶(w/w)≈0.1，37℃保温180min取样，在ph4.5及55℃条件下测定酶活性。实验结果表明脂肪酶lip用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理180min后，胰蛋白酶处理后的lip的酶活比处理前提高了19％，胃蛋白酶处理后的lip的脂肪酶活性比处理前提高了30％。
[0065]
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

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