对白介素-23受体特异的嵌合抗原受体的制作方法

对白介素-23受体特异的嵌合抗原受体
发明领域
[0001]
本发明涉及免疫疗法领域。特别地，本发明涉及对白介素-23受体特异的嵌合抗原受体(car)，涉及表达所述car的t细胞并涉及其治疗自身免疫和/或炎性疾病或病症的用途。
[0002]
发明背景
[0003]
白介素-23(il-23)是il-12细胞因子家族的成员，由两个亚基p19和p40组成。il-23受体(il-23r)由与il-12rβ1亚基复合的il-23rα亚基组成，其是il-12受体的共同亚基，并与酪氨酸激酶2(tyk2)相互作用。il-23r与janus激酶2(jak2)组成性结合，并在被il-23激活后与stat3和stat4结合。
[0004]
il-23r主要在免疫细胞上表达，尤其是t细胞(例如th17和γδt细胞)、巨噬细胞、树突细胞和nk细胞(duvallet等人，2011)。最近已显示，未激活的嗜中性粒细胞表达基本量的il-23r，并且il-23r表达在细胞激活后增加(chen等人，2016)。
[0005]
由il-23激活的il-23r诱导il-23r磷酸化以及stat3和stat4的募集，从而形成同型二聚体，该同型二聚体一旦被磷酸化就易位至细胞核，并从而诱导转录因子rorγt的表达。rorγt转而激活下游促炎细胞因子的转录，例如参与免疫应答的激活的il-17a、il-17f、il-22、il-6和ifn-γ(razawy等人，2018、sivanesan等人，2016和duvallet等人，2011)。特别地，已经描述了il-23/il-23r信号传导途径对于促进分泌il-17的免疫细胞，尤其是cd4
+
th17细胞和γδt细胞的增殖和分化至关重要。
[0006]
在本领域中，已经将il23r的表达描述为参与自身免疫疾病和慢性炎症的出现和维持的病原性炎症细胞的共同特征。il23r的表面表达由il23暴露诱导且取决于炎症水平。在人细胞中，尽管rna水平的il23r表达已有充分证明，但关于该蛋白在细胞表面的存在以及因此关于其对于靶向剂的可用性还知之甚少。
[0007]
已经研究了il-23/il-23r信号传导途径的抑制作为针对自身免疫和炎性疾病或病症的可能治疗方法。特别地，乌司奴单抗(ustekinumab)，一种针对il-12p40亚基的抗体，已在患有克罗恩氏病(crohn
’
s disease)的非反应性患者和患有银屑病的患者上测试出了成功结果(fegan等人，2016；mease等人，2015)。乌司奴单抗在美国已被批准用于治疗银屑病。然而，一例病例报告显示，在使用乌司奴单抗治疗后，4例患者中的银屑病关节炎恶化(simon等人，2016)。
[0008]
另外，对于自身免疫和/或炎性疾病或病症的长期治疗，需要诱导耐受性，其可能在靶向细胞因子时不能获得。
[0009]
因此，仍需要一种用于抑制il-23/il-23r信号传导途径，从而治疗自身免疫和/或炎性疾病或病症的方法，该方法不存在现有技术的方法的缺点。
[0010]
申请人在本文提供了针对il-23r的嵌合抗原受体(car)和表达所述il-23r car的treg细胞群。所述treg细胞群尤其可用于治疗与表达il-23r的细胞有关的疾病或病症，特别是自身免疫和/或炎性疾病或病症。
[0011]
发明概述
[0012]
本发明涉及对至少一种il-23受体(il-23r)特异的嵌合抗原受体(car)，其中所述car包含：
[0013]
(i)细胞外结合结构域，其中所述结合结构域与所述il-23r结合，
[0014]
(ii)任选地，细胞外铰链结构域，
[0015]
(iii)跨膜结构域，
[0016]
(iv)细胞内信号传导结构域，和，
[0017]
(v)任选地，标签(tag)和/或前导序列。
[0018]
在一个实施方案中，细胞外结合结构域包含针对所述il-23r的scfv片段。
[0019]
在一个实施方案中，细胞外结合结构域包含针对所述il-23r的scfv片段，其中所述scfv包含
[0020]-具有seq id no:37的序列或与seq id no:37具有至少约70％同一性的序列的重链可变域(vh)
[0021]-具有选自包含seq id no:38、46和56以及与所述seq id no:38、46或56具有至少约70％同一性的序列或由其组成的组的序列的轻链可变域(vl)，和
[0022]-任选地，vh和vl之间的接头。
[0023]
在一个实施方案中，细胞外结合结构域包含针对所述il-23r的scfv片段，其中该scfv具有序列seq id no:55或与seq id no:55具有至少约70％同一性的序列。
[0024]
在一个实施方案中，铰链结构域是人cd8的铰链区，优选具有seq id no:13的序列或与seq id no:13具有至少约70％同一性的序列。
[0025]
在一个实施方案中，跨膜结构域是衍生自人cd8α的跨膜结构域，优选具有seq id no:21的序列或与seq id no:21具有至少约70％同一性的序列。
[0026]
在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含人4-1bb的共刺激信号传导结构域，优选具有seq id no:29的序列或与seq id no:29具有至少约70％同一性的序列，以及t细胞第一(primary)信号传导人cd3ζ，优选具有seq id no:26的序列或与seq id no:26具有至少70％同一性的序列。
[0027]
在一个实施方案中，本发明的car包含：
[0028]
(i)抗il-23r scfv，优选包含通过(g4s)3接头(seq id no:3)连接的具有seq id no:37的序列的vh和具有seq id no:38的序列的vl，
[0029]
(ii)衍生自cd8α的铰链结构域，优选seq id no:13，
[0030]
(iii)人cd8α跨膜结构域，优选seq id no:21，
[0031]
(iv)包含优选seq id no:29的人4-1bb信号传导结构域，以及优选seq id no:26的人cd3ζ结构域的细胞内信号传导结构域，和
[0032]
(v)任选地，标签和/或前导序列。
[0033]
本发明进一步涉及编码如上所述的car的核酸序列。
[0034]
本发明进一步涉及包含如上所述的核酸序列的载体。
[0035]
本发明进一步涉及经工程化以在细胞表面表达对至少一种il-23受体特异的car的t细胞群，其中所述car包含：
[0036]
(i)细胞外结合结构域，其中所述结合结构域与所述il-23r结合，
[0037]
(ii)任选地，细胞外铰链结构域，
[0038]
(iii)跨膜结构域，
[0039]
(iv)细胞内信号传导结构域，和，
[0040]
(v)任选地，标签和/或前导序列。
[0041]
在一个实施方案中，所述t细胞群是调节性t细胞群。
[0042]
在一个实施方案中，所述t细胞群是选自包含以下或由以下组成的组的treg细胞群：cd4
+
cd25
+
foxp3
+
treg、tr1细胞、分泌tgf-β的th3细胞、调节性nkt细胞、调节性γδt细胞、调节性cd8
+
t细胞和双阴调节性t细胞。
[0043]
本发明进一步涉及包含至少一个经工程化以在细胞表面表达对至少一种il-23受体特异的car的t细胞群的组合物，其中所述car包含：
[0044]
(i)细胞外结合结构域，其中所述结合结构域与所述il-23r结合，
[0045]
(ii)任选地，细胞外铰链结构域，
[0046]
(iii)跨膜结构域，
[0047]
(iv)细胞内信号传导结构域，和，
[0048]
(v)任选地，标签和/或前导序列。
[0049]
在一个实施方案中，所述组合物是药物组合物，且进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。
[0050]
本发明进一步涉及一种获得经工程化以在细胞表面表达对至少一种il-23受体特异的car的t细胞群的离体方法，其中所述car包含：
[0051]
(i)细胞外结合结构域，其中所述结合结构域与所述至少一种il-23r结合，
[0052]
(ii)任选地，细胞外铰链结构域，
[0053]
(iii)跨膜结构域，
[0054]
(iv)细胞内信号传导结构域，和，
[0055]
(v)任选地，标签和/或前导序列。
[0056]
其中所述方法包括用编码il-23r-car的核酸对至少一个t细胞进行遗传修饰，优选转导，以及任选地，被转导细胞的扩增步骤。
[0057]
本发明进一步涉及一种治疗由表达il-23r的细胞介导的疾病或病症的方法，其包括给有此需要的受试者施用至少一种经工程化以在细胞表面表达对至少一种il-23受体特异的car的t细胞群，其中所述car包含：
[0058]
(i)细胞外结合结构域，其中所述结合结构域与所述至少一种il-23r结合，
[0059]
(ii)任选地，细胞外铰链结构域，
[0060]
(iii)跨膜结构域，
[0061]
(iv)细胞内信号传导结构域，和，
[0062]
(v)任选地，标签和/或前导序列。
[0063]
本发明进一步涉及本文所述的t细胞群或本文所述的组合物，其治疗或用于治疗由表达il-23r的细胞介导的疾病或病症。
[0064]
在一个实施方案中，所述由表达il-23r的细胞介导的疾病或病症是自身免疫和/或炎性疾病或病症。
[0065]
在一个实施方案中，所述由表达il-23r的细胞介导的疾病或病症选自包含以下或由以下组成的组：炎性肠疾病(例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、系统性红斑狼疮、类风湿
性关节炎、青少年特发性关节炎、干燥综合征、系统性硬化病、强直性脊柱炎、1型糖尿病、自身免疫性甲状腺病症、多发性硬化病、重症肌无力、银屑病、银屑病关节炎或葡萄膜炎。在一个实施方案中，所述由表达il-23r的细胞介导的疾病是自身免疫和/或炎性疾病或病症，优选克罗恩氏病。
[0066]
定义
[0067]
在本发明中，以下术语具有以下含义：
[0068]-术语“一”和“一个”指本文的语法对象的一个或多个(即至少一个)。举例来说，“一个元件”指一个元件或多于一个元件。
[0069]-当涉及如量、持续时间之类的可测量值时，术语“约”旨在涵盖偏离指定值的
±
20％的变化，或在一些情况下
±
10％，或在一些情况下
±
5％，或在一些情况下
±
1％，或在一些情况下
±
0.1％，因为这样的变化适合于实施所公开的方法。
[0070]-本文所用的术语“激活”指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞应答的t细胞(例如，调节性t细胞)状态。激活也可以与例如细胞因子的产生或抑制活性的可检测的效应子功能相关。术语“激活的”调节性t细胞尤其指能够抑制免疫应答的调节性t细胞。
[0071]-本文所用的术语“抗体”指衍生自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆的，多链或单链的，或完整的免疫球蛋白，且可以衍生自天然来源或重组来源。术语“抗体”还包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性。抗体可以是免疫球蛋白分子的多聚体，例如免疫球蛋白分子的四聚体。基本的四链抗体单元是由两条相同的轻(l)链和两条相同的重(h)链组成的异四聚体糖蛋白。基于它们恒定域(cl)的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物物种的l链分为两种明显不同的类型之一，称为κ([kappa])和λ([lambda])。根据它们重链(ch)的恒定域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的种类或同种型。免疫球蛋白有五个种类：iga、igd、ige、igg和igm，具有分别命名为α([alpha])、δ([delta])、ε([epsilon])、γ([gamma])和μ([mu])的重链。基于ch序列和功能上的相对小的差异，将[gamma]和[alpha]种类进一步分成亚类，例如，人表达以下亚类：igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。每条l链通过一个共价二硫键与h链连接，而两条h链依据h链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每个h和l链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条h链在n端具有一个可变域(vh)，随后是每个[alpha]和[gamma]链的三个恒定域(ch)，以及[mu]和[epsilon]同种型的四个ch结构域。每个l链在n端均具有可变域(vl)，随后在其另一端具有恒定域(cl)。vl与vh对齐，且cl与重链的第一个恒定域(ch1)对齐。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变域之间形成界面。vh和vl的配对一起形成单个抗原结合位点。igm抗体由五个基本的异四聚体单元以及被称为j链的额外多肽组成，并因此含有十个抗原结合位点，而分泌的iga抗体可以聚合形成包含2-5个基本4链单元以及j链的多价集聚物(assemblage)。就igg而言，4链单元通常为约150,000道尔顿。有关不同种类的抗体的结构和性质，参见例如basic and clinical immunology,8th edition,daniel p.stites,abba i.terr和tristram g.parslow(eds.),appleton&lange,norwalk,conn.,1994,第71页,和第6章。
[0072]-本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，群体中包含的各个抗体是相同的，除了可少量存在的可能的天然突变。单克隆抗体是高度特异的，针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制
剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以被合成而不受其他抗体污染。修饰语“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，单克隆抗体可以通过由kohler等人,nature,256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法来制备，或可以使用重组dna方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”还可以使用例如在clackson等人,nature,352：624-628(1991)和marks等人,j.mol.biol.,222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体。
[0073]-术语“抗体片段”指完整抗体的至少一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区，其保留与抗原表位特异地相互作用(例如，通过结合、位阻、稳定/失稳、空间分布)的能力。抗体片段的示例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、fv片段、scfv抗体片段、二硫键连接的fv(sdfv)、由vh和chi结构域组成的fd片段、线性抗体、单域抗体如sdab(vl或vh)、骆驼vhh结构域、由抗体片段(例如包含在铰链区通过二硫桥连接的两个fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体以及分离的cdr或抗体的其他表位结合片段。也可以将抗原结合片段引入单域抗体、巨抗体(maxibody)、微抗体(minibody)、纳米抗体、细胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-nar和bis-scfv(参见，例如，hollinger和hudson,nature biotechnology 23:1126-1136,2005)。也可以基于诸如iii型纤连蛋白的多肽将抗原结合片段移植到支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微抗体)。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，以及一个残留的“fc”片段，该名称反映了容易结晶的能力。fab片段由完整的l链以及h链的可变区结构域(vh)和一个重链的第一恒定域(ch1)组成。每个fab片段在抗原结合方面是单价的，即，它具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大f(ab')2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫键连接的fab片段且仍能够交联抗原。fab'片段与fab片段的区别在于，其在ch1结构域的羧基末端具有包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的额外几个残基。fab'-sh是本文中fab
′
的名称，其中恒定域的半胱氨酸残基携带有游离硫醇基。f(ab')2抗体片段最初以在其之间具有铰链半胱氨酸的成对的fab'片段产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
[0074]-抗体的“fc”片段包含通过二硫键保持在一起的两条h链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由fc区中的序列决定，该区也是在某些类型的细胞上发现的fc受体(fcr)所识别的部分。
[0075]
-“
fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。这个片段由紧密地非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中产生了六个高度可变环(三个环来自h链，三个环来自l链)，其贡献了用于抗原结合的氨基酸残基并赋予了抗体的抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或仅包含三个对抗原特异的cdr的半个fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整的结合位点。
[0076]-术语“scfv”指包含至少一个含有轻链可变区的抗体片段和至少一个含有重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区是连续连接的，例如，经由合成接头，例如短的柔性多肽接头，并且能够以单链多肽表达，且其中scfv保留了其所衍生自的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用，scfv可以具有任一顺序的vl和vh可变区，
例如对于多肽的n端和c端，scfv可包含vl-接头-vh或可包含vh-接头-vl。
[0077]
-“
完整”抗体是包含抗原结合位点以及cl和至少重链恒定域ch1、ch2和ch3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如，人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。“天然序列”多核苷酸是具有与源自自然的多核苷酸相同的核苷酸序列的多核苷酸。“天然序列”多肽是具有与源自自然(例如，来自任何物种)的多肽(例如，抗体)相同的氨基酸序列的多肽。这样的天然序列多核苷酸和多肽可以从自然界中分离出来，或者可以通过重组或合成方法产生。
[0078]-术语“抗体重链”指以天然存在的构型存在于抗体分子中的两种多肽链类型中的较大者，且其通常决定了抗体所属的种类。
[0079]-术语“抗体轻链”指以天然存在的构型存在于抗体分子中的两种多肽链类型中的较小者。κ(k)和λ(λ)轻链指两种主要的抗体轻链同种型。
[0080]-术语“抗原”或“ag”指引起免疫应答的分子。这个免疫应答可涉及抗体产生，和/或特定的具有免疫能力的细胞的激活，或两者。技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白或肽，都可以充当抗原。此外，抗原可以源自重组dna或基因组dna。技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna因此均编码本文所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见地，本发明包括但不限于使用一个以上基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所需免疫应答的多肽。此外，技术人员将理解，抗原根本不必由“基因”编码。显而易见地，抗原可以被合成或源自生物样品，或者可以是多肽以外的大分子。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、细胞或具有其他生物成分的流体。
[0081]-术语“adnectin”，也称为monobody，是本领域中公知的，且指被设计为以高亲和力和特异性结合抗原的蛋白。它们属于被统称为“抗体模拟物”的分子种类。
[0082]-如本文所用，术语“α抗体(alphabody)”，也可以称为细胞穿透性α抗体，指由经工程化以结合多种抗原的10kda小蛋白组成的一类抗体模拟物。α抗体能够到达并结合细胞内蛋白靶标。
[0083]-术语“亲和体(affibody)”是本领域公知的，且指基于源自葡萄球菌蛋白a的igg结合结构域之一的58个氨基酸残基的蛋白结构域的亲和蛋白。
[0084]-术语“affilin”是本领域公知的，且指被设计为选择性结合抗原的人工蛋白。它们在对抗原的亲和力和特异性上类似于抗体，但在结构上却不相似，这使它们成为一种抗体模拟物。
[0085]-术语“anticalin”是本领域公知的，且指抗体模拟物技术，其中结合特异性源自脂质运载蛋白(lipocalin)。anticalin也可被设计为双靶向蛋白的形式，称为duocalin。
[0086]-如本文所用，术语“基于犰狳重复蛋白的支架”指对应于基于犰狳重复蛋白的人工肽结合支架的一类抗体模拟物。犰狳重复蛋白的特征在于犰狳结构域，其由介导与肽或蛋白的相互作用的约42个氨基酸的串联犰狳重复组成。
[0087]-术语“阿特里体(atrimer)”是本领域公知的，且指为了其生物活性而三聚化的靶蛋白的结合分子。与其他抗体模拟物支架相比，它们相对较大。
[0088]-术语“高亲和性多聚体(avimer)”是本领域公知的，且指抗体模拟物技术
[0089]-术语“darpin”(designed ankyrin repeat protein，经设计的锚蛋白重复蛋白)是本领域公知的，且指为利用非抗体多肽的结合能力而开发的抗体模拟物drp(designed repeat protein，经设计的重复蛋白)技术。
[0090]-术语“双抗体”指通过构建在vh和vl结构域之间的具有短接头(约5-10个残基)的scfv片段从而实现v结构域的链间配对而非链内配对而制备的小抗体片段，这产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”scfv片段的异二聚体，其中两个抗体的vh和vl结构域存在于不同的多肽链上。双抗体在例如ep 0404097；wo 93/11161；和holliger等人,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)中有更充分的描述。
[0091]-术语“evasin”是本领域公知的，且指一类趋化因子结合蛋白。
[0092]-术语“菲诺体(fynomer)”是本领域公知的，且指属于一类抗体模拟物的蛋白。归因于它们高的热稳定性和降低的免疫原性，它们是有吸引力的结合分子。
[0093]-如本文所用，术语“打结素(knottin)”(也可以称为胱氨酸结抑制剂(inhibitor cystine not))指包含含有三个二硫桥的蛋白结构基序的抗体模拟物。
[0094]-术语“库尼茨型结构域肽(domain kunitz peptide)”指一种抗体模拟物，并基于抑制蛋白酶功能的蛋白的活性结构域。
[0095]-术语“纳米抗体”是本领域公知的，且指源自抗体的治疗性蛋白，其包含天然存在的重链抗体的独特结构和功能特性。这些重链抗体包含单个可变域(vhh)和两个恒定域(ch2和ch3)。
[0096]-术语“单特异性体(unibody)”是本领域公知的，且指缺少igg4抗体的铰链区的抗体片段。铰链区的缺失产生基本上是传统igg4抗体大小的一半，并具有igg4抗体的单价结合区而不是二价结合区的分子。
[0097]-术语“versabody”是本领域公知的，且指另一种抗体模拟物技术。它们是具有＞15％半胱氨酸的3-5kda的小蛋白，其形成高二硫键密度的骨架，取代了典型蛋白具有的疏水核心。
[0098]-术语“抗原呈递细胞”或“apc”指在其表面展示与主要组织相容性复合物(mhc)复合的外源抗原的免疫系统细胞，如辅助细胞(例如b细胞、树突细胞等)。t细胞可以使用其t细胞受体(tcr)来识别这些复合物。apc处理抗原并将它们呈递给t细胞。
[0099]-术语“同种异体”指源自与向其引入物质的个体同一物种的不同个体的任何物质。当一个或多个基因座上的基因不相同时，两个或更多个个体被认为是彼此的同种异体。在一些方面，来自同一物种的个体的同种异体物质可在遗传上充分不同以抗原性地相互作用。
[0100]-术语“自体的”指源自随后向其重新引入的同一个体的任何物质。
[0101]-术语“嵌合受体或嵌合抗原受体或cr或car”指一个多肽或一组多肽，在最简单的实施方案中通常是两个，当在免疫细胞中时，其为细胞提供针对靶配体的特异性和细胞内信号产生。在一些实施方案中，该组多肽彼此邻接。在一些实施方案中，嵌合受体是包含该组多肽的嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，这组多肽包括二聚化开关，其在存在二聚化分子时可以使多肽彼此偶联，例如可以将配体结合结构域与细胞内信号传导结构域偶联。在一个实施方案中，嵌合受体在嵌合受体融合蛋白的氨基末端(n-末端)包含任选的前导序
列。在一个实施方案中，嵌合受体在细胞外配体结合结构域的n-末端进一步包含前导序列，其中在嵌合受体的细胞加工和定位于细胞膜的过程中，该前导序列任选地从配体结合结构域切离。
[0102]-术语“保守序列修饰”指不显著影响或改变包含氨基酸序列的蛋白的生物学功能的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术将修饰引入蛋白中，例如定点诱变和pcr介导的诱变。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似性质的氨基酸残基取代的方法，这样肽化学领域的技术人员将会预期多肽的二级结构和亲水性质基本不变。因此，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑了各种上述特征的示例性取代是本领域技术人员公知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进一步进行氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；且具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。其他可代表保守变化的氨基酸组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；(5)phe、tyr、trp、his。本领域中已经定义了具有相似侧链的其他氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的嵌合受体内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基所取代，并且可以使用本文所述的功能测定法检验改变的嵌合受体。
[0103]-术语“组成型”启动子指，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸有效地连接时导致基因产物在细胞的大多数或全部生理条件下产生于该细胞中的核苷酸序列。
[0104]-术语“共刺激分子”指t细胞上与共刺激配体特异性结合的同源结合配偶体，从而通过t细胞介导共刺激应答(例如但不限于增殖)。共刺激分子是细胞表面分子，而不是有助于有效免疫应答的抗原受体或其配体。共刺激信号传导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。以下蛋白家族可以代表共刺激分子：tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导性淋巴细胞激活分子(slam蛋白)和激活nk细胞受体。
[0105]-如本文所用，术语“衍生自”表示第一和第二分子之间的关系。它通常指第一分子和第二分子之间的结构相似性，而不意味着或包括对衍生自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，在衍生自cd3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，该细胞内信号传导结构域保留足够的cd3ζ结构，从而具有所需的功能，即在合适条件下产生信号的能力。它不意味着或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，这不意味着，为了提供细胞内信号传导结构域，必须以cd3ζ序列开始并删除不想要的序列，或施加突变以获得细胞内信号传导结构域。
[0106]-术语“编码”指多核苷酸(例如基因、cdna或mrna)中核苷酸的特定序列的固有性
质，以充当生物过程中合成具有指定核苷酸序列(例如rrna、trna和mrna)或指定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则基因、cdna或rna编码该蛋白。其核苷酸序列与mrna序列相同且通常在序列表中提供的编码链以及用作基因或cdna转录模板的非编码链都可称作编码该基因或cdna的蛋白或其他产物。除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有互为简并形式(degenerate version)并且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。短语“编码蛋白或rna的核苷酸序列”也可以包括内含子，其程度至编码该蛋白的核苷酸序列在一些形式下可含有一个或多个内含子。
[0107]-术语“内源性”指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何材料。
[0108]-术语“工程化的”或“修饰的”指已被转染、转化或转导的细胞。
[0109]-术语“外源”指从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外产生的任何材料。
[0110]-术语“表达”指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0111]-术语“表达载体”指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些表达载体，包括引入所述重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸的或包含在脂质体中的)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
[0112]-术语“同源性”或“同一性”指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子(例如两个dna分子或两个rna分子)之间，或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个分子中的亚基位置都被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个dna分子中每个分子的位置都被腺嘌呤占据，那么它们在那个位置是同源或同一的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数目的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如10个中的9个)是匹配或同源的，则两个序列是90％同源的。因此，当用于两个或两个以上多肽的序列或两个或两个以上核酸分子的序列之间的关系时，术语“同源的”或“同一的”指由两个或多个氨基酸或核苷酸残基的字符串之间的匹配数确定的多肽或核酸分子之间的序列相关程度。“同一性”测量由特定数学模型或计算机程序(即“算法”)所解决的具有空位比对(如果有的话)的两个或两个以上序列中的较小者之间的相同匹配的百分比。通过已知方法可以容易地计算相关多肽的同一性。这样的方法包括但不限于描述于以下中的：computational molecular biology,lesk,a.m.,ed.,oxford university press,new york,1988；biocomputing:informatics and genome projects,smith,d.w.,ed.,academic press,new york,1993；computer analysis of sequence data,第1部分,griffin,a.m.,和griffin,h.g.,eds.,humana press,new jersey,1994；sequence analysis in molecular biology,von heinje,g.,academic press,1987；sequence analysis primer,gribskov,m.和devereux,j.,eds.,m.stockton press,new york,1991；和carillo等人,siam j.applied math.48,1073(1988)。设计用于确定同一性的优选方法以在所测试的序列之间给出最大的匹配。确定同一性的方法描述于公开可得的计算机程序中。用于确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括gcg程序包，其包括gap(devereux等人,nucl.acid.res.\2,387(1984)；genetics computer group,university of wisconsin,madison,wis.)、blastp、
blastn和fasta(altschul等人,j.moi.biol.215,403-410(1990))。blastx程序可公开获得自国家生物技术信息中心(ncbi)和其他来源(blast manual,altschul等人ncb/nlm/nih bethesda,md.20894；altschul等人,如上所述)。也可以使用公知的史密斯沃特曼算法(smith waterman algorithm)确定同一性。
[0113]-术语非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如fv、fab、fab'、f(ab')2或其他抗体的抗原结合子序列)。在大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自受体的互补决定区(cdr)的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔子的具有所需特异性、亲和力和能力的cdr的残基所取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv构架区(fr)残基被相应的非人残基所取代。此外，人源化抗体/抗体片段可包含在受体抗体或导入的cdr或框架序列中均未发现的残基。这些修饰可以进一步改善和优化抗体或抗体片段的性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有的至少一个且通常两个可变域，其中所有或基本上所有的cdr区都对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有的或重要部分的fr区都是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的。对于进一步的细节，参见jones等人,nature,321:522-525,1986；reichmann等人,nature,332:323-329,1988；presta,curr.op.struct.biol.,2:593-596,1992。
[0114]-如本文所用，“体外转录的rna”指已经在体外合成的rna，优选mrna。通常，体外转录的rna由体外转录载体产生。该体外转录载体包含用于产生体外转录的rna的模板。
[0115]-术语“可诱导的”启动子指，当其有效地连接至编码或指定基因产物的多核苷酸时，基本上仅当细胞中存在对应于该启动子的诱导剂时才引起细胞中基因产物的产生的核苷酸序列。
[0116]-如本文所用，“5'帽”(也称为rna帽、rna 7-甲基鸟苷帽或rna m7g帽)是在转录开始后不久已被添加至真核信使rna的“前面”或5'末端的修饰的鸟嘌呤核苷酸。因此，5'帽由连接至第一个转录的核苷酸的末端基团组成。它的存在对于核糖体的识别以及来自rnase的保护至关重要。帽添加与转录偶联，并且共转录地发生，从而彼此影响。转录开始后不久，正在被合成的mrna的5'末端被与rna聚合酶相关的合成帽的复合物结合。此酶复合物催化mrna加帽(capping)所需的化学反应。合成以多步生化反应进行。可以修饰加帽部分以调节例如其稳定性或翻译效率的mrna的功能。
[0117]-在本发明的上下文中，对于常见的核酸碱基使用以下缩写。“a”指腺嘌呤，“c”指胞嘧啶，“g”指鸟嘌呤，“t”指胸腺嘧啶，并且“u”指尿嘧啶。
[0118]-术语“说明材料”包括可用于传达本发明组合物和方法的有用性的出版物、记录、图表或任何其他表达媒介。例如，本发明的试剂盒的说明材料可以被附于含有本发明的细胞的容器上，或者与含有本发明的细胞的容器一起运输。或者，说明材料可以与容器分开运输，以使接收者可以协同使用说明材料和细胞。
[0119]-如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生促进含有嵌合受体的细胞的免疫效应子功能的信号。嵌合受体-t细胞中免疫效应子功能的示例可包括溶细胞活性、抑制活性、调控活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。
[0120]-术语“分离的”意指从自然状态改变或移除。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，而从其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同的核酸或肽则是“分离的”。分离的核酸或肽可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。通常，分离的核酸或肽的制备物含有的核酸或肽为至少约80％纯、至少约85％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、大于95％纯、大于约96％纯、大于约97％纯、大于约98％纯或大于约99％纯。“分离的核酸”是基本上从天然伴随天然序列的其他基因组dna序列以及如核糖体和聚合酶的蛋白或复合物中分离出的核酸。该术语包括已经从其天然存在的环境中移出的核酸序列，并且包括重组或克隆的dna分离物和化学合成的类似物或由异源系统生物合成的类似物。“分离的多肽”是已经经过鉴定并从其天然环境的组分中分离和/或回收的多肽。
[0121]-术语“慢病毒”指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中的独特之处在于能够感染非分裂细胞；它们可以将大量遗传信息递送到宿主细胞的dna中，因此它们是最有效的基因递送载体的方法之一。hiv、siv和fiv都是慢病毒的示例。
[0122]-术语“慢病毒载体”指衍生自至少一部分慢病毒基因组的载体，尤其包括如milone等人,mol.ther,17(8):1453-1464(2009)中提供的自灭活慢病毒载体。可用于临床的慢病毒载体的其他示例包括但不限于，来自oxford biomedica的基因递送技术，来自lentigen的lentimaxtm载体系统等。慢病毒载体的非临床类型也是可获得的，并且对于本领域技术人员是已知的。
[0123]-术语“配体”指一对配体/受体的成员，并与该对的另一个成员结合。
[0124]-术语“核酸”或“多核苷酸”指通过磷酸二酯键共价连接的核苷酸的聚合物，例如单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)。除非特别限定，否则该术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、同源体、snp和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子取代可通过产生其中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(batzer等人,nucleic acid res.19:5081(1991)；ohtsuka等人,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和rossolini等人,mol.cell.probes 8:91-98(1994))。
[0125]-术语“有效地连接”或“转录控制”指调控序列和异源核酸序列之间的导致后者表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列有效地连接至第二核酸序列。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子有效地连接至编码序列。有效地连接的dna序列可以彼此连续，并且例如在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，在同一阅读框中。
[0126]-术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，且指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对蛋白或肽的序列能包含的最大氨基酸数没有限制。多肽包括任何包含两个或更多个通过肽键相互连接的氨基酸的肽或蛋白。如本文所用，该术语指在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚物的短链以及有许多类型的在本领域中通常被称为蛋白的长链这二者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合
蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
[0127]-术语“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体(carrier)”指当施用给动物，优选人时，不会产生不利、过敏或其他不良反应的赋形剂。它包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。对于人的施用，制剂应符合监管局(例如fda局或ema)所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
[0128]-术语“poly(a)”指一系列附加在mrna上的单磷酸腺苷。在用于瞬时表达的构建体的一个实施方案中，polya是50至5000个腺苷单磷酸，优选大于或等于64个，更优选大于或等于100个，最优选大于或等于300或400个腺苷单磷酸。可以对poly(a)序列进行化学或酶促修饰以调节例如定位、稳定性或翻译效率的mrna功能性。
[0129]-术语“聚腺苷酸化”指聚腺苷酸基部分或其修饰的变体与信使rna分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使rna(mrna)分子在3'末端被聚腺苷酸化。3'poly(a)尾是通过聚腺苷酸聚合酶的作用添加到pre-mrna中的腺嘌呤核苷酸的长序列(通常数百个)。在高等真核生物中，poly(a)尾被添加到含有特定序列即聚腺苷酸化信号的转录物上。poly(a)尾和与其结合的蛋白有助于保护mrna免受核酸外切酶的降解。聚腺苷酸化对于转录终止、mrna从细胞核的输出以及翻译也很重要。聚腺苷酸化在dna转录为rna后立即在细胞核中发生，但另外也可以在细胞质中较后发生。转录终止后，mrna链通过与rna聚合酶相关的核酸内切酶复合物的作用被切割。切割位点的特征通常在于切割位点附近的碱基序列aauaaa的存在。mrna被切割后，腺苷残基被添加到位于切割位点的游离3'末端。
[0130]-术语“启动子”指被细胞的合成机制或引入的合成机制识别的，启动多核苷酸序列的特异性转录所需的dna序列。
[0131]-术语“启动子/调控序列”指表达与启动子/调控序列有效连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，此序列可以是核心启动子序列，而在其他情况下，此序列也可以包括表达基因产物所需的增强子序列和其他调控元件。例如，启动子/调节序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调节序列。
[0132]-术语“重组蛋白或肽”指使用重组dna技术产生的蛋白或肽(例如抗体)，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的蛋白或肽(例如抗体)。该术语也应解释为意指通过合成编码蛋白或肽(例如抗体)的dna分子产生的蛋白或肽(例如抗体)，并且该dna分子表达蛋白或肽(例如抗体)或指定蛋白或肽(例如抗体)的氨基酸序列，其中已使用可用的并且本领域公知的重组dna或氨基酸序列技术来获得dna或氨基酸序列。
[0133]-术语“信号传导结构域”指蛋白的功能部分，其通过在细胞内传递信息起作用，以经由通过产生第二信使或通过应答这些信使的效应子的功能的指定信号传导途径来调控细胞活性。
[0134]-术语“信号转导途径”指在信号从细胞的一部分传输到细胞的另一部分中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。
[0135]-术语“特异性结合”指识别并结合样品中存在的结合配偶体的抗体或配体，但此抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。
[0136]-术语“刺激”指通过刺激性分子(例如，tcr/cd3复合物或嵌合受体)与其同源配体结合从而介导信号转导事件来诱导的第一(primary)应答，例如但不限于，经由tcr/cd3复合物的信号转导或经由嵌合受体的信号传导结构域的信号转导。刺激能介导某些分子的表
达改变。
[0137]-术语“刺激性分子”指由免疫细胞(例如t细胞、nk细胞、b细胞)表达的分子，其提供了在免疫细胞信号传导途径的至少一些方面中以刺激性方式调控免疫细胞激活的细胞质信号传导序列。在一个方面，信号是第一(primary)信号，其由例如导致t细胞应答介导的tcr/cd3复合物与载有肽的mhc分子的结合而启动，t细胞应答包括但不限于增殖、激活、分化等。以刺激性方式起作用的第一细胞质信号传导序列(也称为“第一信号传导域”)可含有一个被认为是基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam的信号传导基序。
[0138]-术语“受试者”旨在包括可在其中引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物、人)。在一个实施方案中，受试者可以是“患者”，即温血动物，更优选为人，其正在等待接受或正在接受医疗护理，或者曾经/正在/将要成为医疗程序的客体，或在监控其目标疾病或病况(例如炎性或自身免疫病况)的发展。在一个实施方案中，受试者是成人(例如18岁以上的受试者)。在另一个实施方案中，受试者是儿童(例如18岁以下的受试者)。在一个实施方案中，所述受试者是男性。在另一个实施方案中，所述受试者是女性。在一个实施方案中，受试者患有，优选被诊断有自身免疫和/或炎性疾病或病症，例如自身抗体介导的自身免疫疾病。在一个实施方案中，受试者处于发展自身免疫和/或炎性疾病或病症的风险中，例如自身抗体介导的自身免疫疾病。风险因素的示例包括但不限于自身免疫和/或炎性疾病或病症的遗传易感性或家族史。
[0139]-术语“基本上纯化的细胞”指基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经从通常在其天然存在的状态下与其结合的其他细胞类型中分离的细胞。在一个实施方案中，基本上纯化的细胞指至少约75％不含、80％不含或85％不含，且优选约90％、95％、96％、97％、98％或99％不含通常在其天然存在的状态下与其结合的其他细胞类型的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群指同质的细胞群。在一个实施方案中，基本上纯化的细胞群指至少约75％同质、80％同质或85％同质，且优选约90％、95％、96％、97％、98％或99％同质的细胞群。在其他情况下，此术语简单地指已经从在其天然状态下与它们天然结合的细胞中分离的细胞。在一些方面，在体外培养细胞。在其他方面，不在体外培养细胞。
[0140]-术语“治疗有效量”指有效地实现特定的生物学结果的表达本文所述的car的细胞量。因此，术语“治疗有效量”意指所针对的试剂水平或量，其目的在于在不对靶标造成显著的负面或不利的副作用下，(1)延迟或预防目标疾病或病况的发作；(2)减慢或停止目标疾病或病况的一种或多种症状的进展、加重或恶化；(3)引起目标疾病或病况的症状减轻；(4)降低目标疾病或病况的严重性或发生率；或(5)治愈目标疾病或病况。为了预防(prophylactic)或防止(preventive)作用，可以在目标疾病或病况发作之前施用治疗有效量。可选地或另外地，为了治疗作用，可以在目标疾病或病况开始后施用治疗有效量。
[0141]-术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代受试者细胞及其后代。
[0142]-术语“转移载体”指包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术
语还应解释为进一步包括促进核酸转移进细胞的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的示例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
[0143]-如本文所用，“瞬时的”指非整合转基因在数小时、数天或数周的时间内表达，其中如果被整合到基因组中或被包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子中，则该表达的时间少于该基因的表达时间。
[0144]-如本文所用，术语“治疗”指减少或改善目标疾病或病况(例如自身免疫病况)的进展、严重程度和/或持续时间，或改善目标疾病或病况(例如自身免疫病况)的一种或多种症状(优选一种或多种可辨别的症状)，其中所述改善起因于一种或多种疗法的施用(例如一种或多种治疗剂，如本发明的treg细胞)。在具体的实施方案中，术语“治疗”指改善至少一种目标疾病或病况(例如自身免疫和/或炎性疾病或病症)的可测量的身体参数。在其他实施方案中，术语“治疗”指通过例如稳定化可辨别的症状在身体上或通过例如稳定化身体参数在生理上或两者抑制目标疾病或病症(例如自身免疫和/或炎性疾病或病症)的进展。在其他实施方案中，术语“治疗”指减少或改善目标疾病或病况(例如自身免疫和/或炎性疾病或病症)的进展、严重程度和/或持续时间，或改善目标疾病或病况(例如自身免疫和/或炎性疾病或病症)的一种或多种症状。“治疗”指治疗性治疗和预防性或阻止性措施；其中目的是预防或减慢(减轻)目标疾病或状况。需要治疗的患者包括已经具有病况的那些患者以及易于患病况的那些患者或需要预防病况的那些患者。如果在接受治疗量的包含根据本发明的嵌合受体的细胞群后，受试者表现出以下一种或多种的可观察和/或可测量的改善，则成功地“治疗”了该受试者的疾病或病症：致病细胞的数量减少；细胞总数中致病细胞的百分比减少；在某种程度上缓解了与特定病况相关的一种或多种症状；发病率和死亡率降低，和/或生活质量问题改善。用于评估成功治疗和改善病况的上述参数可通过医师熟悉的常规程序容易地测量。
[0145]-术语“treg细胞”指能够阻抑、抑制或预防过度或不想要的炎症反应，例如自身免疫或过敏反应的细胞。在一个实施方案中，本发明的treg细胞群能具有抑制活性。在一个实施方案中，所述抑制活性是与接触无关的。在另一个实施方案中，所述抑制活性是接触依赖的。在一个实施方案中，本发明的treg细胞群对效应t细胞表现出抑制作用，优选所述抑制作用取决于tcr表达和/或激活。
[0146]-本文所用的术语多核苷酸“变体”是通常与本文具体公开的多核苷酸不同之处在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的多核苷酸。这样的变体可以是天然存在的，或者可以是合成产生的，例如，通过修饰一个或多个本发明的多核苷酸序列并评估如本文所述的编码的多肽的一个或多个生物学活性和/或使用多种本领域公知的技术的任何一种。因此，本文所用的术语“多肽变体”是通常与本文具体公开的多肽不同之处在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的多肽。这样的变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如，通过修饰一种或多种上述多肽序列并评估如本文所述的多肽的一种或多种生物学活性和/或使用多种本领域公知的技术的任何一种。可以对本发明的多核苷酸和多肽的结构进行修饰，并且仍然获得编码具有所需特征的变体或衍生多肽的功能分子。当期望改变多肽的氨基酸序列以创造等同或甚至改进的本发明的多肽的变体或部分时，本领域技术人员通常将改变编码dna序列的一个或多个密码子。例如，在蛋白结构中某些氨基酸可以被其他氨
基酸取代，而不会明显丧失其结合其他多肽(例如抗原)或细胞的能力。由于定义蛋白的生物学功能活性的是蛋白的结合能力和性质，因此可以在蛋白序列中并且当然也可以在其基础dna编码序列中进行某些氨基酸序列的取代，并且仍然获得具有类似性质的蛋白。因此，预期可以对本发明的肽序列或编码所述肽的相应dna序列进行各种改变，而不会明显丧失其生物学功用或活性。在许多情况下，多肽变体将含有一个或多个保守取代。变体也可以或可选地含有非保守改变。在一个优选的实施方案中，变体多肽与天然序列的不同之处在于五个或更少的氨基酸的取代、缺失或添加。变体还可以(或可选地)通过例如缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性质有最小影响的氨基酸来修饰。
[0147]
术语“ζ”或者“ζ链”、“cd3-ζ”或“tcr-ζ”定义为如genbank登录号bag36664.1提供的蛋白，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴子、猿等的等效残基，并且“ζ刺激性结构域”或者“cd3-ζ刺激性结构域”或“tcr-ζ刺激性结构域”定义为来自ζ链的细胞质结构域的足以功能性传递t细胞激活所需的初始信号的氨基酸残基或其功能性衍生物。在一个实施方案中，ζ的细胞质结构域包含genbank登录号bag36664.1的残基52至164，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基(是其功能性同源体)。
具体实施方式
[0148]
本发明的第一个目的是对至少一种il-23受体(il-23r)特异的嵌合抗原受体(car)，其中所述car包含(i)细胞外结合结构域，其中所述结合结构域与所述il-23r结合(其可称为细胞外il-23r结合结构域)，(ii)任选地，细胞外铰链结构域，(iii)任选地，跨膜结构域，(iv)细胞内信号传导结构域和(v)任选地，标签和/或前导序列。
[0149]
在一个实施方案中，car包含一种或多种多肽。
[0150]
在一个实施方案中，本发明的car识别在细胞表面表达的il-23r并能够与之结合。
[0151]
在另一个实施方案中，本发明的car识别可溶性il-23r并能够与之结合(即非膜结合)。
[0152]
在一个实施方案中，本发明的car识别人il-23r并与之结合。人il-23r是由包含11个外显子的2.8kb长的mrna编码的蛋白(genbank登录号：nm_144701)。
[0153]
在一个实施方案中，本发明的car识别il-23r变体，优选人il-23r的变体，并能够与之结合。
[0154]
在一个实施方案中，il-23r的变体肽指修饰的il-23r肽，其中与原始肽相比，缺失、添加或取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。
[0155]
先前已经鉴定了人il-23r的剪接变体(kan等人,2008)。特别地，描述了il-23r的24种不同的同种型：同种型_v1(由具有genbank登录号am990313的mrna编码)、同种型_v2(由具有genbank登录号am990314的mrna编码)、同种型_v3(由具有genbank登录号am990315的mrna编码)、同种型_v4(由具有genbank登录号am990316的mrna编码)、同种型_v5(由具有genbank登录号am990317的mrna编码)、同种型_v6(由具有genbank登录号am990318的mrna编码)、同种型_v7(由具有genbank登录号am990319的mrna编码)、同种型_v8(由具有genbank登录号am990320的mrna编码)、同种型_v9(由具有genbank登录号am990321的mrna编码)、同种型_v10(由具有genbank登录号am990322的mrna编码)、同种型_v11(由具有genbank登录号am990323的mrna编码)、同种型_v12(由具有genbank登录号am990324的mrna
编码)、同种型_v13(由具有genbank登录号am990325的mrna编码)、同种型_v14(由具有genbank登录号am990326的mrna编码)、同种型_v15(由具有genbank登录号am990327的mrna编码)、同种型_v16(由具有genbank登录号am990328的mrna编码)、同种型_v17(由具有genbank登录号am990329的mrna编码)、同种型_v18(由具有genbank登录号am990330的mrna编码)、同种型_v19(由具有genbank登录号am990331的mrna编码)、同种型_v20(由具有genbank登录号am990332的mrna编码)、同种型_v21(由具有genbank登录号am990333的mrna编码)、同种型_v22(由具有genbank登录号am990334的mrna编码)、同种型_v23(由具有genbank登录号am990335的mrna编码和同种型_v24(由具有genbank登录号am990336的mrna编码)。
[0156]
因此，在一个实施方案中，本发明的car识别人il-23r的剪接变体并能够与之结合，所述剪接变体选自包含以下的组：同种型_v1、同种型_v2、同种型_v3、同种型_v4、同种型_v5、同种型_v6、同种型_v7、同种型_v8、同种型_v9、同种型_v10、同种型_v11、同种型_v12、同种型_v13、同种型_v14、同种型_v15、同种型_v16、同种型_v17、同种型_v18、同种型_v19、同种型_v20、同种型_v21、同种型_v22、同种型_v23和同种型_v24。
[0157]
此外，先前已经描述了人il-23r的α亚基中的单核苷酸多态性(kan等人,2008和sivanesan等人,2016)。
[0158]
在一个实施方案中，本发明的car识别在α亚基中包含单核苷酸多态性(snp)的il-23r变体并能够与之结合，其中所述snp选自包含r381q、g149r、v362i及其组合的组。
[0159]
在一个实施方案中，本发明的car识别鼠il-23r并能够与之结合。
[0160]
在一个实施方案中，细胞外il-23r结合结构域是针对il-23r的抗体或其抗原结合片段。
[0161]
本发明的包含抗体或其抗原结合片段的car的部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域以连续多肽链的一部分被表达，包括例如单链抗体(scfv)、单结构域抗体片段(sdab)、人源化抗体或双特异性抗体(harlow等人,1999，在using antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,ny中；harlow等人,1989，在antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor,new york中；houston等人,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883；bird等人,1988,science 242:423-426)。
[0162]
在一个实施方案中，本发明的car包括完整抗体(whole antibody)、单链抗体、二聚体单链抗体、fv、scfv、fab、f(ab)'2、去岩藻糖化抗体、双特异性抗体、双抗体、三抗体、四抗体、单特异性体(unibody)、结构域抗体、纳米抗体或其抗原结合片段。
[0163]
在一个实施方案中，细胞外il-23r结合结构域是抗体模拟物。抗体模拟物的示例包括但不限于亲和体、α抗体、基于犰狳重复蛋白的支架、打结素、库尼茨型结构域肽、affilin、affitin、adnectin、阿特里体、evasin、darpin、anticalin、高亲和性多聚体、菲诺体、versabody或duocalin。
[0164]
在一个实施方案中，本发明的car的细胞外结合结构域包含例如scfv的抗体片段或由其组成。
[0165]
可以使用许多公知方案中的任何一个来确定给定cdr的精确氨基酸序列边界，包括描述于kabat等人(1991),“sequences of proteins of immunological interest”第五版public health service,national institutes of health,bethesda,md(“kabat”编号
方案)，al-lazikani等人,(1997)jmb273,927-948(“chothia”编号方案)或其组合的那些。
[0166]
在一个实施方案中，本发明的car中包含的抗体是多特异性抗体分子，例如，它包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第一表位的结合特异性，且多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第二表位的结合特异性。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体具有针对不超过两种抗原的特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有针对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和具有针对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
[0167]
在一个实施方案中，car包含含有重链v
h
的scfv或由其组成，该重链v
h
具有序列seq id no:37或与seq id no:37有至少约70％，优选至少约75％、80％、85％、90％、95％或以上的同一性的序列。
[0168]
在一个实施方案中，car包含含有轻链v
l
的scfv或由其组成，该轻链v
l
选自包含seq id no:38、46和56或与所述seq id no:38、46和56有至少约70％，优选至少约75％、80％、85％、90％、95％或以上的同一性的序列的组，优选包含具有序列seq id no:38或与所述seq id no:38有至少约70％，优选至少约75％、80％、85％、90％、95％或以上的同一性的轻链v
l
。
[0169]
在一个实施方案中，scfv包含具有seq id no:37(或与所述seq id no:37有至少约70％，优选至少约75％、80％、85％、90％、95％或以上的同一性的序列)的重链v
h
，以及选自包含seq id no:38、46、56和与所述seq id no:38、46和56有至少约70％，优选至少约75％、80％、85％、90％、95％或以上的同一性的序列的组的轻链v
l
，优选具有seq id no:38(或与所述seq id no:38有至少约70％，优选至少约75％、80％、85％、90％、95％或以上的同一性的序列)的v
l
。
[0170]
在一个实施方案中，scfv包含具有seq id no:37(或与所述seq id no:37有至少约70％，优选至少约75％、80％、85％、90％、95％或以上的同一性的序列)的重链v
h
，以及具有seq id no:38(或与所述seq id no:38有至少约70％，优选至少约75％、80％、85％、90％、95％或以上的同一性序列)的轻链v
l
。
[0171]
在一个实施方案中，scfv包含具有seq id no：37(或与所述seq id no:37有至少约70％，优选至少约75％、80％、85％、90％、95％或以上的同一性的序列)的重链v
h
，以及具有seq id no:46(或与所述seq id no:46有至少约70％，优选至少约75％、80％、85％、90％、95％或以上的同一性的序列)的轻链v
l
。
[0172]
在一个实施方案中，scfv包含具有seq id no:37(或与所述seq id no:37有至少约70％，优选至少约75％、80％、85％、90％、95％或以上的同一性的序列)的重链v
h
，以及具有seq id no:56(或与所述seq id no:56有至少约70％，优选至少约75％、80％、85％、90％、95％或以上的同一性的序列)的轻链v
l
。
[0173]
在一个实施方案中，scfv包含连接v
h
和v
l
链的接头。
[0174]
在一个实施方案中，接头是短的寡肽或多肽，优选长度范围为2至10个氨基酸。
[0175]
例如，甘氨酸-丝氨酸双联体提供了尤其合适的铰链结构域(gs接头)。在一个实施方案中，铰链结构域是gly/ser接头。gly/ser接头的示例包括但不限于gs接头、g2s接头、g3s接头、g4s接头。
[0176]
g2s接头的非限制性示例是ggs。
[0177]
g3s接头包含氨基酸序列(gly-gly-gly-ser)
n
，也称为(gggs)
n
或(seq id no:1)
n
，其中n是等于或大于1的正整数(例如n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9或n＝10)。g3s接头的示例包括但不限于gggsgggsgggsgggs(seq id no:6)。
[0178]
g4s接头的示例包括但不限于对应于ggggs(seq id no:5)的(gly4ser)；对应于ggggsggggs(seq id no:4)的(gly
4 ser)2；对应于ggggsggggsggggs(seq id no:3)的(gly
4 ser)3；对应于ggggsggggsggggsggggs(seq id no:2)的(gly
4 ser)4。
[0179]
在一个实施方案中，接头是(g4s)3接头(seq id no:3)。
[0180]
在一个实施方案中，scfv包含序列seq id no:55、seq id no:36或seq id no:57或与所述seq id no:55、seq id no:36或seq id no:57有至少约70％，优选至少约75％、80％、85％、90％、95％或以上的同一性的序列或由其组成。在一个实施方案中，scfv包含序列seq id no:55或与所述seq id no：55有至少约70％，优选至少约75％、80％、85％、90％、95％或以上的同一性的序列或由其组成。
[0181]
在一个实施方案中，本发明的car包含细胞外il-23r结合结构域和至少一个其他细胞外抗原结合结构域。因此，根据该实施方案，本发明的car能够结合il-23r和至少一个其他抗原。
[0182]
在一个实施方案中，本发明的car能够结合il-23r和不同的抗原或配体。在另一个实施方案中，本发明的car能够结合il-23r上的第一表位和相同il-23r上的不同表位。在另一个实施方案中，本发明的car能够结合il-23r和不同的il-23r(例如，il-23r的变体)。
[0183]
在一个实施方案中，所述至少一个其他细胞外抗原结合结构域是针对特定抗原的抗体或其抗原结合片段。
[0184]
在一个实施方案中，所述至少一个其他细胞外抗原结合结构域包含例如scfv的抗体片段或由其组成。
[0185]
在一个实施方案中，所述至少一个其他细胞外抗原结合结构域(优选scfv)能够结合来自普通人类饮食的食物抗原。
[0186]
术语“来自普通人类饮食的食物抗原”指来自人类常见食物的免疫原性肽，例如以下非限制性列表的食物抗原：牛抗原，例如脂质运载蛋白、钙结合s100、α-乳清蛋白、乳球蛋白例如β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白。食物抗原也可以是大西洋鲑鱼抗原，如小白蛋白；鸡抗原，如类卵粘蛋白、卵白蛋白、ag22、伴清蛋白、溶菌酶或鸡血清白蛋白；花生抗原；虾抗原，如原肌球蛋白；小麦抗原，如凝集素或麦醇溶蛋白；芹菜抗原，如芹菜抑制蛋白；胡萝卜抗原，如胡萝卜抑制蛋白；苹果抗原，如索马甜、苹果脂质转移蛋白或苹果抑制蛋白；梨抗原，如梨抑制蛋白或异黄酮还原酶；鳄梨抗原，如内切几丁质酶；杏抗原，如杏脂质转移蛋白；桃子抗原，如桃子脂质转移蛋白或桃子抑制蛋白；大豆抗原，如hps、大豆抑制蛋白或(sam22)pr-10prot；其片段、变体及混合物。
[0187]
在另一个实施方案中，所述至少一个其他细胞外抗原结合结构域(优选scfv)能够结合自身抗原，例如多发性硬化相关抗原、关节相关抗原、眼相关抗原、人hsp抗原、皮肤相关抗原或参与移植排斥或gvhd的抗原。
[0188]
在一个实施方案中，术语“多发性硬化相关抗原”指髓磷脂碱性蛋白(mbp)、髓磷脂相关糖蛋白(mag)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(mog)、蛋白脂蛋白(plp)、少突胶质细胞髓
鞘寡蛋白(omgp)、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(mobp)、少突胶质细胞特异性蛋白(osp/claudinl 1)、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白(osp)、nogo a、糖蛋白po、外周髓磷脂蛋白22(pmp22)、2'3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶(cnpase)，其片段、变体和混合物。
[0189]
在一个实施方案中，术语“关节相关抗原”指瓜氨酸取代的环状和线性丝聚蛋白肽，ii型胶原蛋白肽，人软骨糖蛋白39(hcgp39)肽，hsp，异源核核糖核蛋白(hnrnp)a2肽，hnrnp b1，hnrnp d，ro60/52，hsp60、hsp65、hsp70和hsp90，bip，角蛋白，波形蛋白，纤维蛋白原，i、iii、iv和v型胶原蛋白肽，膜联蛋白v，葡萄糖6磷酸异构酶(gpi)，乙酰基-钙蛋白酶抑素，丙酮酸脱氢酶(pdh)，醛缩酶，拓扑异构酶i，snrnp，parp，scl-70，scl-100，包括阴离子心磷脂和磷脂酰丝氨酸的磷脂抗原，带中性电荷的脑磷脂和卵磷脂，基质金属蛋白酶，原纤蛋白，软骨蛋白聚糖，其片段、变体和混合物。关节相关抗原的其他示例包括但不限于瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化ii型胶原蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原。
[0190]
在一个实施方案中，术语“眼相关抗原”指ii型胶原蛋白、视网膜抑制蛋白、s-抑制蛋白、光受体间类视黄醇结合蛋白(irbp1)、β-晶体蛋白b1、视网膜蛋白、脉络膜蛋白及其片段、变体和混合物。眼相关抗原的其他示例包括但不限于瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化ii型胶原蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原。
[0191]
在一个实施方案中，术语“人hsp抗原”指人hsp60、hsp70、hsp90，其片段、变体和混合物。
[0192]
在一个实施方案中，抗原是炎性神经系统病况相关抗原，优选多发性硬化相关抗原。炎性神经系统病况相关抗原，优选多发性硬化相关抗原的示例包括但不限于髓磷脂碱性蛋白(mbp)、髓磷脂相关糖蛋白(mag)、髓磷脂少突胶质细胞蛋白(mog)、蛋白脂蛋白(plp)、少突胶质细胞髓磷脂寡蛋白(omgp)、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(mobp)、少突胶质细胞特异性蛋白(osp/claudinl 1)、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白(osp)、nogo a、糖蛋白po、外周髓磷脂蛋白22(pmp22)、2'3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶(cnpase)，其片段、变体和混合物。
[0193]
在一个实施方案中，抗原是皮肤相关抗原。皮肤相关抗原的示例包括但不限于角质形成细胞抗原、存在于真皮或表皮中的抗原、黑色素细胞抗原(例如黑色素或酪氨酸酶)、桥粒芯糖蛋白(例如桥粒芯糖蛋白1或3，也可以称为dsg1/3)、bp180、bp230、网蛋白(plectin)、整联蛋白(例如整联蛋白α4β6)、胶原蛋白(例如vii型胶原蛋白)、层粘连蛋白(例如层粘连蛋白332或层粘连蛋白γ1)、血小板溶素(例如包斑蛋白(envoplakin)、周斑蛋白(periplakin)或桥粒斑蛋白(desmoplakin))、角蛋白(例如krt5、krt8、krt15、krt17和krt31)、角蛋白丝相关蛋白、丝聚蛋白、角化粒素(corneodesmosin)蛋白和弹性蛋白。
[0194]
在一个实施方案中，抗原是参与移植排斥或gvhd的抗原。这些抗原的示例包括但不限于对移植组织或宿主特异的mhc、β2-微球蛋白、来自abo系统的抗原、来自恒河猴系统的抗原(尤其是来自c、c、e和(et)e和d系统的抗原)和异血细胞凝集素。可参与移植排斥或gvhd的抗原的其他示例包括但不限于hla-dr(尤其是在移植后的前六个月)、hla-b(尤其是在移植后的前两年)、hla-a、次要组织相容性抗原(miha，例如hla-e、hla-f和hla-g)、对应于i类mhc的hla(a、b和c)、对应于ii类mhc的hla(dp、dm、doa、dob、dq和dr)以及对应于iii类mhc的hla(例如补体系统的组分)。
[0195]
在一个实施方案中，抗原是hla-a2细胞表面蛋白。在一个实施方案中，细胞外结合
结构域包含针对hla-a2的抗体或其抗原结合片段。
[0196]
如本文所用的术语“hla-a2”指由hla基因复合物的hla-a基因座处的hla-a*02等位基因家族编码的包括细胞表面蛋白的人白细胞抗原(hla)蛋白。术语“hla-a2”涵盖的hla蛋白包括通过血清学测试或基因分型法确定为属于hla-a*02抗原类型的hla蛋白。hla-a*02抗原类型的其他名称包括“hla-a2”、“hla-a02”和“hla-a*2”。已经开发出标示由该等位基因家族编码的hla蛋白的不同命名系统，包括由who hla系统因子委员会(who committee for factors of the hla system)于2010年开发的hla命名系统。术语“hla-a2”指等位基因编码的具有根据该命名系统命名的以“hla-a*02”开头的hla蛋白，包括但不限于以“hla-a*02：01”、“hla-a*02：02”、“hla-a*02：03”、“hla-a*02：04”、“hla-a*02：05”、“hla-a*02：06”、“hla-a*02：07”、“hla-a*02：08”、“hla-a*02：09”、“hla-a*02：10”和“hla-a*02：11”开头的名称。等位基因名称可以用斜体表示。以“hla-a*02：”开头，后接2或3个额外数字的等位基因名称可以构成完整名称或名称的开始部分。术语“hla-a2”还指根据该命名系统以“hla-a*02”开头的名称标识的hla蛋白，包括但不限于名称“hla-a*02：01”、“hla-a*02：02”、“hla-a*02：03”、“hla-a*02：04”、“hla-a*02：05”、“hla-a*02：06”、“hla-a*02：07”、“hla-a*02：08”、“hla-a*02：09”、“hla-a*02：10”和“hla-a*02：11”。
[0197]
自身抗原的其他示例包括但不限于水通道蛋白水通道(例如水通道蛋白-4水通道(aqp4))、hu、ma2、坍塌蛋白(collapsin)反应介质蛋白5(crmp5)和双载蛋白(amphiphysin)、电压门控钾通道(vgkc)、n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmdar)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(ampar)、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、抗n-甲基-d-天冬氨酸受体(nr1亚基)、rh血型抗原、i抗原、桥粒芯糖蛋白1或3(dsg1/3)、bp180、bp230、乙酰胆碱烟碱突触后受体、促甲状腺素受体、血小板整联蛋白、gpiib:iiia、胶原蛋白(例如胶原蛋白α-3(iv)链)、类风湿因子、钙蛋白酶抑素、瓜氨酸化蛋白、髓磷脂碱性蛋白(mbp)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(mog)肽、α-β-晶状体蛋白、dna、组蛋白、核糖体、rnp、组织转谷氨酰胺酶(tg2)、内在因子、65-kda抗原、磷脂酰丝氨酸、核糖体磷蛋白、抗中性粒细胞细胞质抗体、scl-70、u1-rnp、ana、ssa、抗ssb、抗核抗体(ana)、抗中性粒细胞细胞质抗体(anca)、jo-1、抗线粒体抗体、gp210、p62、sp100、抗磷脂抗体、u1-70kd snrnp、gq1b神经节苷脂、gm1、缺乏唾液酸基的gm1(asialo gm1)、gd1b、抗平滑肌抗体(asma)、抗肝-肾微粒体1抗体(alkm-1)、抗肝细胞溶质抗体1(alc-1)、iga抗内胚层抗体、中性粒细胞颗粒蛋白、链球菌细胞壁抗原、胃壁细胞内在因子、胰岛素(iaa)、谷氨酸脱羧酶(gaa或gad)和蛋白酪氨酸磷酸酶(例如ia2或ica512)、pla2r1和thsd7a1。
[0198]
在一个实施方案中，抗原是癌抗原。
[0199]
如本文所用，术语“癌抗原”指由癌细胞差异表达，且因此可以被利用以靶向癌细胞的抗原。癌抗原是可以潜在地明显刺激肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些由正常细胞编码，尽管不是必须要表达。这些抗原可以被特征化为在正常细胞中通常沉默(即不表达)的那些、仅在分化的某些阶段表达的那些以及在时间上表达的那些，例如胚胎抗原和胎儿抗原。其他癌抗原由突变的细胞基因编码，例如癌基因(例如，激活的ras癌基因)、抑制基因(例如，突变的p53)和由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白。其他癌抗原也可以由病毒基因编码，例如那些被携带在rna和dna肿瘤病毒上的基因。已经依据多种实体瘤定义了许多肿瘤抗原：通过免疫定义的mage 1、2和3；mart-1/melan-a、gp100、癌胚抗
原(cea)、her2、粘蛋白(即muc-1)、前列腺特异性抗原(psa)和前列腺酸性磷酸酶(pap)。此外，已显示病毒蛋白，例如由乙型肝炎(hbv)、爱泼斯坦-巴尔(ebv)和人乳头瘤(hpv)编码的一些，分别对于肝细胞癌、淋巴瘤和宫颈癌的发展是重要的。
[0200]
其他癌抗原包括但不限于707-ap(707丙氨酸脯氨酸)，afp((a)甲胎蛋白)，art-4(被t4细胞识别的腺癌抗原)，bage(b抗原；b-连环蛋白/m，b-连环蛋白/突变的)，bcma(b细胞成熟抗原)，bcr-abl(断点簇区域-abelson)，caix(碳酸酐酶ix)，cd19(分化簇19)，cd20(分化簇20)，cd22(分化簇22)，cd30(分化簇30)，cd33(分化簇33)，cd44v7/8(分化簇44，外显子7/8)，camel(黑色素瘤上ctl识别的抗原)，cap-1(癌胚抗原肽-1)，casp-8(半胱天冬酶-8)，cdc27m(细胞分裂周期27突变的)，cdk4/m(环化素依赖性激酶4突变的)，cea(癌胚抗原)，ct(癌症/睾丸(抗原))，cyp-b(亲环素b)，dam(分化抗原黑色素瘤)，egfr(表皮生长因子受体)，egfrviii(表皮生长因子受体，变体iii)，egp-2(上皮糖蛋白2)，egp-40(上皮糖蛋白40)，erbb2、3、4(成红细胞白血病病毒癌基因同源物-2、-3、4)，elf2m(延伸因子2突变的)，etv6-aml1(ets变体基因6/急性髓细胞白血病1基因ets)，fbp(叶酸结合蛋白)，fachr(胎儿乙酰胆碱受体)，g250(糖蛋白250)，gage(g抗原)，gd2(二唾液酸神经节苷脂2)，gd3(二唾液酸神经节苷脂3)，gnt-v(n-乙酰葡糖氨基转移酶v)，gp100(糖蛋白100kd)，hage(helicose抗原)，her-2/neu(人表皮受体-2/神经性；也称为egfr2)，hla-a(人白细胞抗原-a)，hpv(人乳头瘤病毒)，hsp70-2m(热休克蛋白70-2突变的)，hst-2(人印戒肿瘤-2)，htert或htrt(人端粒酶逆转录酶)，ice(肠羧基酯酶)，il-13r-a2(白介素-13受体亚基α-2)，kiaa0205，kdr(激酶插入结构域受体)，κ-轻链，lage(l抗原)，ldlr/fut(低密度脂质受体/gdp-l-岩藻糖：b-d-半乳糖苷酶2-a-l岩藻糖基转移酶)，ley(lewis-y抗体)，l1 cam(l1细胞粘附分子)，mage(黑色素瘤抗原)，mage-a1(黑色素瘤相关抗原1)，间皮素，鼠cmv感染的细胞，mart-1/melan-a(t细胞识别的黑色素瘤抗原-i/黑色素瘤抗原a)，mc1 r(黑皮质素1受体)，肌球蛋白/m(肌球蛋白突变的)，muc1(粘蛋白1)，mum-1、-2、-3(黑色素瘤普遍存在的突变的1、2、3)，na88-a(患者m88的na cdna克隆)，nkg2d(自然杀伤组2，成员d)配体，ny-br-1(纽约乳分化抗原1)，ny-eso-1(纽约食管鳞状细胞癌-1)，癌胚抗原(h5t4)，p15(蛋白15)，p190次要bcr-abl(190kd bcr-abl的蛋白)，pml/rara(早幼粒细胞白血病/视黄酸受体a)，prame(黑色素瘤的优先表达抗原)，psa(前列腺特异性抗原)，psca(前列腺干细胞抗原)，psma(前列腺特异性膜抗原)，rage(肾脏抗原)，ru1或ru2(肾脏普遍存在的1或2)，sage(肉瘤抗原)，sart-1或sart-3(排斥鳞状抗原的肿瘤1或3)，ssx1、-2、-3、4(滑膜肉瘤x1、-2、-3、-4)，taa(肿瘤相关抗原)，tag-72(肿瘤相关糖蛋白72)，tel/aml1(易位ets家族性白血病/急性髓细胞白血病1)，tpi/m(磷酸丙糖异构酶突变的)，trp-1(酪氨酸酶相关蛋白1，或gp75)，trp-2(酪氨酸酶相关蛋白2)，trp-2/int2(trp-2/内含子2)，vegf-r2(血管内皮生长因子受体2)，或wt1(维尔姆斯瘤(wilms
’
s tumor)基因)。
[0201]
自身抗原的其他示例包括但不限于水通道蛋白水通道(例如水通道蛋白-4水通道(aqp4))、hu、ma2、坍塌蛋白(collapsin)反应介质蛋白5(crmp5)和双载蛋白、电压门控钾通道(vgkc)、n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmdar)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(ampar)、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、抗n-甲基-d-天冬氨酸受体(nr1亚基)、rh血型抗原、i抗原、桥粒芯糖蛋白1或3(dsg1/3)、bp180、bp230、乙酰胆碱烟碱突触后受体、促甲状腺素受体、血小板整联蛋白、gpiib:iiia、胶原蛋白(例如胶原蛋白α-3(iv)链)、类风湿因
子、钙蛋白酶抑素、瓜氨酸化蛋白，髓磷脂碱性蛋白(mbp)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(mog)肽、α-β-晶状体蛋白、dna、组蛋白、核糖体、rnp、组织转谷氨酰胺酶(tg2)、内在因子、65-kda抗原、磷脂酰丝氨酸、核糖体磷蛋白、抗中性粒细胞细胞质抗体、scl-70、u1-rnp、ana、ssa、抗ssb、抗核抗体(ana)、抗中性粒细胞细胞质抗体(anca)、jo-1、抗线粒体抗体、gp210、p62、sp100、抗磷脂抗体、u1-70kd snrnp、gq1b神经节苷脂、gm1、缺乏唾液酸基的gm1(asialo gm1)、gd1b、抗平滑肌抗体(asma)、抗肝-肾微粒体1抗体(alkm-1)、抗肝细胞溶质抗体1(alc-1)、iga抗内胚层抗体、中性粒细胞颗粒蛋白、链球菌细胞壁抗原、胃壁细胞内在因子、胰岛素(iaa)、谷氨酸脱羧酶(gaa或gad)和蛋白酪氨酸磷酸酶(例如ia2或ica512)、pla2r1和thsd7a1。
[0202]
在一个实施方案中，所述至少一个其他细胞外抗原结合结构域(优选scfv)能够结合与被感染的细胞有关的抗原。
[0203]
如本文所用，术语“被感染的细胞”指被一些不利地影响其质量、特征或状况的物质污染的细胞。
[0204]
在一个实施方案中，抗原与被病毒感染的细胞有关。在另一个实施方案中，抗原与被细菌感染的细胞有关。在另一个实施方案中，抗原与被真菌感染的细胞有关。在另一个实施方案中，抗原与被寄生虫感染的细胞有关。
[0205]
在另一个实施方案中，所述至少一个其他细胞外抗原结合结构域(优选scfv)能够结合吸入性过敏原、摄入性过敏原或接触性过敏原。
[0206]
吸入性过敏原的示例包括但不限于来自无气门亚目(astigmata)的过敏原(例如粗足粉螨(acarus siro)(贮藏螨(storage mite)，aca s 13)、热带无爪螨(tropicola blomia)(螨虫，blo t)、美洲尘螨(dermatophagoides farinae)(美国房尘螨(american house dust mite)，der f)、微角尘螨(dermatophagoides microceras)(房尘螨(house dust mite)，der m)、屋尘螨(dermatophagoides pteronyssinus)(欧洲房尘螨(european house dust mite)，der p)、梅氏嗜霉螨(euroglyphus maynei)(房尘螨，eur m)、家食甜螨(glycyphagus domesticus)(贮藏螨，gly d 2)、害鳞嗜螨(lepidoglyphus destructor)(贮藏螨，lep d)、腐食酪螨(tyrophagus putrescentiae)(贮藏螨，tyr p))；蜚蠊目(例如德国小蠊(blattella germanica)(德国蜚蠊(german cockroach)，bla g)、美洲大蠊(periplaneta americana)(美洲蜚蠊(american cockroach)，per a))；鞘翅目(例如异色瓢虫(harmonia axyridis)(亚洲瓢虫，har a))、双翅目(例如，埃及伊蚊(aedes aegypti)(黄热蚊(yellow fever mosquito)，aed a)、花翅摇蚊(chironomus kiiensis)(摇蚊(midge)，chi k)、chironomus thummi thummi(摇蚊(midge)，chi t)、台湾蛱蠓(formcipomyia taiwana)(蠓(biting midge)，for t)、刺舌蝇(glossina morsitans)(萨凡纳采采蝇(savannah tsetse fly)，glo m)、半翅目(hemidiptera)：长锥蝽(triatoma protracta)(加州接吻虫(california kissing bug)，tria p))、膜翅目(例如中华蜜蜂(apis cerana)(东方蜂(eastern hive bee)，api c)、大蜜蜂(apis dorsata)(巨型蜜蜂(giant honeybee)，api d)、西方蜂(apis mellifera)(蜜蜂，api m)、bombus pennsylvanicus(熊蜂(bumble bee)，bom p)、欧洲熊蜂(bombus terrestris)(熊蜂，bom t)、长黄胡蜂(dolichovespula arenaria)(大黄蜂(yellow hornet)，dol a)、白脸长黄胡蜂(dolichovespula maculata)(白脸大黄蜂(white face hornet)，dol m)、杰克跳蚁
v 1，hor v 5，hor v 12，hor v 15，hor v 16，hor v 17，hor v 21)、黑麦草(lolium perenne)(黑麦(rye grass)，lol p 1，lol p 2，lol p 3，lol p 4，lol p 5，lol p 11)、水稻(oryza sativa)(稻，ory s 1，ory s 12)、百喜草(paspalum notarum)(巴哈雀稗(bahia grass)，pas n 1)、球茎草芦(phalaris aquatica)(金黄草(canary grass)，pha a 1，pha a 5)、猫尾草(phleum pratense)(梯牧草(timothy)，phl p 1，phl p 2，phl p 4，phl p 5，phl p 6，phl p 7，phl p 11，phl p 12，phl p 13)、草地早熟禾(poa pratensis)(肯塔基六月禾(kentucky blue grass)，poa p 1，poa p 5)、黑麦属(secale cereale)(黑麦(rye)，sec c 1，sec c 20)、石茅(sorghum halepense)(约翰逊草(johnson grass)，sor h 1)、普通小麦(triticum aestivum)(小麦，tri a 12，tri a 14，tri a 185，tri a 19，tri a 25，tri a 26，tri a 27，tri a 28，tri a 29，tri a 30)、玉米(zea mays)(玉米(maize)，zea m 1，zea m 12，zea m 14，zea m 25)、壳斗目(fagales)：普通赤杨(alnus glutinosa)(赤杨(alder)，aln g 1，aln g 4)、疣皮桦(betula verrucosa)(桦树(birch)，bet v 1，bet v 2，bet v 3，bet v 4，bet v 5，bet v 6，bet v 7)、carpinus betuhxs(角树(hornbeam)，car b 1)；唇形目(lamiales)(例如欧洲白蜡树(fraxinus excelsior)(白蜡树(ash)，fra e l)、普通女贞(livetrum vulgare)(女贞(privet)，lig v)、紫丁香(syringa vulgaris)(丁香花(lilac)，syr v))；金虎尾目(malpighiales)(例如巴西橡胶树(hevea brasiliensis)(帕拉胶树(para rubber tree)(乳胶)，hev b 1，hev b 2，hev b 3，hev b 4，hev b 5，hev b 6，hev b 7，hev b 8，hev b 9，hev b 10，hev b 11，hev b 12，hev b 13))；山龙眼目(proteales)(例如二球悬铃木(platanus acerifolia)(英国梧桐(london plane tree)，pla a 1，pla a 2，pla a 3)、三球悬铃木(platanus orientalis)(法国梧桐(oriental plane)，pla or 1，pla or 2，pla or 3))。
[0207]
摄入性过敏原的示例包括但不限于来自真菌子囊菌的过敏原，例如座囊菌目(dothideales)(例如互隔交链孢霉(alternaria alternata)(链格孢腐菌(alternaria rot fungus)，alt a)、支孢样支孢霉(cladosporium cladosporioides)(cla c)、草本支孢霉(cladosporium herbarum)(cla h)、月牙弯孢菌(curvularia lunata)(cur l)、-散囊菌目(eurotiales)：黄曲霉菌(aspergillus flavus)(asp fl)、烟曲霉菌(aspergillus fumigatus)(asp f)、黑曲霉菌(aspergillus niger)(asp n)、米曲霉菌(aspergillus oryzae)(asp o)、短密青霉菌(penicillium brevicompactum)(pen b)、产黄青霉菌(penicillium chrysogenum)(pen ch)、桔青霉菌(penicillium citrinum)(pen c)、草酸青霉菌(penicillium oxalicum)(pen o))、肉座菌目(hypocreales)(例如大刀镰刀菌(fusarium culmorum)(fus c))；甲爪团囊属(onygenales)(例如红色毛癣菌(trirphyton rubrum)(tri r)、断发毛癣菌(trichophyton tonsurans)(tri t)、酵母目(saccharomycetales)：白色念珠菌(candida albicans)(酵母，cand a)、博伊丁假丝酵母(candida boidinii)(酵母，cand b))；瘤座孢目(tuberculariales)(例如黑附球菌(epicoccum purpurascens)(epi p))，来自真菌担子菌(fungi basidiomycota)的过敏原，例如层菌纲(hymenomycetes)(例如毛头鬼伞(coprinus comatus)(毛头鬼伞(shaggy mane)，cop c)、古巴光盖伞(psilocybe cubensis)(神奇蘑菇(magic mushroom)，psi c)、锈菌纲(urediniomycetes)(例如胶红酵母(rhodotorula mucilaginosa)(酵母，rho m))；黑粉菌纲(ustilaginomycetes)(例如糠秕马拉色菌(malassezia furfur)(花斑糠疹感染
(pastriasis versicolor infect.)agent，mala f)，合轴马拉色菌(malassezia sympodialis)(mala s))；抗生素(例如青霉素、头孢菌素、氨基苷(aminoside)、喹诺酮类、大环内酯类、四环素、磺胺类(sulfamid)；药物(例如乙酰水杨酸、疫苗、吗啡及衍生物)；维生素，例如维生素k1；以及食物过敏原(例如来自奶、蛋、花生、树坚果(核桃、腰果等)、鱼、贝类、大豆、小麦和胡萝卜、苹果、梨、鳄梨、杏、桃中的过敏原)。
[0208]
接触性过敏原的示例包括但不限于重金属(例如镍、铬、金)、乳胶、半抗原如氟烷、肼苯哒嗪。
[0209]
在一个实施方案中，所述至少一个其他细胞外抗原结合结构域(优选scfv)能够结合选自包含卵白蛋白、mog、ii型胶原片段、其变体和混合物的组的抗原。在一个实施方案中，所述至少一个其他细胞外抗原结合结构域(优选scfv)能够结合选自包含瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化ii型胶原蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原、其变体和混合物的组的抗原。
[0210]
在一个实施方案中，所述至少一个其他细胞外抗原结合结构域(优选scfv)能够结合卵白蛋白，其片段、变体和混合物。
[0211]
在另一个实施方案中，所述至少一个其他细胞外抗原结合结构域(优选scfv)能够结合mog，其片段、变体和混合物。
[0212]
在另一个实施方案中，所述至少一个其他细胞外抗原结合结构域(优选scfv)能够结合ii型胶原蛋白，其片段、变体和混合物。
[0213]
在另一个实施方案中，所述至少一个其他细胞外抗原结合结构域(优选scfv)能够结合瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化ii型胶原蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原，其片段、变体和混合物。
[0214]
在一个实施方案中，细胞外il-23r结合结构域通过铰链结构域与跨膜结构域连接。
[0215]
在一个实施方案中，如上文所述，铰链结构域是短的寡肽接头或多肽接头，优选其长度范围为2至10个氨基酸。
[0216]
可用于本发明的铰链结构域的另一个示例描述于wo2012/138475中，其通过引用并入本文。
[0217]
在一个实施方案中，铰链结构域包含选自包含以下的组的氨基酸序列：氨基酸序列agssssggsttggstt(seq id no:7)、氨基酸序列gttaasgssggsssga(seq id no:8)、氨基酸序列ssatatagtgsstgst(seq id no:9)以及氨基酸序列tsgstgtaasststst(seq id no:10)。
[0218]
在一个实施方案中，铰链结构域由ggtggcggaggttctggaggtggaggttcc(seq id no:11)的核苷酸序列编码。
[0219]
在另一个实施方案中，铰链结构域是对应于kirrdss(seq id no:12)的kir2ds2铰链。
[0220]
在一个实施方案中，铰链结构域包含cd8铰链的氨基酸序列(seq id no:13)或与seq id no:13具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，铰链结构域是由核酸序列seq id no:14或与seq id no:14具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码的cd8铰链。
[0221]
在另一个实施方案中，铰链结构域包含igg4铰链的氨基酸序列(seq id no:15)，
或与seq id no:15具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99同一性的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，铰链结构域是由核酸序列seq id no:16或与seq id no:16具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码的igg4铰链。
[0222]
在另一个实施方案中，铰链结构域包含igd铰链的氨基酸序列(seq id no:17)或与seq id no:17具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，铰链结构域是由核酸序列seq id no:18或与seq id no:18具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码的igd铰链。
[0223]
在另一个实施方案中，铰链区包含cd28铰链的氨基酸序列(seq id no:19)或与seq id no:19具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，铰链结构域是由核酸seq id no:20或与seq id no：20具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码的cd28铰链。
[0224]
可用于本发明的嵌合受体的跨膜结构域的示例包括但不限于，t细胞受体的α、β或ζ链的跨膜结构域，或以下的跨膜结构域：cd28、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、kirds2、ox40、cd2、cd27、lfa-1(cd1 la、cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd40、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7r a、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、pd1、itgax、cdl1c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(触觉的)、ceacam1、crt am、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cdioo(sema4d)、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、sellpg(cd162)、ltbr、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d和/或nkg2c。
[0225]
在一个实施方案中，跨膜结构域包含cd8跨膜结构域的氨基酸序列(seq id no:21)或与seq id no:21具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，跨膜结构域包含具有seq id no:21的氨基酸序列的具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，或与seq id no:21具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
[0226]
在另一个实施方案中，跨膜结构域由cd8跨膜结构域的核苷酸序列(seq id no:22)或与seq id no:22具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
[0227]
在另一个实施方案中，跨膜结构域包含cd28跨膜结构域的氨基酸序列(seq id no:23)或与seq id no:23具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，跨膜结构域是由核酸序列seq id no:24或与seq id no:24具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码的cd28跨膜结构域。
[0228]
在一个实施方案中，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下，其将主要包含疏水性氨基酸，例如缬氨酸或亮氨酸。
[0229]
在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包含其来源分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域，或其功能性片段或衍生物。
[0230]
在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含t细胞第一信号传导结构域(或衍
生自其的序列)以及任选地，t细胞共刺激分子的一个或多个细胞内结构域(或衍生自其的序列)。
[0231]
在一个实施方案中，本发明的car的细胞内信号传导结构域包含第一信号传导结构域。
[0232]
在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含t细胞共刺激分子的一个或多个细胞内结构域。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域由t细胞共刺激分子的一个或多个细胞内结构域组成。
[0233]
在另一个实施方案中，本发明的car的细胞内信号传导结构域包含至少一个共刺激结构域和第一信号传导结构域。
[0234]
在另一个实施方案中，本发明的car的细胞内信号传导结构域包含至少两个共刺激结构域和第一信号传导结构域。
[0235]
在本发明的一个实施方案中，t细胞第一信号传导结构域包含选自以下的组的蛋白的信号传导结构域：cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、常见(common)fcrγ(fcer1g)、fcrβ(fcεrib)、cd79a、cd79b、fcγriia、dap10和dap12以及衍生自其的序列。
[0236]
在一个实施方案中，t细胞第一信号传导结构域包含cd3ζ的功能性信号传导结构域或由其组成。
[0237]
在一个实施方案中，t细胞第一信号传导结构域包含seq id no:25、26、61或62的cd3-ζ结构域的氨基酸序列，或与seq id no:25、26、61或62具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
[0238]
在另一个实施方案中，cd3ζ第一信号传导结构域包含具有seq id no：25、26、61或62的氨基酸序列的具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，或与seq id no：25、26、61或62具有至少约95，优选约96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
[0239]
因此，在一个实施方案中，编码t细胞第一信号传导结构域的核酸序列包含seq id no:27或seq id no:28的cd3-ζ结构域的核酸序列，或与seq id no:27或seq id no:28具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或由其组成。
[0240]
以刺激性方式起作用的t细胞第一信号传导结构域可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itams)的信号传导基序。
[0241]
在本发明中有特定用途的包含itam的t细胞第一细胞内信号传导结构域的示例包括但不限于cd3ζ、常见fcrγ(fcer1g)、fcγriia、fcrβ(fcεr1b)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd66b、cd79a、cd79b、dap10和dap12的那些(或衍生自其的)。
[0242]
在一个实施方案中，t细胞第一信号传导结构域包含修饰的itam域，例如与天然itam结构域相比活性改变(例如增加或减少)的突变的itam域。在一个实施方案中，第一信号传导结构域包括含修饰的itam的第一细胞内信号传导结构域，例如含优化的和/或截短的itam的第一细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，第一信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个itam基序。
[0243]
在一个实施方案中，本发明的car的细胞内信号传导结构域包含与一个或多个共刺激信号传导结构域组合的t细胞第一信号传导结构域(例如cd3-ζ信号传导结构域)。
[0244]
t细胞共刺激分子的细胞内结构域的示例包括但不限于选自以下的组的蛋白的信
号传导结构域：cd27、cd28、4-1bb(cd137)、mhc i类分子、btla、toll配体受体、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos(cd278)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、与cd83特异性结合的配体、cds、icam-1、gitr、arhr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd160(by55)、cd19、cd19a、cd4、cd8α、cd8β、il2ra、il6ra、il2rβ、il2rγ、il7rα、il-13ra1/ra2、il-33r(il1rl1)、il-10ra/rb、il-4r、il-5r(csf2rb)、il-21r、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a/cd18、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、itgb7、nkg2d、nkg2c、ctla-4(cd152)、cd95、tnfr1(cd120a/tnfrsf1a)、tnfr2(cd120b/tnfrsf1b)、tgfbr1/2/3、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(触觉的)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、常见(common)γ链、与cd83特异性结合的配体、nkp44、nkp30、nkp46或nkg2d，和其任何组合。
[0245]
在本发明的一个实施方案中，嵌合受体包含至少一个选自包括4-1bb、icos、cd27、ox40、cd28、ctla4和pd-1的组的t细胞共刺激分子的细胞内结构域。
[0246]
在一个实施方案中，t细胞共刺激信号传导结构域包含4-1bb细胞内结构域的氨基酸序列(seq id no:29)或与seq id no:29具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，t细胞共刺激信号传导结构域包含具有seq id no:29的氨基酸序列的具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列或由其组成。
[0247]
在一个实施方案中，t细胞共刺激信号传导结构域包含cd27细胞内结构域的氨基酸序列(seq id no:30)或与seq id no:30具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，t细胞共刺激信号传导结构域包含具有seq id no:30的氨基酸序列的具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列或由其组成。
[0248]
在一个实施方案中，t细胞共刺激信号传导结构域包含cd28细胞内结构域的氨基酸序列(seq id no:31)或与seq id no:31具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，t细胞共刺激信号传导结构域包含具有seq id no:31的氨基酸序列的具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列或由其组成。
[0249]
在本发明的一个实施方案中，嵌合受体包含至少两个t细胞共刺激分子的细胞内结构域的组合，优选选自cd28的细胞内结构域、cd27的细胞内结构域和4-1bb的细胞内结构域。
[0250]
在一个实施方案中，嵌合受体包含4-1bb细胞内结构域的氨基酸序列(seq id no:29)或与seq id no:29具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及cd27细胞内结构域的氨基酸序列(seq id no:30)或与seq id no:30具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
[0251]
在另一个实施方案中，嵌合受体包含4-1bb细胞内结构域的氨基酸序列(seq id no:29)或与seq id no:29具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序
列，以及cd28细胞内结构域的氨基酸序列(seq id no:31)或与seq id no:31具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
[0252]
在另一个实施方案中，嵌合受体包含cd27细胞内结构域的氨基酸序列(seq id no:30)或与seq id no:30具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及cd28细胞内结构域的氨基酸序列(seq id no:31)或与seq id no:31具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
[0253]
在一个实施方案中，嵌合受体包含4-1bb细胞内结构域的氨基酸序列(seq id no:29)或与seq id no:29具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及cd27细胞内结构域的氨基酸序列(seq id no:30)或与seq id no:30具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，以及cd28细胞内结构域的氨基酸序列(seq id no:31)或与seq id no:31具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
[0254]
因此，在一个实施方案中，编码t细胞共刺激信号传导结构域的核酸序列包含4-1bb细胞内结构域的核酸序列(seq id no:32)或与seq id no:32具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，和/或cd27细胞内结构域的核酸序列(seq id no:33)或与seq id no:33具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，和/或cd28细胞内结构域的核酸序列(seq id no:34)，或与seq id no:34具有至少约95％，优选约96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
[0255]
在一个实施方案中，本发明的car的细胞内信号传导结构域包含：
[0256]-seq id no:29的4-1bb细胞内结构域的氨基酸序列或与seq id no:29具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或seq id no:30的cd27细胞内结构域的氨基酸序列，或与seq id no:30具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或seq id no:31的cd28细胞内结构域的氨基酸序列或与seq id no:31具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和
[0257]-seq id no:25、26、61或62的cd3-ζ细胞内结构域的氨基酸序列，或与seq id no:25、26、61或62具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
[0258]
其中包含在细胞内结构域中的序列在相同框中并以单条多肽链表达。
[0259]
因此，在一个实施方案中，编码本发明的car的细胞内信号传导结构域的核酸序列包含：
[0260]-seq id no:32的4-1bb细胞内结构域的核酸序列或与seq id no:32具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，和/或seq id no 33的cd27细胞内结构域的核酸序列或与seq id no:33具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，和/或seq id no:34的cd28细胞内结构域的核酸序列或与seq id no:34具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列；和
[0261]-seq id no:27或seq id no:28的cd3-ζ细胞内结构域的核酸序列，或与seq id no:27或seq id no:28具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的序列。
[0262]
在一个实施方案中，本发明的car的细胞内信号传导结构域包含可以以随机或指定顺序彼此连接的至少两个不同的结构域(例如，第一信号传导结构域和t细胞共刺激分子的至少一个细胞内结构域)。
[0263]
任选地，例如长度在2至10个氨基酸之间(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸)的短的寡肽接头或多肽接头可以形成不同信号传导结构域间的连接。在一个实施方案中，使用甘氨酸-丝氨酸双联体(gs)作为合适的接头。在一个实施方案中，使用单个氨基酸例如丙氨酸(a)、甘氨酸(g)作为合适的接头。本文中描述了接头的其他示例。
[0264]
在另一个实施方案中，本发明的car的细胞内信号传导结构域包含两个或更多个，例如2个、3个、4个、5个或更多个共刺激信号传导结构域。在另一个实施方案中，该两个或更多个，例如2个、3个、4个、5个或更多个共刺激信号传导结构域被接头分子，例如上文所述的接头分子分隔开。
[0265]
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体的细胞内信号传导结构域包含cd3-ζ的第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)和cd28的共刺激信号传导结构域(优选seq id id:31)。
[0266]
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体的细胞内信号传导结构域包含cd3-ζ的第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)和4-1bb的共刺激信号传导结构域(优选seq id no:29)。
[0267]
在另一个实施方案中，本发明的嵌合受体的细胞内信号传导结构域包含cd3-ζ的信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)和cd27的信号传导结构域(优选seq id no:30)。
[0268]
在一个实施方案中，本发明的car进一步包含位于il-23r特异性细胞外结合结构域n-末端的前导序列。前导序列的一个非限制性示例是可以包含序列seq id no:39或由其组成的cd8的前导序列。
[0269]
在一个实施方案中，car进一步包含标签，例如用于质量控制、富集、体内追踪等的标签。所述标签可以位于n-末端、c-末端和/或内部。可以用于本发明的car中的标签的示例是技术人员公知的。例如但不限于，本发明中使用的标签可以是选自包含以下或由其组成的组的标签：血凝素标签、聚精氨酸标签、聚组氨酸标签、myc标签、链球菌标签、s-标签、hat标签、3x flag标签、钙调蛋白结合肽标签、sbp标签、壳多糖结合结构域标签、gst标签、麦芽糖结合蛋白标签、荧光蛋白标签、t7标签、v5标签和xpress标签。标签的其他示例包括但不限于nwshpqfek(seq id no:59)或sawshpqfek(seq id no:60)。
[0270]
在一个实施方案中，本发明的car进一步包含p2a(seq id no:44)和gfp(seq id no:45)序列。
[0271]
根据第一实施方案，本发明的car包含细胞外il-23r结合结构域，任选地，细胞外铰链结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
[0272]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0273]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0274]
在另一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd8的铰链结构域(优选seq id no:13)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0275]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd8的铰链结构域(优选
seq id no:13)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0276]
在另一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igg4的铰链结构域(优选seq id no:15)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0277]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igg4的铰链结构域(优选seq id no:15)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0278]
在另一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igd的铰链结构域(优选seq id no:17)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0279]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igd的铰链结构域(优选seq id no:17)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0280]
在另一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的铰链结构域(优选seq id no:19)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0281]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的铰链结构域(优选seq id no:19)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0282]
根据第二实施方案，本发明的car包含il-23r结合结构域，任选地，细胞外铰链结构域、跨膜结构域、t细胞共刺激分子的单个细胞内结构域和t细胞第一信号传导结构域。
[0283]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0284]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0285]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0286]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0287]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0288]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构
id no:29)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0302]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igd的铰链结构域(优选seq id no:17)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0303]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igd的铰链结构域(优选seq id no:17)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0304]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igd的铰链结构域(优选seq id no:17)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0305]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igd的铰链结构域(优选seq id no:17)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0306]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igd的铰链结构域(优选seq id no:17)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0307]
在另一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的铰链结构域(优选seq id no:19)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0308]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的铰链结构域(优选seq id no:19)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0309]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的铰链结构域(优选seq id no:19)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0310]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的铰链结构域(优选seq id no:19)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0311]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的铰链结构域(优选seq id no:19)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0312]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的铰链结构域(优选seq id no:19)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0313]
根据第三实施方案，本发明的car包含il-23r结合结构域，任选地，细胞外铰链结构域、跨膜结构域、t细胞共刺激分子的两个细胞内结构域和t细胞第一信号传导结构域。
[0314]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0315]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0316]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0317]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0318]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0319]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0320]
在另一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd8的铰链结构域(优选seq id no：13)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no：21)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no：29)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no：30)；和cd3-ζ主要信号传导结构域(优选seq id no：25、26、61或62)。
[0321]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd8的铰链结构域(优选seq id no:13)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0322]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd8的铰链结构域(优选seq id no:13)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0323]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd8的铰链结构域(优选seq id no:13)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0324]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd8的铰链结构域(优选seq id no:13)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0325]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd8的铰链结构域(优选seq id no:13)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0326]
在另一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igg4的铰链结构域(优选seq id no:15)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0327]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igg4的铰链结构域(优选seq id no:15)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0328]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igg4的铰链结构域(优选seq id no:15)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0329]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igg4的铰链结构域(优选seq id no:15)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0330]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igg4的铰链结构域(优选seq id no:15)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0331]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igg4的铰链结构域(优选seq id no:15)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0332]
在另一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igd的铰链结构域，优选包含氨基酸序列seq id no:17；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0333]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igd的铰链结构域(优选seq id no:17)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0334]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igd的铰链结构域(优选seq id no:17)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0335]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igd的铰链结构域(优选seq id no:17)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选
seq id no:25、26、61或62)。
[0336]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igd的铰链结构域(优选seq id no:17)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0337]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；igd的铰链结构域(优选seq id no:17)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0338]
在另一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的铰链结构域(优选seq id no:19)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0339]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的铰链结构域(优选seq id no:19)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0340]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的铰链结构域(优选seq id no:19)；cd8的跨膜结构域(优选seq id no:21)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0341]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的铰链结构域(优选seq id no:19)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0342]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的铰链结构域(优选seq id no:19)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；4-1bb的细胞内结构域(优选seq id no:29)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0343]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域；cd28的铰链结构域(优选seq id no:19)；cd28的跨膜结构域(优选seq id no:23)；cd27的细胞内结构域(优选seq id no:30)；cd28的细胞内结构域(优选seq id no:31)；和cd3-ζ第一信号传导结构域(优选seq id no:25、26、61或62)。
[0344]
在一个实施方案中，本发明的car包含(i)il-23r结合结构域，(ii)人cd28的铰链区，(iii)人cd28的跨膜结构域，(iv)人cd28的细胞内结构域和(v)人cd3ζ链的细胞内结构域。
[0345]
在一个实施方案中，包含人cd28的铰链区、人cd28的跨膜结构域、人cd28的细胞内结构域和人cd3ζ链的细胞内结构域的car的部分对应于seq id no:35或63的氨基酸序列，或与seq id no:35或63具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序
列。
[0346]
在一个实施方案中，本发明的car包含il-23r结合结构域，其连接至seq id no:35或63的氨基酸序列，或与seq id no:35或63具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
[0347]
在另一个实施方案中，本发明的car包含(i)il-23r结合结构域，(ii)人cd8的铰链区，(iii)人cd8的跨膜结构域，(iv)人4-1bb的细胞内结构域和(v)人cd3ζ的细胞内结构域。在一个实施方案中，包含人cd8的铰链区、人cd8的跨膜结构域、人4-1bb的细胞内结构域和人cd3ζ的细胞内结构域的car的部分包含氨基酸序列seq id no:49、50、70或71，或与seq id no:49、50、70或71具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。
[0348]
在另一个实施方案中，本发明的car包含(i)il-23r结合结构域，(ii)人cd8的铰链区，(iii)人cd8的跨膜结构域，(iv)人cd28的细胞内结构域和(v)人cd3ζ的细胞内结构域。在一个实施方案中，包含人cd8的铰链区、人cd8的跨膜结构域、人cd28的细胞内结构域和人cd3ζ的细胞内结构域的car的部分包含氨基酸序列seq id no:51或72，或与seq id no:51或72具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。
[0349]
在一个实施方案中，本发明的car包含抗il-23r scfv(例如，包含序列seq id no:55、36或57，优选seq id no:55，或由其组成)、cd8的铰链区、人cd8的跨膜结构域、人4-1bb的细胞内结构域和人cd3ζ的细胞内结构域。在一个实施方案中，所述car包含seq id no:41、43、65或67，或与seq id no:41、43、65或67具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
[0350]
在一个实施方案中，本发明的car包含cd8的前导序列、抗il-23r scfv(例如，包含序列seq id no:55、36或57，优选seq id no:55，或由其组成)、cd8的铰链区、人cd8的跨膜结构域、人4-1bb的细胞内结构域和人cd3ζ的细胞内结构域。在一个实施方案中，所述car包含seq id no:40、42、64或66，或与seq id no:40、42、64或66具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
[0351]
在一个实施方案中，本发明的car包含抗il-23r scfv(例如，包含序列seq id no:55、36或57，优选seq id no:55，或由其组成)、cd8的铰链区、人cd8的跨膜结构域、人cd28的细胞内结构域和人cd3ζ的细胞内结构域。在一个实施方案中，所述car包含seq id no:48、53、69或74，或与seq id no:48、53、69或74具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
[0352]
在一个实施方案中，本发明的car包含cd8的前导序列、抗il-23r scfv(例如，包含序列seq id no:55、36或57，优选seq id no:55，或由其组成)、cd8的铰链区、人cd8的跨膜结构域、人cd28的细胞内结构域和人cd3ζ的细胞内结构域。在一个实施方案中，所述car包含seq id no:47、52、68或73，或与seq id no:47、52、68或73具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
[0353]
在一个实施方案中，本发明的car包含具有seq id no:39的cd8前导序列、包含具有序列seq id no:37的v
h
和具有seq id no:38的v
l
且通过(g4s)3接头(seq id no:3)连接的抗人il-23r scfv、衍生自cd8α的具有seq id no:13序列的铰链结构域、具有seq id no:21的人cd8α跨膜结构域和包含具有seq id no:29的人4-1bb信号传导结构域的细胞内信号
传导结构域，和具有seq id no:26的人cd3ζ结构域。
[0354]
在一个实施方案中，本发明的car包含含有具有序列seq id no:37的v
h
和具有seq id no:38的v
l
且通过(g4s)3接头(seq id no:3)连接的抗人il-23r scfv、衍生自cd8α的具有seq id no:13序列的铰链结构域、具有seq id no:21的人cd8α跨膜结构域和包含具有seq id no:29的人4-1bb信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，和具有seq id no:26的人cd3ζ结构域。
[0355]
在一个实施方案中，本发明的car具有序列seq id no:54或与seq id no:54具有至少约95，优选约96％、97％、98％或99％同一性的序列。
[0356]
本发明进一步涉及经工程化以在细胞表面表达如上所述的car的t细胞，优选分离的t细胞。
[0357]
本发明还涉及包含经工程化以在细胞表面表达如上所述的car的细胞的分离的和/或基本上纯化的t细胞群。
[0358]
在一个实施方案中，本发明的t细胞抑制在其表面表达由car识别的il-23r的细胞。
[0359]
在一个实施方案中，本发明的t细胞对在其表面表达由car识别的il-23r的细胞具有细胞毒性。
[0360]
在一个实施方案中，本发明的t细胞群包含调节性t细胞(treg)、cd8
+
t细胞、cd4
+
t细胞和nk t细胞，或由其组成。
[0361]
在一实施方案中，本发明的t细胞是treg细胞。
[0362]
在一个实施方案中，t细胞是调节性免疫细胞，例如任何适用于细胞疗法的调节性免疫细胞。
[0363]
在一个实施方案中，本发明的treg细胞群全都表达如本文所定义的嵌合受体(car)，并且因此可以被定义为car-单特异性的(即，所有treg细胞使用它们表达的car识别相同的抗原(il-23r))。在一个实施方案中，treg细胞群是tcr-单特异性的(即，所有treg细胞使用其tcr识别相同的抗原)。在另一个实施方案中，treg细胞群是tcr-多特异性的(即，treg细胞可以用其tcr识别不同的抗原)。
[0364]
在一个实施方案中，treg细胞群是tcr-单特异性的，并且tcr识别抗原、抗原片段、抗原变体或其混合物。
[0365]
在一个实施方案中，treg细胞群是tcr-单特异性的，并且tcr对来自普通人类饮食的食物抗原特异。
[0366]
在另一个实施方案中，treg细胞群体是tcr-单特异性的，并且tcr对自身抗原特异，自身抗原例如是多发性硬化相关抗原、关节相关抗原、眼相关抗原、人hsp抗原、皮肤相关抗原或参与移植排斥或gvhd的抗原。本文给出了自身抗原，特别是多发性硬化相关抗原、关节相关抗原、眼相关抗原、人hsp抗原、皮肤相关抗原以及参与移植排斥或gvhd的抗原的示例。
[0367]
在另一个实施方案中，treg细胞群是tcr-单特异性的，并且tcr对吸入性过敏原、摄入性过敏原或接触性过敏原具有特异性。
[0368]
在一个实施方案中，treg细胞群是tcr-单特异性的，并且tcr对选自包含卵白蛋白、mog、ii型胶原片段、其变体和混合物的组的抗原具有特异性。
[0369]
在一个实施方案中，treg细胞群是tcr-单特异性的，并且tcr对卵白蛋白，其片段、变体和混合物具有特异性。
[0370]
在另一个实施方案中，treg细胞群体是tcr-单特异性的，并且tcr对mog，其片段、变体和混合物具有特异性。
[0371]
在另一个实施方案中，treg细胞群是tcr-单特异性的，并且tcr对ii型胶原蛋白，其片段、变体和混合物具有特异性。
[0372]
在一个实施方案中，表达本发明的car的treg细胞抑制表达由car识别的il-23r的细胞。
[0373]
在一个实施方案中，当由treg细胞表达时，本发明的car赋予treg细胞与在其细胞表面表达il-23r的细胞结合并被il-23r激活的能力，不同于treg细胞对其具有或将具有特异性或被其激活的抗原。
[0374]
因此，本发明的treg细胞群可以被定义为重定向的treg细胞群。如本文所用，术语“重定向”指携带如本文所述的嵌合受体的treg细胞，其赋予了treg细胞与配体结合并被其激活的能力，该配体不同于treg细胞对其具有或将具有特异性或被其激活的配体。
[0375]
在一个实施方案中，本发明的treg细胞是非细胞毒性的。在另一个实施方案中，本发明的treg细胞是细胞毒性的。
[0376]
表达il-23r的细胞的示例包括但不限于th17、αβt细胞、嗜中性粒细胞、γδt细胞、nk、nkt、树突细胞和巨噬细胞。
[0377]
在一个实施方案中，本发明的treg细胞可以选自包含以下的组：cd4
+
cd25
+
foxp3
+
treg、tr1细胞、分泌tgf-β的th3细胞、调节性nk t细胞、调节性γδt细胞、调节性cd8
+
t细胞和双阴调节性t细胞。
[0378]
在一个实施方案中，调节性细胞是cd4
+
调节性t细胞(treg)。在一个实施方案中，treg是胸腺来源的treg，或适应性或诱导性treg。在一个实施方案中，treg是cd4
+
foxp3
+
调节性t细胞或cd4
+
foxp3-调节性t细胞(tr1细胞)，优选cd4
+
foxp3
+
调节性t细胞。
[0379]
在一个实施方案中，调节性细胞是cd8
+
调节性t细胞(treg)。在一个实施方案中，cd8
+
调节性t细胞选自由以下组成的组：cd8
+
cd28-调节性t细胞、cd8
+
cd103
+
调节性t细胞、cd8
+
foxp3
+
调节性t细胞、cd8
+
cd122
+
调节性t细胞，和其任意组合。在一个实施方案中，调节性细胞是infγ
+
il10
+
il34
+
cd8
+
cd45rc
低
调节性t细胞。
[0380]
在一个实施方案中，本发明的treg细胞是哺乳动物细胞，优选人treg细胞。
[0381]
在一个实施方案中，treg源自干细胞，例如诱导性干细胞，包括但不限于诱导性多能干细胞(ips或ipsc)。
[0382]
如本文所用，术语“诱导性多能干细胞”、“ips”或“ipsc”指通过去分化或重编程衍生自非多能细胞，特别是成年体细胞的人工多能干细胞。特别地，可以通过将一组特定的多能性相关基因引入细胞中来获得ipsc，例如，转录因子oct4(pou5f1)、sox2、cmyc和klf4。除了其形态、自我更新特性和多能性与胚胎干细胞的相似外，ipsc还表现出具有与胚胎干细胞非常接近的组蛋白甲基化以及基因表达的整体谱的表观遗传重编程。ipsc尤其表达多能性标志物，例如nanog、sox2、oct4和ssea3/4蛋白。
[0383]
在一个实施方案中，调节性细胞具有以下表型：cd4
+
cd25
+
，例如cd4
+
cd25
+
cd127-，例如cd4
+
cd25
+
cd127-cd45ra
+
。优选地，调节性免疫细胞具有以下表型：foxp3
+
cd4
+
cd25
+
，例
如foxp3
+
cd4
+
cd25
+
cd127-，例如foxp3
+
cd4
+
cd25
+
cd127
+
cd127-cd45ra
+
。
[0384]
在一个实施方案中，调节性细胞呈现以下表型的至少一个：cd4
+
cd25
+
、foxp3
+
、cd127
lo/-、ctla-4
+
、cd39
+
、helios
+
、cd62l
+/hi
、vla4
+
、lfa1
+
、cd49b
int
、itgb7
int
、psgl-1
+
、icos
+
、gitr
+
、pd-1
int
、perf
lo/-、ccr7
+
。在一个实施方案中，免疫调节性细胞不表达粒酶a和/或粒酶b。
[0385]
在一个实施方案中，通过流式细胞术、免疫荧光或图像分析，例如高含量分析，来进行分子表达水平的确定。优选地，通过流式细胞术进行分子表达水平的确定。在一个实施方案中，在进行流式细胞术分析之前，将细胞固定并透化，从而允许检测细胞内蛋白。
[0386]
在一个实施方案中，确定细胞群中的分子表达水平包括确定细胞群中表达该分子的细胞(即对于分子的细胞“+”)的百分比。优选地，通过facs测量所述表达该分子的细胞百分比。
[0387]
术语“表达(或+)”和“不表达(或-)”是本领域公知的，并且指目标细胞标志物的表达水平，其中对应于“+”的细胞标志物表达水平是高的或中等的，也称为“+/
-”
，且对应于
“-”
的细胞标志物表达水平是空的。
[0388]
术语“低”或“lo”或“lo/
-”
是本领域公知的，并且指目标细胞标志物的表达水平，其中细胞标志物的表达水平低于以整体进行分析的细胞群中该细胞标志物的表达水平。更特别地，术语“lo”指细胞标志物的表达水平低于一个或多个其他不同细胞群的不同细胞群。
[0389]
术语“高”或“hi”或“亮”是本领域中公知的，且指目标细胞标志物的表达水平，其中细胞标志物的表达水平高于以整体进行分析的细胞群中该细胞标志物的表达水平。
[0390]
通常，将染色强度前2、3、4或5％的细胞指定为“hi”，并将落入群体前一半的细胞归为“+”。将那些落入荧光强度后50％的细胞指定为“lo”细胞，且低于5％的为
“-”
细胞。
[0391]
通过比较用对该标志物特异的荧光标记的抗体染色的细胞群中的细胞的中值荧光强度(mfi)与用具有无关特异性但具有相同的同种型、相同的荧光探针以及来源于相同的物种的荧光标记的抗体(称为同种型对照)染色的同一细胞群中的细胞的荧光强度(fi)，来确定目标细胞标志物的表达水平。来自用对该标志物特异的荧光标记的抗体染色的群的且显示出与同种型对照染色的细胞相比相当的mfi或更低的mfi的细胞不表达该标志物并且然后被指定为(-)或阴性。来自用对该标志物特异的荧光标记的抗体染色的群的且显示出与同种型对照染色的细胞相比更高的mfi的细胞表达该标志物并且然后被指定为(+)或阳性。
[0392]
在一个实施方案中，本发明的treg细胞群的细胞在其细胞表面表达本发明的car，以及与除由本发明的car识别的il-23r之外的另一配体结合的另一受体(本文称为“第二受体”)。根据本发明，该另一受体包含如前所述的细胞外配体结合结构域，任选的铰链，任选的跨膜结构域，以及细胞内信号传导结构域。
[0393]
在一个实施方案中，第二受体是内源的(例如内源tcr)。在另一个实施方案中，第二受体是外源的，且其表达在本发明的treg细胞群的细胞中由编码其的核酸的转化或转导来诱导。所述外源受体可以是外源tcr或car。因此，在一个实施方案中，本发明的treg细胞表达两种car，其中第一种识别il-23r，且第二种识别不同的配体。在另一个实施方案中，本发明的treg细胞表达两种car，其中第一种识别il-23r上的第一个表位，且第二种识别同一
il-23r上的不同表位。在另一个实施方案中，本发明的treg细胞表达两种car，其中第一种识别il-23r，且第二种识别不同的il-23r(例如il-23r的变体)。
[0394]
在一个实施方案中，本发明的car和第二受体(优选第二car)中的至少一个是可诱导的，即，其在细胞表面上的表达可以被诱导。
[0395]
在一个实施方案中，通过另一受体的激活来诱导本发明的car和第二受体(优选第二car)之一的表达。在第一实施方案中，通过第二受体的激活来诱导本发明的car的表达。在第二实施方案中，通过本发明的car的激活来诱导第二受体的表达。本领域中先前已描述了可诱导的car，例如roybal等人(cell，2006)。
[0396]
在一个实施方案中，第二受体，优选第二car，对抗原、抗原片段、抗原变体或其混合物具有特异性。
[0397]
在一个实施方案中，第二受体，优选第二car，对来自普通人类饮食的食物抗原具有特异性。
[0398]
术语“来自普通人类饮食的食物抗原”指来自人类常见食物的免疫原性肽，例如以下非限制性列表的食物抗原：牛抗原，例如脂质运载蛋白、钙结合s100、α-乳清蛋白、乳球蛋白如β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白。食物抗原也可以是大西洋鲑鱼抗原，例如小白蛋白；鸡抗原，例如类卵粘蛋白、卵白蛋白、ag22、伴清蛋白、溶菌酶或鸡血清白蛋白；花生抗原；虾抗原，例如原肌球蛋白；小麦抗原，例如凝集素或麦醇溶蛋白；芹菜抗原，例如芹菜抑制蛋白；胡萝卜抗原，例如胡萝卜抑制蛋白；苹果抗原，例如索马甜、苹果脂质转移蛋白或苹果抑制蛋白；梨抗原，例如梨抑制蛋白或异黄酮还原酶；鳄梨抗原，例如内切几丁质酶；杏抗原，例如杏脂质转移蛋白；桃子抗原，例如桃子脂质转移蛋白或桃子抑制蛋白；大豆抗原，例如hps、大豆抑制蛋白或(sam22)pr-10prot；其片段、变体及混合物。
[0399]
在另一个实施方案中，第二受体，优选第二car，对自身抗原具有特异性，例如多发性硬化相关抗原、关节相关抗原、眼相关抗原、人hsp抗原、皮肤相关抗原或参与移植排斥或gvhd的抗原。
[0400]
多发性硬化相关抗原的示例包括但不限于髓磷脂碱性蛋白(mbp)、髓磷脂相关糖蛋白(mag)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(mog)、蛋白脂蛋白(plp)、少突胶质细胞髓磷脂寡蛋白(omgp)、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(mobp)、少突胶质细胞特异性蛋白(osp/claudinl 1)、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白(osp)、nogo a、糖蛋白po、外周髓磷脂蛋白22(pmp22)、2'3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶(cnpase)，其片段、变体和混合物。
[0401]
关节相关抗原的示例包括但不限于瓜氨酸取代的环状和线性丝聚蛋白肽，ii型胶原蛋白肽，人软骨糖蛋白39(hcgp39)肽，hsp，异源核核糖核蛋白(hnrnp)a2肽，hnrnp b1，hnrnp d，ro60/52，hsp60、hsp65、hsp70和hsp90，bip，角蛋白，波形蛋白，纤维蛋白原，i、iii、iv和v型胶原蛋白肽，膜联蛋白v，葡萄糖6磷酸异构酶(gpi)，乙酰基-钙蛋白酶抑素，丙酮酸脱氢酶(pdh)，醛缩酶，拓扑异构酶i，snrnp，parp，scl-70，scl-100，包括阴离子心磷脂和磷脂酰丝氨酸的磷脂抗原，带中性电荷的脑磷脂和卵磷脂，基质金属蛋白酶，原纤蛋白，软骨蛋白聚糖，其片段、变体和混合物。关节相关抗原的其他示例包括但不限于瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化ii型胶原蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白原。
[0402]
眼相关抗原的示例包括但不限于ii型胶原蛋白、视网膜抑制蛋白，s-抑制蛋白，光受体间类视黄醇结合蛋白(irbp1)、β-晶体蛋白b1、视网膜蛋白、脉络膜蛋白及其片段、变体
和混合物。
[0403]
人hsp抗原的示例包括但不限于人hsp60、hsp70、hsp90，其片段、变体和混合物。
[0404]
在一个实施方案中，抗原是炎性神经系统病况相关抗原，优选多发性硬化相关抗原。炎性神经系统病况相关抗原，优选多发性硬化相关抗原的示例包括但不限于髓磷脂碱性蛋白(mbp)、髓磷脂相关糖蛋白(mag)、髓磷脂少突胶质细胞蛋白(mog)、蛋白脂蛋白(plp)、少突胶质细胞髓磷脂寡蛋白(omgp)、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(mobp)、少突胶质细胞特异性蛋白(osp/claudinl 1)、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白(osp)、nogo a、糖蛋白po、外周髓磷脂蛋白22(pmp22)、2'3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶(cnpase)，其片段、变体和混合物。
[0405]
在一个实施方案中，抗原是皮肤相关抗原。皮肤相关抗原的示例包括但不限于角质形成细胞抗原、存在于真皮或表皮中的抗原、黑色素细胞抗原(例如黑色素或酪氨酸酶)、桥粒芯糖蛋白(例如桥粒芯糖蛋白1或3，也可以称为dsg1/3)、bp180、bp230、网蛋白(plectin)、整联蛋白(例如整联蛋白α4β6)、胶原蛋白(例如vii型胶原蛋白)、层粘连蛋白(例如层粘连蛋白332或层粘连蛋白γ1)、血小板溶素(例如包斑蛋白(envoplakin)、周斑蛋白(periplakin)或桥粒斑蛋白(desmoplakin))、角蛋白(例如krt5、krt8、krt15、krt17和krt31)、角蛋白丝相关蛋白、丝聚蛋白、角化粒素(corneodesmosin)蛋白和弹性蛋白。
[0406]
在一个实施方案中，抗原是参与移植排斥或gvhd的抗原。这些抗原的示例包括但不限于对移植组织或宿主特异的mhc、β2-微球蛋白、来自abo系统的抗原、来自恒河猴系统的抗原(尤其是来自c、c、e和e和d系统的抗原)和异血细胞凝集素。可参与移植排斥或gvhd的抗原的其他示例包括但不限于hla-dr(尤其是在移植后的前六个月)、hla-b(尤其是在移植后的前两年)、hla-a、次要组织相容性抗原(miha，例如hla-e、hla-f和hla-g)、对应于i类mhc的hla(a、b和c)、对应于ii类mhc的hla(dp、dm、doa、dob、dq和dr)以及对应于iii类mhc的hla(例如补体系统的组分)。
[0407]
在一个实施方案中，抗原是hla-a2细胞表面蛋白。在一个实施方案中，细胞外结合结构域包含针对hla-a2的抗体或其抗原结合片段。
[0408]
如本文所用的术语“hla-a2”指由hla基因复合物的hla-a基因座处的hla-a*02等位基因家族编码的包括细胞表面蛋白的人白细胞抗原(hla)蛋白。术语“hla-a2”涵盖的hla蛋白包括通过血清学测试或基因分型法确定为属于hla-a*02抗原类型的hla蛋白。hla-a*02抗原类型的其他名称包括“hla-a2”、“hla-a02”和“hla-a*2”。已经开发出标识由该等位基因家族编码的hla蛋白的不同命名系统，包括由who hla系统因素委员会于2010年开发的hla命名系统。术语“hla-a2”指等位基因编码的具有根据该命名系统命名的以“hla-a*02”开头的hla蛋白，包括但不限于以“hla-a*02：01”、“hla-a*02：02”、“hla-a*02：03”、“hla-a*02：04”、“hla-a*02：05”、“hla-a*02：06”、“hla-a*02：07”、“hla-a*02：08”、“hla-a*02：09”、“hla-a*02：10”和“hla-a*02：11”开头的名称。等位基因名称可以用斜体表示。以“hla-a*02：”开头，后接2或3个额外数字的等位基因名称可以构成完整名称或名称的开始部分。术语“hla-a2”还指根据该命名系统以“hla-a*02”开头的名称标识的hla蛋白，包括但不限于名称“hla-a*02：01”、“hla-a*02：02”、“hla-a*02：03”、“hla-a*02：04”、“hla-a*02：05”、“hla-a*02：06”、“hla-a*02：07”、“hla-a*02：08”、“hla-a*02：09”、“hla-a*02：10”和“hla-a*02：11”。
[0409]
自身抗原的其他示例包括但不限于水通道蛋白水通道(例如水通道蛋白-4水通道(aqp4))、hu、ma2、坍塌蛋白(collapsin)反应介质蛋白5(crmp5)和双载蛋白、电压门控钾通道(vgkc)、n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmdar)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(ampar)、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、抗n-甲基-d-天冬氨酸受体(nr1亚基)、rh血型抗原、i抗原、桥粒芯糖蛋白1或3(dsg1/3)、bp180、bp230、乙酰胆碱烟碱突触后受体、促甲状腺素受体、血小板整联蛋白、gpiib:iiia、胶原蛋白(例如胶原蛋白α-3(iv)链)、类风湿因子、钙蛋白酶抑素、瓜氨酸化蛋白，髓磷脂碱性蛋白(mbp)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(mog)肽、α-β-晶状体蛋白、dna、组蛋白、核糖体、rnp、组织转谷氨酰胺酶(tg2)、内在因子、65-kda抗原、磷脂酰丝氨酸、核糖体磷蛋白、抗中性粒细胞细胞质抗体、scl-70、u1-rnp、ana、ssa、抗ssb、抗核抗体(ana)、抗中性粒细胞细胞质抗体(anca)、jo-1、抗线粒体抗体、gp210、p62、sp100、抗磷脂抗体、u1-70 kd snrnp、gq1b神经节苷脂、gm1、缺乏唾液酸基的gm1、gd1b、抗平滑肌抗体(asma)、抗肝-肾微粒体1抗体(alkm-1)、抗肝细胞溶质抗体1(alc-1)、iga抗内胚层抗体、中性粒细胞颗粒蛋白、链球菌细胞壁抗原、胃壁细胞内在因子、胰岛素(iaa)、谷氨酸脱羧酶(gaa或gad)和蛋白酪氨酸磷酸酶(例如ia2或ica512)、pla2r1和thsd7a1。
[0410]
在一个实施方案中，抗原是癌抗原。
[0411]
如本文所用，术语“癌抗原”指由癌细胞差异表达，且因此可以被利用以靶向癌细胞的抗原。癌抗原是可以潜在地明显刺激肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些由正常细胞编码，尽管不是必须要表达。这些抗原可以被特征化为在正常细胞中通常沉默(即不表达)的那些，仅在分化的某些阶段表达的那些以及在时间上表达的那些，例如胚胎抗原和胎儿抗原。其他癌抗原由突变的细胞基因编码，例如癌基因(例如，激活的ras癌基因)、抑制基因(例如，突变的p53)和由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白。其他癌抗原也可以由病毒基因编码，例如那些被携带在rna和dna肿瘤病毒上的基因。已经依据多种实体瘤定义了许多肿瘤抗原：通过免疫定义的mage 1、2和3；mart-1/melan-a、gp100、癌胚抗原(cea)、her2、粘蛋白(即muc-1)、前列腺特异性抗原(psa)和前列腺酸性磷酸酶(pap)。此外，已显示病毒蛋白，例如由乙型肝炎(hbv)、爱泼斯坦-巴尔(ebv)和人乳头瘤(hpv)编码的一些，分别对于肝细胞癌、淋巴瘤和宫颈癌的发展是重要的。
[0412]
其他癌抗原包括但不限于707-ap(707丙氨酸脯氨酸)，afp((a)甲胎蛋白)，art-4(被t4细胞识别的腺癌抗原)，bage(b抗原；b-连环蛋白/m，b-连环蛋白/突变的)，bcma(b细胞成熟抗原)，bcr-abl(断点簇区域-abelson)，caix(碳酸酐酶ix)，cd19(分化簇19)，cd20(分化簇20)，cd22(分化簇22)，cd30(分化簇30)，cd33(分化簇33)，cd44v7/8(分化簇44，外显子7/8)，camel(黑色素瘤上ctl识别的抗原)，cap-1(癌胚抗原肽-1)，casp-8(半胱天冬酶-8)，cdc27m(细胞分裂周期27突变的)，cdk4/m(环化素依赖性激酶4突变的)，cea(癌胚抗原)，ct(癌症/睾丸(抗原))，cyp-b(亲环素b)，dam(分化抗原黑色素瘤)，egfr(表皮生长因子受体)，egfrviii(表皮生长因子受体，变体iii)，egp-2(上皮糖蛋白2)，egp-40(上皮糖蛋白40)，erbb2、3、4(成红细胞白血病病毒癌基因同源物-2、-3、4)，elf2m(延伸因子2突变的)，etv6-aml1(ets变体基因6/急性髓细胞白血病1基因ets)，fbp(叶酸结合蛋白)，fachr(胎儿乙酰胆碱受体)，g250(糖蛋白250)，gage(g抗原)，gd2(二唾液酸神经节苷脂2)，gd3(二唾液酸神经节苷脂3)，gnt-v(n-乙酰葡糖氨基转移酶v)，gp100(糖蛋白100kd)，hage
(helicose抗原)，her-2/neu(人表皮受体-2/神经性；也称为egfr2)，hla-a(人白细胞抗原-a)，hpv(人乳头瘤病毒)，hsp70-2m(热休克蛋白70-2突变的)，hst-2(人印戒肿瘤-2)，htert或htrt(人端粒酶逆转录酶)，ice(肠羧基酯酶)，il-13r-a2(白介素-13受体亚基α-2)，kiaa0205，kdr(激酶插入结构域受体)，κ-轻链，lage(l抗原)，ldlr/fut(低密度脂质受体/gdp-l-岩藻糖：b-d-半乳糖苷酶2-a-l岩藻糖基转移酶)，ley(lewis-y抗体)，l1 cam(l1细胞粘附分子)，mage(黑色素瘤抗原)，mage-a1(黑色素瘤相关抗原1)，间皮素，鼠cmv感染的细胞，mart-1/melan-a(t细胞识别的黑色素瘤抗原-i/黑色素瘤抗原a)，mc1 r(黑皮质素1受体)，肌球蛋白/m(肌球蛋白突变的)，muc1(粘蛋白1)，mum-1、-2、-3(黑色素瘤普遍存在的突变的1、2、3)，na88-a(患者m88的na cdna克隆)，nkg2d(自然杀伤组2，成员d)配体，ny-br-1(纽约乳分化抗原1)，ny-eso-1(纽约食管鳞状细胞癌-1)，癌胚抗原(h5t4)，p15(蛋白15)，p190次要bcr-abl(190kd bcr-abl的蛋白)，pml/rara(早幼粒细胞白血病/视黄酸受体a)，prame(黑色素瘤的优先表达抗原)，psa(前列腺特异性抗原)，psca(前列腺干细胞抗原)，psma(前列腺特异性膜抗原)，rage(肾脏抗原)，ru1或ru2(肾脏普遍存在的1或2)，sage(肉瘤抗原)，sart-1或sart-3(排斥鳞状抗原的肿瘤1或3)，ssx1、-2、-3、4(滑膜肉瘤x1、-2、-3、-4)，taa(肿瘤相关抗原)，tag-72(肿瘤相关糖蛋白72)，tel/aml1(易位ets家族性白血病/急性髓细胞白血病1)，tpi/m(磷酸丙糖异构酶突变的)，trp-1(酪氨酸酶相关蛋白1，或gp75)，trp-2(酪氨酸酶相关蛋白2)，trp-2/int2(trp-2/内含子2)，vegf-r2(血管内皮生长因子受体2)，或wt1(维尔姆斯瘤(wilms
’
s tumor)基因)。
[0413]
在一个实施方案中，抗原与被感染的细胞有关。
[0414]
如本文所用，术语“被感染的细胞”指被一些不利地影响其质量、特征或状况的物质污染的细胞。
[0415]
在一个实施方案中，抗原与被病毒感染的细胞有关。在另一个实施方案中，抗原与被细菌感染的细胞有关。在另一个实施方案中，抗原与被真菌感染的细胞有关。在另一个实施方案中，抗原与被寄生虫感染的细胞有关。
[0416]
在另一个实施方案中，第二受体，优选第二car，对吸入性过敏原、摄入性过敏原或接触性过敏原具有特异性。
[0417]
在一个实施方案中，第二受体，优选第二car，对选自包含卵白蛋白、mog、ii型胶原片段，其变体和混合物的组的抗原具有特异性。
[0418]
在一个实施方案中，第二受体，优选第二car，对卵白蛋白，其片段、变体和混合物具有特异性。
[0419]
在另一个实施方案中，第二受体，优选第二car，对mog，其片段、变体和混合物具有特异性。
[0420]
在另一个实施方案中，第二受体，优选第二car，对ii型胶原蛋白，其片段、变体和混合物具有特异性。
[0421]
在一个实施方案中，本发明的car包含第一细胞内信号传导结构域，并且第二受体包含不同的第二细胞内信号传导结构域。在第一实施方案中，本发明的car包含t细胞第一信号传导结构域(例如cd3ζ)，并且第二受体包含共刺激信号传导结构域(例如4-1bb、cd28的共刺激信号传导结构域或4-1bb和cd28的共刺激信号传导结构域的组合)。在第二实施方案中，本发明的car包含共刺激信号传导结构域(例如4-1bb、cd28的共刺激信号传导结构域
或4-1bb和cd28的共刺激信号传导结构域的组合)，并且第二受体包含t细胞第一信号传导结构域(例如cd3ζ)。
[0422]
因此，根据这些实施方案，本发明的treg细胞群的完全激活既需要本发明的car与il-23r结合，又需要第二受体与它所针对的配体结合。
[0423]
在一个实施方案中，由第二受体识别的配体在患病的组织或器官或自身免疫应答的部位处表达或存在。因此，当所述配体存在并被treg细胞群的细胞上的第二受体识别时，表达il-23r的细胞的抑制活性仅在患病的组织或器官或自身免疫应答的部位处被诱导。
[0424]
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体进一步包含识别不同于由嵌合受体识别的il-23r的配体的细胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，所述配体结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
[0425]
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含细胞外配体结合结构域，其包含il-23r结合结构域和另一个识别不同于所述il-23r的配体的配体结合结构域。在一个实施方案中，所述配体结合结构域是识别il-23r和不同配体二者的双功能性抗体。
[0426]
在一个实施方案中，treg细胞群由初始t细胞的体外分化获得。
[0427]
本发明还涉及编码如上所述的car的核酸序列，其中所述核酸序列包含(i)细胞外il-23r结合结构域的核酸序列，(ii)任选地，细胞外铰链结构域的核酸序列，(iii)任选地，跨膜结构域的核酸序列，(iv)细胞内信号传导结构域的一个或多个核酸序列，和(v)任选地，tag和/或前导序列的核酸序列。
[0428]
本发明的另一个目的是包含编码如上所述的car的核酸序列的载体。
[0429]
可用于本发明的载体的示例包括但不限于dna载体、rna载体、质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。
[0430]
病毒载体技术是本领域公知的，并描述于例如sambrook等人(2001,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)中，以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。
[0431]
通常，合适的载体含有在至少一种生物中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一个或多个可选择的标志物，(例如wo01/96584；wo01/29058；和us6,326,193，其通过引用并入本文)。
[0432]
已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选定的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后，可以分离重组病毒并将其体内或离体递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
[0433]
其他的转录活性元件，例如启动子和增强子，可以调控转录起始的频率。通常，关于核心促进(core promote)，这些元件位于起始位点上游的30-110bp区域，尽管最近已显示许多启动子也含有起始位点下游的功能性元件，且增强子元件通常位于起始站点上游的500-2000bp。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件相对于彼此反转或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可在活性开始下降之前增加到50bp。取决于启动子，似乎个体的元件可以协同或独立地起作用以激活转录。
[0434]
合适的启动子的一个示例是立即早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列是能够驱动任何与其有效连接的多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个示例是延伸生长因子-la(ef-la)。合适的启动子的另一个示例是磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子。然而，也可以使用其他的组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也被认为是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，该分子开关能够在需要这种表达时开启与之有效连接的多核苷酸序列的表达，或者在不需要表达时关闭该表达。诱导型启动子的示例包括但不限于金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。另外，允许两个或更多个基因的有效和协调表达的双向启动子也可以是本发明的目的。双向启动子的示例包括但不限于由luigi naldini于us2006200869中描述的启动子，其通过引用并入本文，其公开了包含i)源自巨细胞病毒(cmv)或小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)基因组的第一最小启动子序列和ii)衍生自动物基因的完整有效启动子序列的双向启动子。
[0435]
为了评估car多肽或其部分的表达，待引入t细胞中的表达载体还可以含有可选择的标志物基因，例如cd34或报告基因，或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标志物可以被携带在单独的dna片段上并用于共转染程序。可选择的标志物和报告基因都可以伴有合适的调控序列，以使其在宿主细胞中表达。有用的可选择的标志物包括例如抗生素抗性基因，例如neo等。
[0436]
在本发明的一些实施方案中，可以使用自杀基因技术。本领域中描述了根据其作用机理而不同的自杀基因技术(jones等人frontiers in pharmacology，2014(5)：254)。将无毒药物转换为有毒药物的基因定向酶前药疗法(gdept)的示例包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)和胞嘧啶脱氨酶(cd)。其他示例是由与细胞凋亡组分如诱导型fas(ifas)或诱导型半胱天冬酶9(icasp9)系统连接的药物结合结构域组成的嵌合蛋白。其他示例包括由治疗性抗体介导的系统，例如诱导c-myc在工程化细胞表面的过表达，以通过施用抗c-myc抗体诱导其缺失。egfr的用途与c-myc系统相比被描述为模拟的系统。在一个实施方案中，使用的自杀基因技术是wo2013153391或wo2016120216(通过引用并入本文)中所描述的技术。wo2013153391描述了包含标志物部分(例如，cd34的最小表位)和自杀部分的多肽，其中该自杀部分包含基于来自cd20的表位的最小表位，使得表达所述多肽的细胞可以使用例如利妥昔单抗(rituximab)的溶解性抗体被选择性地杀灭。更特别地，所述肽可以具有式st-r1-s1-q-s2-r2，其中st是当多肽在靶细胞的表面表达时，导致r和q表位从细胞表面伸出的茎序列(stalk sequence)；r1和r2是利妥昔单抗结合表位；s1和s2是可以相同或不同的任选间隔序列；且q是qbend-10-结合表位。这种肽的一个示例是seq id no:76:cpysnpslcsggggselptqgtfsnvstnvspakptttacpysnpslcsgg ggspaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwapl agtcgvlllslvitlycnhrnrrrvckcprpw。wo2016120216描述了包含经修饰以允许细胞分选和细胞耗竭的细胞外结合结构域(scfv)的car，其中所述修饰由将一个或多个选定的表位插入scfv中组成，所述表位具有被一种或多种特异性抗体识别的特异
性。特别地，所述选定的表位可以是来自cd20的表位，使得表达所述car的细胞可以使用例如利妥昔单抗的溶解性抗体被选择性地杀灭。
[0437]
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞以及评估调节性序列的功能。通常，报告基因是在受体生物体或组织中不存在或不表达的基因，并编码通过一些易于检测的性质例如酶活性来表现其表达的多肽。在将dna引入受体细胞后的合适时间，测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如，ui-tei等人，2000febs letters 479:79-82)。合适的表达系统是公知的，并且可以使用已知技术制备或从商业上获得。通常，将具有最小5'侧翼区并显示最高的报告基因表达水平的构建体确定为启动子。这样的启动子区域可以与报告基因连接，并用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。
[0438]
将基因导入细胞并在细胞中表达的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域中的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，可以通过物理、化学或生物学手段将表达载体转移到宿主细胞中。
[0439]
用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域公知的。参见，例如，sambrook等人(2001,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法是磷酸钙转染。
[0440]
用于将目的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，且尤其是逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如us5,350,674和5,585,362。
[0441]
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠子和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人造膜囊泡)。
[0442]
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一个方面，核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可以被封装在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层中、经由与脂质体和寡核苷酸均结合的连接分子附着于脂质体上、被包裹在脂质体中、与脂质体复合、分散于含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮液被包含在脂质中、被包含在胶束中或与胶束复合、或与脂质结合。与脂质、脂质/dna或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构存在，作为胶束或具有“塌陷”(“collapsed”)结构。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均的聚集体。脂质是可以天然存在的脂肪物质(fatty substance)或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及包含长链脂肪族烃及其衍生物的一类化合物，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
[0443]
可以从商业来源获得适于使用的脂质。例如，二肉豆蔻磷脂酰胆碱(dimyristyl phosphatidylcholine，“dmpc”)可以从sigma，st.louis，mo获得；磷酸鲸蜡酯(dicetyl phosphate)(“dcp”)可以从k&k laboratories(plainview，ny)获得；胆固醇(“choi”)可以从calbiochem-behring获得；二肉豆蔻磷脂酰甘油(dimyristyl phophatidylglycerol，
“
dmpg”)和其他脂质可以从avanti polar lipids，inc.(birmingham，al)获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质储备溶液可储存在约-20℃下。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质载体的通用术语。脂质体的特征可以为具有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有被水性介质分隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历了自我重排，并且在脂质双层之间夹带了水和溶解的溶质(ghosh等人，1991glycobiology 5：505-10)。然而，也涵盖了在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以采取胶束结构或仅以脂质分子的不均匀聚集体存在。还涵盖了脂质转染胺(lipofectamine)-核酸复合物。
[0444]
不论用于将外源核酸引入宿主细胞的方法如何，为了确认宿主细胞中重组dna序列的存在，可以进行多种测定。这样的测定包括例如本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，例如southern和northern印迹、rt-pcr和pcr；“生化”测定，例如通过免疫学方法(elisa和western印迹)或通过本文所述的测定来检测特定肽的存在或不存在，以鉴定落入本发明范围内的试剂。
[0445]
在一个实施方案中，本发明的t细胞通过rna的引入而被修饰。在一个实施方案中，可以将体外转录的rna car以瞬时转染的形式引入细胞中。使用聚合酶链反应(pcr)生成的模板通过体外转录产生rna。可以使用合适的引物和rna聚合酶，通过pcr将任何来源的目的dna直接转化为模板，以用于体外mrna合成。dna的来源可以例如是基因组dna、质粒dna、噬菌体dna、cdna、合成dna序列或任何其他合适的dna来源。体外转录所需的模板是本发明的car。
[0446]
在一个实施方案中，用于pcr的dna含有一个开放阅读框。该dna可以来自天然存在的生物体基因组的dna序列。在一个实施方案中，dna是全长的目的基因或基因的一部分。该基因可以包括5'和/或3'非翻译区(utr)的一些或全部。该基因可以包括外显子和内含子。在一个实施方案中，用于pcr的dna是人基因。在另一个实施方案中，用于pcr的dna是包括5'和3'utr的人基因。或者，dna可以是通常不在自然存在的生物中表达的人工dna序列。示例性人工dna序列是含有连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框的基因部分的序列。连接在一起的dna部分可以来自单个生物或不止一个生物。
[0447]
使用pcr以产生用于转染的mrna的体外转录的模板。实施pcr的方法是本领域公知的。将用于pcr的引物设计为具有与要用作pcr模板的dna区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”指其中引物序列中的大部分或全部的碱基是互补的，或一个或多个碱基是非互补的或错配的核苷酸序列。基本上互补的序列能够在用于pcr的退火条件下与预期的dna靶标退火或杂交。可以将引物设计成与dna模板的任何部分基本上互补。例如，可以将引物设计为扩增在细胞中被正常转录的包括5'和3'utr的基因部分(开放阅读框)。也可以将引物设计成扩增编码特定目的结构域的基因的一部分。在一个实施方案中，将引物设计成扩增包括5'和3'utr的全部或部分人cdna的编码区。通过本领域公知的合成方法生成用于pcr的引物。
[0448]“正向引物”是含有与待扩增dna序列上游的dna模板上的核苷酸基本上互补的核苷酸区域的引物。本文中使用的“上游”指相对于编码链要扩增的dna序列的位置5'。“反向引物”是含有与待扩增dna序列下游的双链dna模板基本上互补的核苷酸区域的引物。本文
中使用的“下游”指相对于编码链要扩增的dna序列的位置3'。
[0449]
任何用于pcr的dna聚合酶均可用于本文公开的方法。试剂和聚合酶可从多种来源商购获得。
[0450]
还可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。rna优选具有5'和3'utr。在一个实施方案中，5'utr的长度为0至3000个核苷酸。可以通过不同的方法改变要添加至编码区的5'和3'utr序列的长度，包括但不限于设计退火至utr的不同区域的pcr引物。通过使用这种方法，本领域普通技术人员可以在转录的rna转染后修饰达到最佳翻译效率所需的5'和3'utr长度。5'和3'utr可以是目的基因的天然存在的内源性5'和3'utr。或者，可以通过将utr序列引入正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰来添加对目的基因而言非内源的utr序列。对目的基因而言非内源的utr序列的使用可用于修饰rna的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'utr序列中富含au的元件能降低mrna的稳定性。因此，可以基于本领域公知的utr性质来选择或设计3'utr，以增加转录rna的稳定性。
[0451]
在一个实施方案中，5'utr可以包含内源基因的kozak序列。或者，当如上所述通过pcr添加对目的基因而言非内源的5'utr时，可以通过添加5'utr序列来重新设计共有kozak序列。kozak序列可以提高一些rna转录物的翻译效率，但似乎并非是所有rna进行有效翻译所需的。许多mrna对kozak序列的需求是本领域已知的。在其他实施方案中，5'utr可以源自其rna基因组在细胞中稳定的rna病毒。在其他实施方案中，各种核苷酸模拟物可以用于3'或5'utr中，以阻止mrna的核酸外切酶降解。
[0452]
为了能够无需dna克隆即可从dna模板中合成rna，应将转录启动子连接到待转录序列上游的dna模板上。当充当rna聚合酶启动子的序列被添加到正向引物的5'末端时，rna聚合酶启动子被整合到待转录的开放阅读框上游的pcr产物中。在一个优选的实施方案中，启动子是t7聚合酶启动子，如本文别处所述。其他有用的启动子包括但不限于t3和sp6 rna聚合酶启动子。t7、t3和sp6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
[0453]
在一个实施方案中，mrna在5'末端和3'poly(a)尾处均具有决定细胞中的核糖体结合、翻译起始和mrna稳定性的帽。在环状dna模板(例如质粒dna)上，rna聚合酶产生不适合在真核细胞中表达的长连环产物。在3'utr末端线性化的质粒dna的转录产生正常大小的mrna，其即使在转录后被聚腺苷酸化，也不在真核转染中起作用。
[0454]
在线性dna模板上，噬菌体t7 rna聚合酶可以将转录物的3'末端延伸至模板的最后一个碱基之外(schenborn和mierendorf，nuc acids res.，13:6223-36(1985)；nacheva和berzal-herranz，eur.j.biochem.，270：1485-65(2003)。
[0455]
将polya/t片段整合到dna模板中的传统方法是分子克隆。然而，整合到质粒dna中的polya/t序列能导致质粒不稳定，这就是从细菌细胞获得的质粒dna模板经常被缺失和其他畸变高度污染的原因。这使得克隆程序不仅费时费力，而且常常不可靠。这就是迫切需要一种无需克隆即可允许构建具有polya/t 3'延伸的dna模板的方法的原因。
[0456]
转录dna模板的polya/t片段可以在pcr期间通过使用含有例如100t尾的polyt尾(大小可以是50-5000t)的反向引物来产生，或在pcr后通过任何其他方法，包括但不限于dna连接或体外重组。poly(a)尾还为rna提供稳定性并减少其降解。通常，poly(a)尾的长度与转录的rna的稳定性呈正相关。在一个实施方案中，poly(a)尾为100至5000个腺苷。
[0457]
在体外转录后，可以使用poly(a)聚合酶例如大肠杆菌polya聚合酶(e-pap)进一
步延长rna的poly(a)尾。在一个实施方案中，poly(a)尾的长度从100个核苷酸增加到300至400个核苷酸之间会导致rna的翻译效率提高约两倍。另外，将不同的化学基团附着到3'末端能增加mrna的稳定性。这样的附着可以包含修饰的/人工的核苷酸、适体和其他化合物。例如，可以使用poly(a)聚合酶将atp模拟物引入poly(a)尾中。atp类似物可以进一步提高rna的稳定性。
[0458]
rna的5'帽也给rna分子提供了稳定性。在一个优选的实施方案中，通过本文公开的方法产生的rna包括5'帽。使用本领域已知的和本文描述的技术提供5'帽(cougot等人,trends in biochem.sci.,29:436-444(2001)；stepinski等人,rna,7:1468-95(2001)；elango等人,biochim.biophys.res.commun.,330:958-966(2005))。
[0459]
通过本文公开的方法产生的rna还可以包含内部核糖体进入位点(ires)序列。ires序列可以是任何病毒的、染色体的或人工设计的序列，其启动不依赖帽的核糖体与mrna的结合并促进翻译的启动。可以包含任何适合于细胞电穿孔的溶质，其可以含有促进细胞渗透性和活力的因子，例如糖、肽、脂质、蛋白、抗氧化剂和表面活性剂。
[0460]
可以使用多种不同方法中的任何一种将rna引入靶细胞，例如，可商购获得的方法，起包括但不限于电穿孔(amaxa nucleofector-ii(amaxa biosystems，cologne，德国))、(ecm 830(btx)(harvard instruments，boston，mass.)或gene pulser ii(biorad，denver，colo.)、multiporator(eppendort，hamburg德国)、使用脂转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物封装(polymer encapsulation)、肽介导的转染或例如“基因枪”的生物弹道颗粒递送系统(参见，例如nishikawa等人,hum gene ther.,12(8):861-70(2001)。
[0461]
在一个实施方案中，使用逆转录病毒或慢病毒载体将car序列递送到细胞中。可以使用转导的细胞作为载体或使用封装的、结合的或裸露的载体的无细胞局部或全身递送，将表达car的逆转录病毒和慢病毒载体递送到不同类型的真核细胞以及组织和整个生物体内。所使用的方法可以用于需要或足够进行稳定表达的任何目的。
[0462]
在另一个实施方案中，使用体外转录的mrna将car序列递送到细胞中。可以使用转染的细胞作为载体或使用封装的、结合的或裸露的mrna的无细胞局部或全身递送，将体外转录的mrna car递送到不同类型的真核细胞以及组织和整个生物体内。所使用的方法可以用于需要或足够进行瞬时表达的任何目的。
[0463]
在另一个实施方案中，可以通过转座子的方式在细胞中表达所需car。
[0464]
在扩增和遗传修饰本发明的treg细胞前，从受试者获得t细胞的来源。t细胞可以获得自多种来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域可获得的任何数量的t细胞系。在本发明的某些实施方案中，可以通过使用本领域技术人员已知的许多技术，例如ficoll
tm
分离，从自受试者收集的血单位(unit of blood)中获得t细胞。在一个实施方案中，通过单采术(apheresis)获得来自个体循环血液的细胞。单采术产品通常含有淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，通过白细胞单采术(leukapheresis)获得来自个体循环血液的细胞。
[0465]
在一个实施方案中，可以洗涤通过白细胞单采术收集的细胞以移除血浆部分，并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于随后的处理步骤。在本发明的一个实施方案中，
用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞。在一个替代的实施方案中，洗涤溶液缺少钙，并且可缺少镁，或者可缺少许多(如果不是全部的话)二价阳离子。洗涤后，可将细胞重悬于多种生物相容的缓冲液中，例如，不含ca
2+
、不含mg
2+
的pbs，plyamalyte a或具有或不具有缓冲剂的其他盐水溶液。或者，可以移除白细胞单采术样品的不希望的成分，并将细胞直接重悬于培养基中。
[0466]
在另一个实施方案中，通过裂解红细胞并去除单核细胞(例如通过percoll
tm
梯度离心或通过逆流离心淘洗(counterflow centrifugal elutriation))从外周血淋巴细胞中分离t细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离t细胞的特定亚群。例如，在一个实施方案中，通过与抗cd3/抗cd28(即3x28)-偶联的珠子(如m-450cd3/cd28 t)一起温育足以进行目标t细胞的阳性选择的时间段，来分离t细胞。在一个实施方案中，时间段是约30分钟。在另一个实施方案中，时间段的范围是30分钟到36小时或更长，和其间的所有整数值。在另一个实施方案中，时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在另一个优选的实施方案中，时间段是10至24小时。在一个优选的实施方案中，温育时间段是24小时。在t细胞与其他细胞类型相比很少的任何情况下，可以使用更长的温育时间来分离t细胞。因此，通过简单地缩短或延长时间来允许t细胞结合cd3/cd28珠子，和/或通过增加或降低珠子与t细胞的比例(如本文进一步所述)，可以在培养启动时或该过程中其他时间点优先选择或反向选择t细胞的亚群。此外，通过增加或降低珠子或其他表面上抗cd3和/或抗cd28抗体的比例，可以在培养启动时或其他目的时间点优先选择或反向选择t细胞的亚群。技术人员将认识到，在本发明的上下文中也可以使用多轮选择。
[0467]
在另一个实施方案中，可能期望在激活和扩增过程中进行选择程序和使用“未选择”的细胞。也可以将“未选择”的细胞进行进一步轮的选择。可以用针对阴性选择细胞特有的表面标志物的抗体组合来通过阴性选择富集t细胞群。一种方法是经由阴性磁性免疫粘附或流式细胞术的细胞分选和/或选择，其使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择富集cd4
+
细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。在某些实施方案中，通过抗cd25-偶联的珠子或其他类似的选择方法来去除t调节性细胞。
[0468]
为了通过阳性或阴性选择分离目的细胞群，可以改变细胞的浓度和表面(例如颗粒如珠子)。在某些实施方案中，可能期望显著减小珠子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠子的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量、细胞激活和细胞扩增增加。此外，使用高细胞浓度可以更有效地捕获可能弱表达目标靶抗原的细胞，例如cd28阴性t细胞，或从存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病血液、肿瘤组织等)中。这样的细胞群可具有治疗价值并且将是期望获得的。
[0469]
用于刺激的t细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过移除细胞群中的粒细胞和一定程度上的单核细胞而提供了更均一的产物。在
移除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮于冷冻溶液中。许多冷冻溶液和参数是本领域已知的且在此情况下将是有用的，一种方法涉及使用含有20％dmso和8％人血清白蛋白的pbs，或含有10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％dmso，或31.25％plasmalyte-a、31.25％右旋糖5％、0.45％nacl、10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％dmso的培养基，或其他合适的含有例如hespan和plasmalyte a的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1
°
的速度冷冻至-80℃，并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他受控冷冻的方法，以及立即在-20℃或在液氮中进行非受控冷冻。
[0470]
在某些实施方案中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，并在激活前使其在室温下静置一小时。
[0471]
在本发明的上下文中还考虑了在可能需要如本文所述的扩增的细胞之前的时间段，从受试者收集血液样品或白细胞单采术产物。这样，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并将目的细胞(例如t细胞)分离并冷冻，以用于以后对例如本文所述的受益于t细胞疗法的那些多种疾病或病况的t细胞疗法中。在一个实施方案中，血液样品或白细胞单采术取自整体健康的受试者。在某些实施方案中，血液样品或白细胞单采术取自具有发展疾病风险但尚未发展疾病的整体健康的受试者，并且将目的细胞分离和冷冻以供以后使用。在某些实施方案中，可以将t细胞扩增、冷冻并在之后使用。
[0472]
无论是在对treg细胞进行基因修饰以表达目的car之前还是之后，通常可以使用例如以下中所述的方法来激活和扩增t细胞：us6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和us20060121005，其通过引用并入本文。
[0473]
通常，本发明的treg细胞通过与附着有刺激cd3/tcr复合物相关信号的试剂和刺激treg细胞的细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。特别地，可以如本文所述地刺激treg细胞，例如通过与抗cd3抗体或其抗原结合片段，或固定在表面上的抗cd2抗体接触，或与偶联有钙离子载体的蛋白激酶c激活剂(例如苔藓抑素)接触。为了共刺激t细胞表面上的辅助分子，使用与辅助分子结合的配体。例如，可以在适于刺激t细胞增殖的条件下使t细胞群与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。为了刺激任一cd4
+
t细胞的增殖，可以使用抗cd3抗体和抗cd28抗体。抗cd28抗体的示例包括但不限于9.3、b-t3、xr-cd28(diaclone，besancon，法国)。可以使用本领域公知的其他扩增方法(berg等人,transplant proc.30(8):3975-3977,1998；haanen等人,j.exp.med.190(9):13191328,1999；garland等人,j.immunol meth.227(1-2):53-63,1999)。
[0474]
在某些实施方案中，可以通过不同的规程提供本发明的treg细胞的第一刺激信号和共刺激信号。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中或被偶联至表面。当被偶联至表面时，试剂可以被偶联至同一表面(即，以“顺式”形式)或被偶联至分开的表面(即，以“反式”形式)。或者，一种试剂可以被偶联至表面且另一种试剂在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，并且提供第一激活信号的试剂在溶液中或被偶联至表面。在某些实施方案中，两种试剂都可以在溶液中。在另一个实施方案中，试剂可以是可溶形式，然后交联至表面，例如表达fc受体的细胞或将结合该试剂的抗体或其他结合剂。就此而言，考虑用于激活和扩增本发明中的t细胞的人工抗原呈递细胞(aapc)可参见例如
us20040101519和20060034810，其通过引入并入本文。
[0475]
在一个实施方案中，将该两种试剂固定在珠子上，要么在同一珠子上，即“顺式”，或者在分开的珠子上，即“反式”。例如，提供第一激活信号的试剂是抗cd3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的试剂是抗cd28抗体或其抗原结合片段；并将两种试剂以等价的分子数量共固定在同一珠子上。在一个实施方案中，针对cd4
+
t细胞扩增和t细胞生长，使用与珠子结合的1:1比例的每种抗体。在本发明的某些方面，使用与珠子结合的抗cd3:cd28抗体的比例，使得观察到与使用1:1的比例观察到的扩增相比，t细胞扩增的增加。在一个具体实施方案中，与使用1:1的比例观察到的扩增相比，观察到约1至约3倍的增加。在一个实施方案中，与珠子结合的cd3:cd28抗体的比例范围在100:1至1:100，以及其之间的所有整数值。在本发明的一个方面，与抗cd3抗体相比，与颗粒结合的抗cd28抗体更多，即cd3:cd28的比例小于1。在本发明的某些实施方案中，与珠子结合的抗cd28抗体对抗cd3抗体的比例大于2:1。在一个具体实施方案中，使用与珠子结合的1:100的cd3:cd28抗体比例。在另一个实施方案中，使用与珠子结合的1:75的cd3:cd28抗体比例。在进一步的实施方案中，使用与珠子结合的1:50的cd3:cd28抗体比例。在另一个实施方案中，使用与珠子结合的1:30的cd3:cd28抗体比例。在一个优选的实施方案中，使用与珠子结合的1:10的cd3:cd28抗体比例。在另一个实施方案中，使用与珠子结合的1:3的cd3:cd28抗体比例。在另一个实施方案中，使用与珠子结合的3:1的cd3:cd28抗体比例。
[0476]
可以使用1:500至500:1以及之间的任何整数值的颗粒对细胞的比例，以刺激t细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易理解地，颗粒对细胞的比例可取决于相对于靶细胞的粒径。例如，小尺寸的珠子只能结合少量细胞，而更大的珠子可以结合许多细胞。在某些实施方案中，还可以使用1:100至100:1以及介于之间的任何整数值的细胞对颗粒的比例，且在进一步的实施方案中，使用1:9至9:1以及介于之间的任何整数值的比例，以刺激t细胞。如上所述，引起t细胞刺激的抗cd3-和抗cd28-偶联颗粒对t细胞的比例可以变化，然而某些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个优选的比例是每个t细胞至少有1:1的颗粒。在一个实施方案中，使用1:1或更小的颗粒对细胞的比例。在一个具体实施方案中，优选的颗粒:细胞比例是1:5。在进一步的实施方案中，颗粒对细胞的比例可以根据刺激的日期而变化。例如，在一个实施方案中，第一天的颗粒对细胞的比例是1:1至10:1，并且在之后的直至10天，每天或每隔一天将额外的颗粒添加到细胞中，最终比例为1:1至1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一个具体实施方案中，在刺激的第一天颗粒对细胞的比例是1:1，并且在刺激的第三和第五天将其调整为1:5。在另一个实施方案中，以每天或每隔一天的基础添加颗粒，至第一天的1:1的最终比例，和刺激的第三和第五天的1:5。在另一个实施方案中，在刺激的第一天颗粒对细胞的比例是2:1，并且在刺激的第三和第五天将其调整为1:10。在另一个实施方案中，以每天或每隔一天的基础添加颗粒，至第一天的1:1的最终比例，和刺激的第三和第五天的1:10。本领域技术人员将理解，各种其他的比例也可以适用于本发明。特别地，比例将取决于颗粒大小以及细胞大小和类型而变化。
[0477]
在本发明的进一步的实施方案中，将treg细胞与包被有试剂的珠子混合，随后使珠子和细胞分离，并且然后培养细胞。在一个替代的实施方案中，在培养之前，不分离包被有试剂的珠子和细胞而是一起培养。在进一步的实施方案中，首先通过施加力例如磁力来
浓缩珠子和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
[0478]
举例来说，可以通过使附着有抗cd3和抗cd28的顺磁珠(3x28珠)接触本发明的treg细胞来连接细胞表面蛋白。在一个实施方案中，将细胞(例如104至109个t细胞)和珠子(例如1：1比例的m-450cd3/cd28 t顺磁性珠子)在缓冲液中混合，优选pbs(不含例如钙和镁的二价阳离子)。同样，本领域普通技术人员能够容易地理解，可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可以非常稀少且仅占样品的0.01％，或整个样品(即100％)可以包含目的靶细胞。因此，任何细胞数都在本发明的范围内。在某些实施方案中，可能期望显著减少颗粒和细胞在其中混合在一起的体积(即增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度能导致细胞产量、细胞激活和细胞扩增的增加。此外，使用高细胞浓度可以更有效地捕获可能弱表达目标靶抗原的细胞，例如cd28阴性t细胞。在某些实施方案中，这样的细胞群可具有治疗价值并且将是期望获得的。
[0479]
在本发明的一个实施方案中，可将混合物培养数小时(约3小时)至约14天或介于之间的任何整小时数。在另一个实施方案中，可以将混合物培养21天。在本发明的一个实施方案中，将珠子和t细胞一起培养约8天。在另一个实施方案中，将珠子和t细胞一起培养2-3天。可能还需要几个刺激周期，使得t细胞的培养时间可以是60天或更长。适用于t细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，最低基础培养基(minimal essential media)或rpmi培养基1640或x-vivo 15，(lonza))，其可以包含增殖和活力所需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白介素-2(il-2)、胰岛素、ifn-γ、il-4、il-7、gm-csf、il-10、il-12、il-15、tgfβ和tnf-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂，例如n-乙酰基半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括rpmi 1640、aim-v、dmem、mem、a-mem、f-12、x-vivo 15和x-vivo 20，optimizer，其添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清或补充了适量血清(或血浆)或一组指定激素，和/或对t细胞的生长和扩增足够量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不包括在要被输注到受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如合适的温度(例如37℃)和大气(例如空气加5％co2)。
[0480]
暴露于不同刺激时间的t细胞可表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采的(apheresed)外周血单核细胞产物具有的辅助t细胞群(th，cd4
+
)多于细胞毒性或抑制性t细胞群(tc，cd8
+
)。通过刺激cd3和cd28受体进行t细胞的离体扩增产生在约8-9天之前主要由th细胞组成的t细胞群，而在约8-9天后t细胞群包含越来越多的tc细胞群。因此，取决于治疗目的，向受试者输注主要包含th细胞的t细胞群可以是有利的。类似地，如果已经分离了tc细胞的抗原特异性亚组，则将该亚组扩展至更大程度可以是有益的。此外，除了cd4和cd8标志物外，其他表型标志物也有显著变化，但大部分在细胞扩增过程中可重现。因此，这种可重现性使能够为了特定目的定制激活的t细胞产物。
[0481]
在本发明的一个实施方案中，可在雷帕霉素(rapamycin)的存在下培养t细胞以获得调节性t细胞，如例如在wo2007110785中所描述的，其通过引用并入本文。另一种产生调节性t细胞的方法描述于us2016024470中，其通过引用并入本文，其中将t细胞与t细胞受体(tcr)/cd3激活剂如tcr/cd3抗体、tcr共刺激剂激活剂(例如cd28、cd137(4-1bb)、gitr、b7-1/2、cd5、icos、ox40、cd40或cd137抗体)和雷帕霉素一起培养。
[0482]
在本发明的一个实施方案中，通过表达car而被遗传修饰的t细胞也可以通过表达至少一种细胞内因子如ror-c、foxp3、foxo1、t-bet或gata 3、c-maf、ahr而被遗传修饰。在一个实施方案中，本发明的遗传修饰的免疫细胞表达foxp3。在一个实施方案中，本发明的遗传修饰的免疫细胞表达foxo1。
[0483]
在一个实施方案中，本发明的遗传修饰的treg细胞可以是同种异体treg细胞。例如，同种异体treg细胞可以是缺乏功能性人白细胞抗原(hla)(例如，i类hla和/或ii类hla)表达的t细胞，和/或缺乏内源性hla表达的t细胞。
[0484]
在一个实施方案中，可以对本文所述的treg细胞进行工程化，使得它们在其表面上不表达功能性hla。例如，可以对本文所述的treg细胞进行工程化，使得hla，例如1类hla(尤其是hla-a、hla-b或hla-c)和/或ii类hla或非经典hla分子的细胞表面表达被下调。
[0485]
在另一个实施方案中，treg细胞可以缺乏功能性tcr和功能性hla，例如i类hla(尤其是hla-a、hla-b或hla-c)和/或ii类hla。
[0486]
在另一个实施方案中，可以对本文所述的treg细胞进行工程化，使得其在其表面上不表达内源性hla。
[0487]
缺乏功能性tcr和/或hla表达的修饰的treg细胞可以通过任何合适的手段获得，包括敲除或敲低tcr或hla的一个或多个亚基。例如，treg细胞可以包括tcr和/或hla的敲低，其使用sirna、shrna、成簇的规则间隔的短回文重复(crispr)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、锌指核酸内切酶(zfn)、大范围核酸酶(mn，也称为归巢核酸内切酶)或megatal(tal效应子与mn切割结构域结合)。
[0488]
在一个实施方案中，将编码如本文所述的car的核酸插入treg基因组中的特定基因座，例如，在要删除的基因的基因座处。在一个实施方案中，将编码如本文所述的car的核酸插入hla基因座内，从而导致hla表达的抑制。
[0489]
在一个实施方案中，可使用靶向t细胞中编码tcr和/或hla的核酸的sirna或shrna来抑制tcr表达和/或hla表达。sirna和shrna在t细胞中的表达可以使用任何常规表达系统，例如慢病毒表达系统来实现。下调tcr组分的表达的示例性shrna描述于例如us2012/0321667中。下调i类hla和/或ii类hla基因的表达的示例性sirna和shrna描述于例如us2007/0036773中。
[0490]
如本文所用，“crispr”或“针对tcr和/或hla的crispr”或“抑制tcr和/或hla的crispr”指一组成簇的规则间隔的短回文重复序列，或包含这组重复序列的系统。如本文所用，“cas”指crispr相关蛋白。“crispr/cas”系统指可用于沉默或突变tcr和/或hla基因的源自crispr和cas的系统。
[0491]
在大约40％经测序的真细菌基因组和90％经测序的古细菌中发现了天然存在的crispr/cas系统。grissa等人(2007)bmc bioinformatics 8:172。此系统是原核免疫系统的一种，其赋予了对诸如质粒和噬菌体的外源遗传成分的抗性，并提供了获得性免疫的形
式。barrangou等人(2007)science 315:1709-1712；marragini等人(2008)science 322:1843-1845。crispr/cas系统已经过改良以用于真核生物如小鼠或灵长类动物中的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)。wiedenheft等人(2012)nature 482：331-8。这是通过将含有特定设计的crispr和一个或多个合适的cas的质粒引入真核细胞来实现的。crispr序列，有时称为crispr基因座，包含交替的重复序列和间隔区。在天然存在的crispr中，间隔区通常包含与细菌异源的序列，例如质粒或噬菌体序列；在tcr和/或hla crispr/cas系统中，间隔区衍生自tcr或hla基因序列。来自crispr基因座的rna是组成性表达的，并被cas蛋白加工成小rna。这些包含侧接重复序列的间隔区。rna指导其他cas蛋白以在rna或dna水平上沉默外源遗传元件。horvath等人(2010)science 327:167-170；makarova等人(2006)biology direct 1:7。因此，间隔区充当rna分子的模板，类似于sirna。pennisi(2013)science 341:833-836。因此，crispr/cas系统可用于编辑tcr和/或hla基因(添加或删除碱基对)，或引入过早的终止，其从而降低tcr和/或hla的表达。或者，可以像rna干扰那样使用crispr/cas系统，以可逆方式关闭hla基因。例如，在哺乳动物细胞中，rna可以将cas蛋白引导至tcr和/或hla启动子，在空间上阻止rna聚合酶。
[0492]
可以使用本领域已知的技术，例如在us20140068797和cong(2013)science 339:819-823中描述的技术，来产生抑制tcr和/或hla的人工crispr/cas系统。还可以产生抑制tcr和/或hla的本领域已知的其他人工crispr/cas系统，例如，描述于tsai(2014)nature biotechnol.,32:6 569-576，us8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945；和8,697,359中的。
[0493]“talen”或“针对tcr和/或hla的talen”或“抑制tcr和/或hla的talen”指转录激活因子样效应物核酸酶，一种可用于编辑tcr和/或hla基因的人工核酸酶。通过将tal效应子dna结合结构域与dna切割结构域融合来人工产生talen。转录激活因子样效应物(tale)可以经工程化以结合任何目标dna序列，包括tcr和/或hla基因的一部分。通过将工程化的tale与dna切割结构域结合，可以产生对任何目标dna序列(包括tcr和/或hla序列)均具有特异性的限制酶。然后可以将这些引入细胞中，其中它们可以用于基因组编辑。boch(2011)nature biotech.29:135-6；和boch等人(2009)science 326:1509-12；moscou等人(2009)science326:3501。
[0494]
tale是由黄单胞菌细菌分泌的蛋白。dna结合结构域含有一个重复的高度保守的33-34个氨基酸的序列，第12个和13个氨基酸不算在内。这两个位置是高度可变的，显示出与特定核苷酸识别的强相关性。因此，它们可以经工程化以结合目标dna序列。为了产生talen，将tale蛋白与核酸酶(n)融合，该核酸酶是野生型或突变的fok1核酸内切酶。已经产生fokl的几个突变用于talen中；例如，这些改善了切割特异性或活性。cermak等人(2011)nucl.acids res.39:e82；miller等人(2011)nature biotech.29:143-8；hockemeyer等人(2011)nature biotech.29:731-734；wood等人(2011)science 333:307；doyon等人(2010)nature methods 8:74-79；szczepek等人(2007)nature biotech.25:786-793；和guo等人(2010)/.mol.biol.200:96。fokl结构域充当二聚体，需要针对靶基因组中位点的具有合适的方向和间距的独特dna结合结构域的两个构建体。tale dna结合结构域和fok1切割结构域之间的氨基酸残基数目以及两个单独的talen结合位点之间的碱基数目似乎都是实现高水平活性的重要参数。miller等人(2011)nature biotech.29:143-8。hla talen可在细胞
内使用以产生双链断裂(dsb)。如果修复机制经由非同源末端连接不恰当地修复了断裂，则可以在断裂位点处引入突变。例如，不恰当的修复可导致移码突变。或者，可以将外源dna与talen一起引入细胞中；取决于外源dna的序列和染色体序列，该过程可用于校正tcr和/或hla基因中的缺陷或将这种缺陷引入wt tcr和/或hla基因中，从而降低hla的表达。可以使用本领域已知的任何方法来构建对tcr和/或hla中的序列特异的talen，包括使用模块化组件的各种方案。zhang等人(2011)nature biotech.29:149-53；geibler等人(2011)plos one 6:el9509。
[0495]“zfn”或“锌指核酸酶”或“针对tcr和/或hla的zfn”或“抑制tcr和/或hla的zfn”指锌指核酸酶，一种可用于编辑tcr和/或hla基因的人工核酸酶。像talen一样，zfn包含与dna结合结构域融合的fok1核酸酶结构域(或其衍生物)。就zfn来说，dna结合结构域包含一个或多个锌指。carroll等人(2011)genetics society of america 188:773-782；和kim等人(1996)proc.natl.acad.sci.usa 93:1156-1160。锌指是通过一个或多个锌离子稳定的小蛋白结构基序。锌指可以包含例如cys2his2(seq id no:75)，并且可以识别大约3bp的序列。可以将各种特异性已知的锌指组合以产生识别约6、9、12、15或18-bp序列的多指多肽。各种选择和模块化组装技术可用于产生识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交系统和双杂交系统以及哺乳动物细胞。
[0496]
像talen一样，zfn必须二聚化以切割dna。因此，需要一对zfn来靶向非回文dna位点。两个单独的zfn必须在其核酸酶合适间隔下结合dna的相反链。bitinaite等人(1998)proc.natl.acad.sci.usa 95:10570-5。还像talen一样，zfn可以创建dna中的双链断裂，如果修复不当，其能创建移码突变，导致细胞中tcr和/或hla的表达和数量减少。zfn也可以与同源重组一起使用，以在tcr和/或hla基因中产生突变。可以使用任何本领域的已知方法来构建对tcr和/或hla中的序列特异的zfn。参见例如provasi(2011)nature med.18:807-815；torikai(2013)blood 122:1341-1349；cathomen等人(2008)mol.ther.16:1200-7；quo等人(2010)/.mol.biol.400:96；us2011/0158957；和us2012/0060230。
[0497]“大范围核酸酶(meganuclease)”或“针对tcr和/或hla的大范围核酸酶”或“抑制tcr和/或hla的大范围核酸酶”指具有大(>14个碱基对)识别位点的单体核酸内切酶，其可用于编辑tcr和//或hla基因。大范围核酸酶(mn)是具有先天核酸酶活性的单体蛋白，其衍生自细菌归巢核酸内切酶，并经过工程化以用于独特的靶位点。归巢核酸内切酶是dna切割酶，能在其宿主基因组的各个基因座处产生双链断裂，并从而驱动位点特异性基因转化事件。(stoddard，structure.2011年1月12日；19(1):7-15)。尽管它们尺寸小，但归巢核酸内切酶仍能识别长的dna序列(通常20至30个碱基对)。归巢核酸内切酶极为普遍，并发现于微生物以及噬菌体和病毒中。laglidadg和his-cys框酶(his-cys box enzyme)(其对这些酶具有最高的序列特异性)依赖于反平行的β-折叠，该折叠靠入(dock into)其dna靶位点的大沟(flick等人,1998；jurica等人,1998)。在那里，它们建立了序列特异性和非特异性接触的集合，这些接触非均匀地分布在多个连续碱基对之间(chevalier等人，2003；scalley-kim等人，2007)。
[0498]
laglidadg归巢核酸内切酶(lhe)家族是用于基因靶向应用的工程化酶的主要来源。lhe家族主要在古细菌内以及藻类和真菌的叶绿体和线粒体基因组中编码(chevalier等人，2005；dalgaard等人，1997；sethuraman等，2009)。每条蛋白链均具有单个保守
laglidadg基序(seq id no:58)的大范围核酸酶形成了切割回文和近回文dna靶序列的同二聚体蛋白，而每条蛋白链中含有两个这样的基序的那些则形成能靶向完全不对称的dna序列的较大的伪对称单体。
[0499]
可以将大范围核酸酶工程化以靶向tcr和/或hla，从而在dna中创建双链断裂，如果修复不当，其能创建移码突变，导致细胞中tcr和/或hla的表达和数量减少。
[0500]“megatal”或“针对tcr和/或hla的megatal”或“抑制tcr和/或hla的megatal”指人工核酸酶，其可用于编辑tcr和/或hla基因。megatal是通过最小的tal(转录激活因子样)效应子域与衍生自laglidadg归巢核酸内切酶家族的大范围核酸酶的n-末端融合而获得的杂交单体核酸酶(nucleic acids res.2014年2月；42(4):2591-601；takeuchi等人,methods mol biol.2015；1239:105-32.doi：10.1007/978-1-4939-1862-1_6)。因此，megatal由位点特异的大范围核酸酶切割头组成，具有由tal效应子dna结合结构域提供的额外的亲和力和特异性。
[0501]
可以对megatal进行工程化以靶向tcr和/或hla，并因此在dna中创建双链断裂，如果修复不当，其能创建移码突变，导致细胞中tcr和/或hla的表达和数量减少。
[0502]
尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但在一些实施方案中，归因于t细胞中缩短的端粒，治疗性t细胞在患者中具有短期的持久性；因此，用端粒酶基因转染可以延长t细胞的端粒并改善患者体内t细胞的持久性。参见carl june，“adoptive t cell therapy for cancer in the clinic”,journal of clinical investigation,117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施方案中，遗传修饰的treg细胞异位表达端粒酶亚基，例如端粒酶的催化亚基，例如tert，例如htert。在一些方面，本公开提供了一种生产表达cr的细胞的方法，其包括使细胞与编码端粒酶亚基(例如端粒酶的催化亚基，例如tert，例如htert)的核酸接触。细胞可以在与编码cr的构建体接触之前、同时或之后与核酸接触。
[0503]
本发明进一步涉及用于获得本发明的treg细胞的方法，其中所述方法包括用编码如上所述的car的核酸转导至少一个treg细胞，并任选地扩增转导的细胞。
[0504]
在一个实施方案中，该方法是离体方法。
[0505]
在一个实施方案中，用于获得本发明的treg细胞的方法包括：
[0506]-将treg细胞从pbmc群中分离的步骤(例如，通过白细胞单采术回收)
[0507]-遗传修饰步骤，其中将编码如上所述的car的核酸序列引入或转移至treg细胞内，
[0508]-任选地，扩增步骤，
[0509]-任选地，洗涤步骤，和，
[0510]-任选地，冷冻步骤。
[0511]
在一个实施方案中，遗传修饰步骤对应于基因破坏步骤、基因校正步骤或基因添加步骤，优选基因添加步骤。在一个实施方案中，通过选自包括但不限于转染、转导或基因编辑的组的方法进行遗传修饰步骤。
[0512]
可以在本发明中使用的基因编辑方法的示例包括但不限于基于工程化核酸酶的方法、基于重组腺相关病毒(或aav)的方法、基于转座子(例如睡美人(sleeping beauty)转座子系统)的方法、基于同源重组的方法、使用位点特异性重组酶(例如cre-loxp和flp-frt系统)的条件靶向以及多重自动化基因组工程(mage)。
[0513]
工程化核酸酶的非限制性示例包括但不限于成簇的规则间隔的短回文重复序列(crispr)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、锌指核酸内切酶(zfn)、大范围核酸酶(mn，也称为归巢核酸内切酶)或megatal(tal效应子与mn切割结构域结合)。
[0514]
在一个实施方案中，用于获得本发明的treg细胞的方法包括：
[0515]-将treg细胞从pbmc群中分离的步骤(例如，通过白细胞单采术回收)
[0516]-使用包含编码如上所述的car的核酸序列的载体进行的转导或转染步骤，
[0517]-任选地，扩增步骤，
[0518]-任选地，洗涤步骤，和，
[0519]-任选地，冷冻步骤。
[0520]
本发明的另一个目的是包含至少一个本发明的treg细胞群或由其组成或基本上由其组成的组合物。
[0521]
在一个实施方案中，所述组合物包含至少一种经工程化以在细胞表面上表达如上所述的对至少一种il-23r特异的car或由其组成或基本上由其组成，其中所述car包含(i)如上所述的对il-23r特异的细胞外结合结构域，(ii)任选地，如上所述的细胞外铰链结构域，(iii)任选地，如上所述的跨膜结构域，(iv)如上所述的细胞内信号传导结构域，和(v)任选地，如上所述的标签和/或前导序列。
[0522]
在一个实施方案中，所述组合物已经被冷冻并解冻。
[0523]
本发明的另一个目的是包含至少一个如上所述的treg细胞群和至少一种药学上可接受的赋形剂或由其组成或基本上由其组成的药物组合物。
[0524]
本发明的另一个目的是包含至少一个如上所述的treg细胞群或由其组成或基本上由其组成的药物。
[0525]
在一个实施方案中，药物组合物或药物包含至少一个本发明的分离的和/或基本上纯化的treg细胞群。
[0526]
在一个实施方案中，药物组合物或药物包含如上所述的treg细胞群的组合(即，至少两个不同的本发明的treg细胞群)。
[0527]
在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物进一步包含至少一个其他treg细胞群，其中所述其他treg细胞群的细胞在细胞表面上表达对抗原、抗原片段、抗原变体或其混合物特异的car。
[0528]
在一个实施方案中，所述其他treg细胞群的细胞在细胞表面表达对来自普通人类饮食的食物抗原特异的car。
[0529]
在另一个实施方案中，所述其他treg细胞群的细胞在细胞表面表达对自身抗原特异的car，自身抗原例如多发性硬化相关抗原、关节相关抗原、眼相关抗原、人hsp抗原、皮肤相关抗原或参与移植排斥或gvhd的抗原。
[0530]
在另一个实施方案中，所述其他treg细胞群的细胞在细胞表面表达对吸入性过敏原、摄入性过敏原或接触性过敏原特异的car。
[0531]
在一个实施方案中，所述其他treg细胞群的细胞在细胞表面表达对选自包含卵白蛋白、mog、ii型胶原蛋白片段，其变体和混合物的组的抗原特异的car。
[0532]
在一个实施方案中，所述其他treg细胞群的细胞在细胞表面表达对卵白蛋白，其片段、变体和混合物特异的car。
[0533]
在另一个实施方案中，所述其他treg细胞群的细胞在细胞表面表达对mog，其片段、变体和混合物特异的car。
[0534]
在另一个实施方案中，所述其他treg细胞群的细胞在细胞表面表达对ii型胶原，其片段、变体和混合物特异的car。
[0535]
在另一个实施方案中，所述其他treg细胞群的细胞在细胞表面表达对瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化ii型胶原蛋白或瓜氨酸化纤维蛋白原，其片段、变体和混合物特异的car。
[0536]
在另一个实施方案中，所述其他免疫细胞群的细胞在细胞表面表达对hla-a2，其片段、变体和混合物特异的car。
[0537]
在一个实施方案中，所述其他treg细胞群的细胞在细胞表面表达car，其中所述car的细胞外结合结构域是蛋白或其片段或变体，例如自身抗原或其片段或变体。
[0538]
如本文所用，关于药物组合物或药物，术语“基本上由...组成”意指至少一种本发明的treg细胞群是所述药物组合物或药物中仅有的一种具有生物活性的治疗剂或试剂。
[0539]
这样的组合物和药物可包含缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。
[0540]
组合物的施用可以任何方便的方式进行，包括通过气雾吸入、注射、摄入、输液、植入或移植。可以通过经动脉、皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、静脉内(i.v.)注射或腹膜内将本文所述的组合物施用给患者。在一个方面，通过皮内或皮下注射将本发明的t细胞组合物施用给患者。
[0541]
在一个实施方案中，通过i.v.注射施用本发明的treg细胞群。
[0542]
在一个实施方案中，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。
[0543]
在另一个实施方案中，可以直接将本发明的treg细胞群注射到自身免疫和/或炎性疾病或病症的部位。
[0544]
本发明进一步涉及表达本发明的car的treg细胞、这些细胞的群、本文所述的组合物、药物组合物或药物，其用于治疗表达il-23r的细胞介导的疾病或病症。
[0545]
因此，本发明的另一个目的是治疗有此需要的受试者中表达il-23r的细胞介导的疾病或病症的方法，其中所述方法包括向受试者施用至少一个如上所述的treg细胞或treg细胞群。
[0546]
在一个实施方案中，该方法是细胞疗法方法。
[0547]
在一个实施方案中，受试者被施用(或将被施用)自体细胞。换句话说，在一个实施方案中，细胞疗法是自体的。
[0548]
在一个实施方案中，细胞疗法是异源的。
[0549]
在另一个实施方案中，受试者被施用(或将被施用)同种异体细胞。换句话说，在一个实施方案中，细胞疗法是同种异体的。
[0550]
本发明的另一个目的是治疗有此需要的受试者中表达il-23r的细胞介导的疾病或病症的方法，其中所述方法包括向受试者施用至少一种如本文所述的car或编码如本文所述的car的核酸或包含如本文所述的car的载体。在一个实施方案中，本发明的方法是基因疗法方法。
[0551]
在一个实施方案中，表达il-23r的细胞介导的疾病或病症是促炎细胞介导的疾病
或病症、th17介导的疾病或病症或者γδt介导的疾病或病症。
[0552]
在一个实施方案中，表达il-23r的细胞介导的疾病是自身免疫疾病或病症和/或炎性疾病或病症。
[0553]
表达il-23r的细胞介导的疾病或病症的示例包括但不限于克罗恩氏病、溃疡性结肠炎(uc)、大疱性天疱疮(bullous pemphigoid)、狼疮(包括系统性红斑狼疮(sle)、狼疮性肾炎(ln)、盘状狼疮、深部红斑狼疮、冻疮样红斑狼疮(chilblain lupus erythematosus)、肿胀性红斑狼疮(tumidus lupus erythematosus)、严重系统性红斑狼疮、急性皮肤性狼疮、慢性皮肤性狼疮)、多发性硬化病、关节炎(例如类风湿性关节炎、反应性关节炎(赖特综合征(reiter syndrome))、青少年特发性关节炎、强直性脊柱炎和银屑病关节炎)、视神经脊髓炎(nmo)、自身免疫性边缘脑炎(autoimmune limbic encephalitis)(le)、桥本病(hashimoto's disease)、n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmdar)脑炎、自身免疫性溶血性贫血、寻常性天疱疮(pemphigus vulgaris)、重症肌无力、格雷夫斯病(graves
’
disease)、特发性血小板减少性紫癜、肺出血肾炎综合征(goodpasture
’
s syndrome)、乳糜泻、恶性贫血、白癜风、硬皮病、银屑病、干燥综合征、韦格纳肉芽肿病(wegener granulomatosis)、多发性肌炎、皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、抗磷脂综合征、混合性结缔组织病、米勒
·
费希尔综合征(miller fisher syndrome)、格林巴利综合征(guillain-barr
é
综合征)、急性运动性轴索神经病(acute motor axonal neuropathy)、自身免疫性肝炎、疱疹样皮炎、变应性肉芽肿性血管炎(churg-strauss disease)、显微镜下多血管炎、iga肾病、由anca引起的血管炎和其他anca相关疾病、急性风湿热、恶性贫血、1型糖尿病(t1d)、膜性肾病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)、血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura)、单克隆丙种球蛋白病的粘滞性过高(hyperviscosity in monoclonal gammopathies)、溶血性尿毒症综合征(非典型，归因于针对因子h的抗体)、暴发性威尔逊病(wilson disease，fulminant)、朗伯-伊顿肌无力综合征(lambert-eaton myasthenic syndrome)、妊娠中的rbc同种免疫(rbc alloimmunization in pregnancy)、蕈中毒(mushroom poisoning)、急性播散性脑脊髓炎(acute disseminated encephalomyelitis)、溶血性尿毒症综合征(非典型，归因于补体因子突变)、自身免疫性溶血性贫血(危及生命的冷凝集素疾病(life-threatening cold agglutinin disease))、骨髓瘤管型肾病(myeloma cast nephropathy)、输血后紫癜(post-transfusion purpura)、自身免疫性溶血性贫血(温型自身免疫性溶血性贫血)、高脂血症性胰腺炎(hypertriglyceridemic pancreatitis)、甲状腺风暴、僵人综合征(stiff person syndrome)、溶血性尿毒综合征(典型腹泻相关的)、免疫性血小板减少症、abo不相容的实体器官移植(sot)、冷球蛋白血症、肝素诱导性血小板减少症、甲状腺风暴、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根病(chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy)、局灶性节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis)和暴发性肝功能衰竭(fulminant hepatic failure)。
[0554]
在一个实施方案中，所述表达il-23r的细胞介导的疾病或病症选自炎性肠疾病(例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、干燥综合征、全身性硬化病、强直性脊柱炎、1型糖尿病、自身免疫性甲状腺病症、多发性硬化病、重症肌无力、银屑病、银屑病关节炎或葡萄膜炎。
[0555]
在一个实施方案中，表达il-23r的细胞介导的疾病或病症是克罗恩氏病。
[0556]
术语“炎性病症”或“炎性疾病”互换使用，并且如本文所用指与炎症相关的任何异常。
[0557]
在一个实施方案中，炎性病况包括与癌症有关的炎性疾病或病症。
[0558]
在一个实施方案中，炎性病况包括与自身免疫疾病有关的炎性疾病或病症。
[0559]
炎性疾病或病症的示例包括但不限于关节炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、银屑病关节炎、青少年特发性关节炎、青少年类风湿性关节炎、痛风性关节炎(arthritis uratica)、痛风、慢性多关节炎、肩周炎、颈椎关节炎、腰骶关节炎、肠病性关节炎和强直性脊柱炎、哮喘、皮炎、银屑病、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、青少年性皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、纤维化、囊性纤维化、肺纤维化、肝硬化、心内膜心肌纤维化(endomyocardial fibrosis)、纵膈纤维化(dediastinal fibrosis)、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、肾原性纤维化(nephrogenic fibrosis)、瘢痕疙瘩(keloids)、硬皮病、关节纤维化、移植后晚期和慢性实体器官排斥、多发性硬化病、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、天疱疮、寻常性天疱疮(pemphigus vulgaris)、疱疹样天疱疮(pemphigus herpetiformis)、增殖性天疱疮(pemphigus vegetans)、iga天疱疮、红斑性天疱疮(pemphigus erythematosus)、大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)、妊娠性类天疱疮(pemphigoid gestationis)、粘膜性皮肤病、结节性类天疱疮(pemphigoid nodularis)、线性iga大疱性皮肤病、大疱性扁平苔藓、获得性大疱性表皮松解症(epidermolysis bullosa acquisita)、自身免疫性糖尿病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性肾病、糖尿病性血管病、眼部炎症、葡萄膜炎、鼻炎、缺血再灌注损伤、心血管成形术后再狭窄(post-angioplasty restenosis)、慢性阻塞性肺疾病(copd)、肾小球肾炎、格雷夫斯病、胃肠道过敏、结膜炎、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、心绞痛(angina)、小动脉疾病、急性播散性脑脊髓炎、特发性血小板减少性紫癜、多发性硬化病、系统性硬化病、抗磷脂综合征、干燥综合征、自身免疫性溶血性贫血、结肠炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠疾病(ibd)、栓塞、肺栓塞、动脉栓塞、静脉栓塞、过敏性炎症、心血管疾病、移植物相关疾病(graft-related diseases)、移植物抗宿主病(gvhd)、与移植物移植排斥相关的疾病、慢性排斥以及组织或细胞同种异体移植或异种移植、自身免疫性疾病、创伤后变性、中风、移植排斥、过敏性病况和超敏反应例如过敏性鼻炎、过敏性湿疹等、皮肤病、皮肤炎性疾病，或其任意组合。
[0560]
皮肤病的示例包括但不限于痤疮；光化性角化病；特应性皮炎；接触性皮炎；褥疮性溃疡(褥疮)；湿疹；红皮病；血管瘤，例如儿童期血管瘤(hemangioma of childhood)；肥厚性瘢痕(hypertrophic scarring)；扁平苔藓；苔藓样病症；淋巴管生成；银屑病；化脓性肉芽肿；接触传染性软疣(molluscum contagious)；神经纤维瘤病；红斑痤疮(rosacea)；隐性营养不良性大疱性表皮松解(recessive dystrophic epidermolysis bullosa)；疤痕(疤痕疙瘩)；硬皮病；脂溢性角化病；皮肤癌，例如血管肉瘤、基底细胞癌、血管内皮瘤、卡波济氏肉瘤(karposi's sarcoma)、恶性黑色素瘤、黑色素瘤、鳞状细胞癌；皮肤溃疡；例如自体移植和同种异体移植的皮肤移植后的皮肤损害；史蒂文-强森综合征(steven-johnson syndrome)和中毒性表皮坏死松解症；斯特格-韦伯综合征(sturge-weber syndrome)；结节性硬化；静脉溃疡；寻常疣；疣(warts)，例如病毒性疣；伤口；诸如此类。
[0561]
皮肤炎性病症的示例包括但不限于银屑病、滴状银屑病(guttate psoriasis)、反
转型银屑病(inverse psoriasis)、脓疱型银屑病、银屑病型红皮病、急性发热性嗜中性皮肤病(acute febrile neutrophilic dermatosis)、湿疹、多发性湿疹、汗疱湿疹(dyshidrotic eczema)、水疱样掌跖湿疹(vesicular palmoplanar eczema)、寻常痤疮、特应性皮炎、接触性皮炎、过敏性接触性皮炎、皮肌炎、剥脱性皮炎、手湿疹、汗疱疹、红斑痤疮、结节病引起的红斑痤疮、硬皮病引起的红斑痤疮、斯威特氏综合征(sweet'syndrome)引起的红斑痤疮、系统性红斑狼疮引起的红斑痤疮、荨麻疹引起的红斑痤疮、带状疱疹相关性疼痛引起的红斑痤疮、斯威特氏病、嗜中性汗腺炎(neutrophilic hidradenitis)、无菌性脓疱病(sterile pustulosis)、药疹、脂溢性皮炎、玫瑰糠疹、皮肤性菊池病(cutaneous kikuchi disease)、瘙痒性荨麻疹丘疹和妊娠斑、史蒂文-强森综合征和中毒性表皮坏死松解症、纹身反应、韦尔斯综合征(wells syndrome)(嗜酸性蜂窝织炎)、反应性关节炎(莱特尔氏综合征(reiter's syndrome))、肠相关性皮肤病-关节炎综合征、类风湿性嗜中性皮肤病、嗜中性外分泌腺汗腺炎、背手的嗜中性皮肤病、浆细胞性局限性龟头炎(balanitis circumscripta plasmacellularis)、龟头包皮炎(balanoposthitis)、贝切特病(behcet's disease)、离心性环形红斑(erythema annulare centrifugum)、持久性色素异常性红斑(erythema dyschromicum perstans)、多形性红斑(erythema multiforme)、环状肉芽肿(granuloma annulare)、手部皮炎、光泽苔藓(lichen nitidus)、扁平苔藓、硬化性萎缩性苔藓(lichen sclerosus et atrophicus)、慢性单纯性苔藓、小棘苔癣、钱币状皮炎(nummular dermatitis)、坏疽性脓皮病、结节病、角层下脓疱性皮肤病、荨麻疹和短暂性棘皮松解皮肤病。
[0562]
在另一个实施方案中，本发明的car可以用于治疗有此需要的受试者中的自身免疫疾病或病症，其中所述方法包括向受试者施用至少一种本文所述的car或编码本文所述的car的核酸或包含本文所述的car的载体。
[0563]
自身免疫性疾病的示例包括但不限于狼疮(例如红斑狼疮、狼疮肾炎)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto's thyroiditis)、原发性粘液性水肿、格雷夫斯病、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、阿狄森氏病(addison's disease)、糖尿病(例如胰岛素依赖性糖尿病、i型糖尿病、ii型糖尿病)、古德帕斯彻氏综合征(good pasture's syndrome)、重症肌无力、天疱疮、克罗恩氏病、交感性眼炎、自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化病、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎(chronic action hepatitis)、溃疡性结肠炎、干燥综合征、风湿性疾病(例如类风湿性关节炎)、多发性肌炎、硬皮病、银屑病和混合性结缔组织病。
[0564]
在另一个实施方案中，本发明的car可用于治疗有此需要的受试者中的过敏性疾病或病症，其中所述方法包括向受试者施用至少一种本文所述的car或编码本文所述的car的核酸或包含本文所述的car的载体。
[0565]
过敏性疾病的示例包括但不限于抵御吸入性过敏原、摄入性过敏原或接触性过敏原的过敏性疾病。过敏性疾病的其他示例包括但不限于过敏性哮喘、过敏性肺病、食物过敏、特应性皮炎、过敏性鼻炎、过敏性鼻结膜炎、慢性荨麻疹、迟发型超敏性病症和系统性过敏反应。
[0566]
在另一个实施方案中，本发明的car可用于治疗有此需要的受试者中的癌症，其中所述方法包括向受试者施用至少一种本文所述的car或编码本文所述的car的核酸或包含
本文所述的car的载体。
[0567]
如本文所用，“癌症”可以是与表面抗原或癌症标志物相关的任何癌症。
[0568]
癌症的示例包括但不限于急性成淋巴细胞白血病(all)、急性髓样白血病(aml)、腺样囊性癌、肾上腺皮质癌、与aids相关的癌症、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、中枢神经系统的非典型类畸胎样/杆状瘤(atypical teratoid/rhabdoid tumor，central nervous system)、b细胞白血病、淋巴瘤或其他b细胞恶性肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、中枢神经系统癌、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、中枢神经系统的胚胎肿瘤(embryonal tumors，central nervous system)、子宫内膜癌、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤(esthesioneuroblastoma)、尤文氏肉瘤家族瘤(ewing sarcoma family of tumors)、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、骨恶性纤维组织细胞瘤(fibrous histiocytoma of bone,malignant)和骨肉瘤、胆囊癌、胃(胃)癌、胃肠道类癌瘤(gastrointestinal carcinoid tumor)、胃肠道间质瘤(gist)、软组织肉瘤、胚细胞瘤、妊娠滋养细胞瘤、胶质瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、心脏肿瘤、肝细胞(肝)癌癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)、卡波济肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(langerhans cell histiocytosis)、喉癌、白血病、唇和口腔癌、肝癌(原发性)、原位小叶癌(lcis)、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、骨和骨肉瘤的恶性纤维组织细胞瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌(merkel cell carcinoma)、间皮瘤、具有涉及nut基因的隐匿性原发性中线癌的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样肉芽肿(mycosis fungoides)、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、慢性髓性白血病cml、急性髓样白血病(aml)、多发性骨髓瘤、骨髓增生性病症、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、中分化松果体实质细胞瘤(pineal parenchymal tumors of intermediate differentiation)、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚叶肿瘤(supratentorial primitive neuroectodermal tumors)、垂体瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、妊娠和乳腺癌、原发性中枢神经系统(cns)淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾盂和输尿管的肾细胞(肾)癌、移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎里综合征(sezary syndrome)、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(胃)癌、幕上原始神经外胚叶肿瘤、皮肤t-细胞淋巴瘤(t-cell lymphoma,cutaneous)、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞瘤、输尿管和肾盂癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症(waldenstrom macroglobulinemia)、维尔姆斯瘤(wilms tumor)。
[0569]
在一些方面，癌症是b细胞恶性肿瘤。b细胞恶性肿瘤的示例包括但不限于非霍奇金淋巴瘤(nhl)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、小淋巴细胞淋巴瘤(sll/cll)、套细胞淋巴瘤(mcl)、滤泡性淋巴瘤(fl)、边缘区淋巴瘤(mzl)、结节外(malt淋巴瘤)、脾脏淋巴结(单核细胞样b细胞淋巴瘤)、弥漫性大细胞淋巴瘤、b细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤、伯基特淋
巴瘤(burkitt's lymphoma)和淋巴母细胞淋巴瘤。
[0570]
在一个实施方案中，受试者(例如，人)接受本发明的treg细胞群的初次施用，以及一次或多次后续施用，其中一次或多次后续施用在前次施用后的少于15天，例如14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天内进行。
[0571]
在一个实施方案中，治疗有效量的treg细胞被施用或将被施用给受试者。
[0572]
在一个实施方案中，施用给受试者的本发明的至少一个免疫细胞群的treg细胞的量是至少102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个或109个细胞。
[0573]
在一个实施方案中，施用给受试者的本发明的至少一个treg细胞群的treg细胞的量的范围是约102至约109个、约103至约108个、约104至约107个或约105至约106个细胞。
[0574]
在另一个实施方案中，施用给受试者的本发明的至少一个treg细胞群的treg细胞的量的范围是约106至约109个、约106至107个、约106至108个、约107至109个、约107至108个、约108至109个细胞。在另一个实施方案中，施用给受试者的本发明的至少一个treg细胞群的treg细胞的量是约106个、约107个、约108个或约109个。
[0575]
在一个实施方案中，施用给受试者的本发明的至少一个treg细胞群的treg细胞的量是至少102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个或109个细胞/kg体重。
[0576]
在一个实施方案中，施用给受试者的本发明的至少一个treg细胞群的treg细胞的量的范围是约104至109个细胞/kg体重或105至108个细胞/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。
[0577]
在一个实施方案中，受试者每周接受多于一次的本发明的至少一个treg细胞群的施用，例如，每周施用2次、3次或4次本发明的至少一个treg细胞群给受试者。
[0578]
在一个实施方案中，将至少一个treg细胞群与活性剂组合施用给有此需要的受试者。根据一个实施方案，在施用活性剂之前、同时或之后施用至少一个treg细胞群。
[0579]
本发明的另一个目的是含有用于治疗表达il-23r的细胞介导的疾病或病症的材料的制品。
[0580]
该制品可以包含容器以及在容器上或与容器相关的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、小袋等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。容器装有能有效治疗表达il-23r的细胞介导的疾病或病症，例如自身免疫和/或炎性疾病或病症的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针刺入的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的treg细胞群。
[0581]
标签或包装插页可指示该组合物用于治疗表达il-23r的细胞介导的疾病或病症。
[0582]
制品、标签或包装插页可进一步包含用于向患者施用本发明的treg细胞群的说明材料。另外，该制品可进一步包含含有药学上可接受的缓冲液的第二容器，药学上可接受的缓冲液例如注射用抑菌水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。从商业和用户的角度来看，它可进一步包括其他所需材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
[0583]
本发明的另一个目的是包含至少一个本发明的treg细胞群的试剂盒。“试剂盒”指包含至少一个本发明的treg细胞群的任何制品(例如包装或容器)。该试剂盒可以作为一个用于进行本发明的方法的单元被促销、分发或出售。此外，任何或所有试剂盒试剂可以与保
护其免受外部环境影响的容器(例如密封容器内)一起提供。
[0584]
试剂盒还可以包含描述试剂盒及其使用方法的包装插页。还提供了可用于多种目的的试剂盒(例如，用于治疗表达il-23r的细胞介导的疾病或病症)。可以提供含有本发明的treg细胞群的试剂盒。与制品一样，试剂盒可包含容器以及在容器上或与容器相关的标签或包装插页。该容器装有包含至少一个本发明的treg细胞群的组合物。可以包括含有例如稀释剂和缓冲液的额外容器。标签或包装插页可提供成分说明以及预期用途的指导。
[0585]
附图简要说明
[0586]
图1代表了本发明的抗il-23r嵌合抗原受体(car)构建体(例如，具有序列seq id no:54的car)的示意图。抗il23r car包含人cd8前导序列(cd8)、针对人il23r的scfv(αil23r)、cd8铰链(cd8接头)、衍生自人cd8α的跨膜结构域(cd8 tm)、人4-1bb(4-ibb)和cd3ζ(cd3z)的激活结构域。car构建体在框中，具有p2a-gfp编码序列。
[0587]
图2是流式细胞术的点状图的组合，显示了treg的转导效率和car的膜表达。显示了从两个treg克隆获得的结果(代表性结果)。在流式细胞术中通过gfp的表达来评估转导效率。在流式细胞术中通过蛋白-l染色来评估car的膜表达。显示了从两个treg克隆(克隆1：a-b；克隆2：c-d)获得的结果(代表性结果)。(a，c)gfp转导的treg(mock)，(b，d)：用本发明的il-23r car转导的treg。
[0588]
图3是显示了il-23r car介导的treg激活的直方图。在用包被的重组人il-23r(rhuil-23r)(5μg/ml)或用cd3/cd28包被的珠子(珠子与细胞的比例为1:1)激活未转导的treg(mock)或il-23r-car转导的treg(il-23r-car)后24小时，利用流式细胞术通过cd69表达来评估treg细胞的激活。结果显示为2个不同供体的平均值
±
sem。
[0589]
图4是本发明的抗鼠il-23r嵌合抗原受体(car)构建体的示意图。抗il23r car包含人cd8前导序列(cd8)、针对人/鼠il23r(αil23r)的交叉反应性scfv、源自鼠cd28的铰链和跨膜结构域(mcd28接头和mcd28tm)、鼠cd28(mcd28)和鼠cd3ζ(mcd3z)的激活结构域。
[0590]
图5是流式细胞术的点状图的组合，显示了鼠treg的转导效率。在流式细胞术中通过ngfr染色来评估转导效率。
[0591]
图6是显示il-23r car介导的鼠treg(mtreg)激活的直方图。在用cd3/cd28包被的珠子，或平板包被的重组鼠il-23r(mil23r平板包被1μg/ml)或者人或鼠il-23r包被的珠子来激活未转导的mtreg(多克隆treg)或il-23r-car转导的mtreg(il-23r-car mtreg)后24h，理由流式细胞术通过cd69表达来评估mtreg细胞的激活。
[0592]
图7是显示il-23r car mtreg在体外表现出有效的car介导的抑制活性的图。在流式细胞术中通过测量常规t细胞(tconv)的增殖来评估：由未转导的treg(a)，或使用mil-23r包被的珠子(比例1:1或2:1)、cd3/cd28包被的珠子通过其car来刺激的il-23r-car treg(b)，或未刺激的il-23r-car treg(ns)介导的接触依赖性抑制。
[0593]
图8是组合图，其显示了(a)体内实验设计的示意图和(b)不同组小鼠的咪喹莫德(imiquimod)诱导的皮肤炎症模型的pasi评分：未处理(盐水)、经抗il-23i.p.处理、经多克隆-mtreg(8x106)或il-23r-car mtreg(8x106)i.v.处理。
[0594]
实施例
[0595]
通过下列实施例进一步说明本发明。
[0596]
实施例1：抗il23rcar人treg
[0597]
材料与方法
[0598]
细胞和试剂
[0599]
将hek293t细胞(lentix，ozyme，法国)在补充有10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基中培养。
[0600]
foxp3 treg的分离
[0601]
使用购自stemcell的easyseptm人cd4
+
cd127
低
cd25
+
调节性t细胞分离试剂盒，从血沉棕黄层中新鲜分离出cd4
+
cd25
+
cd127
低
treg细胞。分离后，通过foxp3染色来评估纯度。将分离的treg细胞以每孔5
×
105个细胞接种到24孔板(costar)中的x-vivo 15培养基(lonza)中，并用珠子与细胞比例为1:1的抗cd3/抗cd28包被的微珠(invitrogen，carlsbad，ca)激活。treg细胞在激活同时接受雷帕霉素(100ng/ml)。在第2、5、7和9天添加il-2(1000单位/ml，miltenyi)。
[0602]
car构建体
[0603]
抗il23r car构建体包含人cd8前导序列(aa1-22)(例如，具有序列seq id no:39)、针对人il23r的scfv(例如，具有序列seq id no:55)、cd8铰链(例如，具有序列seq id no:13)和衍生自人cd8α(aa138-206)的跨膜结构域(例如，具有序列seq id no:21)、人4-1bb(aa214-255)(例如，具有序列seq id no:29)和cd3ζ(aa52-164)(例如，具有序列seq id no:26)的激活结构域。car构建体在框中，具有p2a-gfp编码序列。
[0604]
载体和滴定
[0605]
使用经典的4-质粒慢病毒系统来生产car构建体。简而言之，用第三代慢病毒转移载体(ptx266)、表达hiv-1gagpol的质粒(pmdlgprre)、表达hiv-1rev的质粒(prsv.rev)和表达vsv-g、水疱性口炎病毒的包膜糖蛋白的质粒(pmd2.g)来转染hek293t细胞。转染后一天，收集病毒上清液，通过离心进行浓缩，等分并冷冻在-80℃下以长期保存。在用一系列稀释的病毒上清液转导jurkat t细胞以及在3天后使用流式细胞术通过监测绿色荧光蛋白(gfp)表达评估转导效率后，获得以每毫升转导单位数(tu/ml)来表示的感染滴度。
[0606]
慢病毒转导
[0607]
在用由cd8的前导序列和随后的scfv抗il-23r组成的嵌合受体激活后2天，转导treg。该细胞外结构域经由人cd8的铰链和跨膜区与信号传导序列连接。信号传导序列由4-1bb的细胞内结构域和随后的细胞内人cd3ζ链组成。简而言之，通过将每ml 0.5
×
107个转导单位(tu)装载到每个孔中来进行转导。在37℃下6小时后，通过冲洗除去病毒颗粒。然后将平板在37℃和5％co2下温育。在转导后5天检查转导效率(通过gfp表达来评估)和细胞表面的嵌合受体水平(通过蛋白-l染色来评估)。
[0608]
蛋白-l染色
[0609]
通过用偶联apc的蛋白l标记car来进行细胞表面car表达的定量，并使用流式细胞术进行分析。简而言之，洗涤后，将细胞重悬于0.2ml冰冷的洗涤缓冲液(pbs 4％bsa)中，并与5μg蛋白l在4℃下温育20分钟。将细胞用0.2ml冰冷的洗涤缓冲液洗涤3次，并且然后在0.2ml洗涤缓冲液中与1μl偶联apc的链霉亲和素(streptavidin)温育(在黑暗中)。使用macsquantify软件(miltenyi)在macquant(miltenyi)上分析免疫荧光染色。
[0610]
结果
[0611]
使用来自stem cell的试剂盒，基于cd4
+
cd127
低
cd25
+
谱对人treg细胞进行分选，并
在病毒转导前用抗cd3/抗cd28包被的珠子以及il-2进行预刺激2天。用嵌合抗原受体(il-23r-car)转导treg，该嵌合抗原受体由抗il-23r的单链可变片段(scfv)组成，并经由人cd8的铰链和跨膜区与信号传导序列连接，与人4-1bb的细胞内部分连接，其继而与细胞内人cd3ζ链融合(参见图1)。
[0612]
将病毒上清液添加到250μl xvivo培养基中的5x105个受刺激的treg中。将细胞培养7天，每2天添加il-2。foxp3阳性细胞中通过gfp表达评估的转导效率显示了约80％的gfp
+
，并且它们全部在细胞表面表达car(图2)。
[0613]
我们随后检查了转导的treg经由il-23r car被激活的能力。使用平板包被的重组人il-23r或珠子包被的il-23r刺激treg。刺激后24小时，在流式细胞术中通过cd69表达来分析激活状态。
[0614]
在平板或珠子包被的重组人il-23r存在下的cd69上调表明，可通过car触发来激活il-23r car转导的treg(图3)。
[0615]
实施例2：抗il23r car鼠treg
[0616]
材料与方法
[0617]
foxp3 treg的分离
[0618]
使用life technologies的调节性t细胞分离试剂盒从c57b16小鼠的脾脏中新鲜分离出cd4
+
cd25
+
鼠treg细胞。分离后，通过foxp3染色评估纯度。将分离的treg细胞以每孔5
×
105个细胞接种到24孔板中的rpmi 10％svf中，并用珠子与细胞的比例为2:1的抗cd3/抗cd28包被的微珠(invitrogen)激活。tregs细胞在激活同时和第4天接受雷帕霉素(50ng/ml)。最后，在第0、2、4天，添加il-2(1000个单位/ml)。
[0619]
car构建体
[0620]
本实验中使用的抗鼠il23r car构建体(例如，具有核酸序列seq id no:77和氨基酸序列seq id no:78)包含人cd8前导序列(cd8)、针对人/鼠il23r(αil23r)的交叉反应性scfv、衍生自鼠cd28的铰链和跨膜结构域(mcd28接头和mcd28 tm)、鼠cd28(mcd28)和鼠cd3ζ(mcd3z)的激活结构域。
[0621]
载体和滴定
[0622]
使用经典的4-质粒慢病毒系统来生产car构建体。简而言之，用第三代慢病毒转移载体(ptx266)、表达hiv-1gagpol的质粒(pmdlgprre)、表达hiv-1rev的质粒(prsv.rev)和表达eco-mlv、亲嗜性鼠白血病病毒的包膜糖蛋白的质粒(pcmv-eco)来转染hek293t细胞。转染后一天，收集病毒上清液，通过离心进行浓缩，等分并冷冻在-80℃下以长期保存。在用一系列稀释的病毒上清液转导jurkat t细胞以及在3天后使用流式细胞术通过监测绿色荧光蛋白(gfp)表达评估转导效率后，获得以每毫升转导单位数(tu/ml)来表示的感染滴度。
[0623]
慢病毒转导
[0624]
在用由cd8的前导序列和其后的scfv抗il-23r组成的嵌合受体激活后2天，转导treg。该细胞外结构域经由人cd8的铰链和跨膜区与信号传导序列连接。信号传导序列由4-1bb的细胞内结构域和随后的细胞内人cd3ζ链组成。简而言之，通过将0.5
×
107tu/ml装载到每个孔中来进行转导。在37℃下6小时后，通过冲洗除去病毒颗粒。然后将平板在37℃和5％co2下温育。在转导后5天检查转导效率(通过gfp表达来评估)和细胞表面的嵌合受体水平(通过蛋白-l染色来评估)。
[0625]
car-tregs的激活测定
[0626]
在培养的第7天进行激活测定。简而言之，将0.05x106的treg单独接种在96u底板中，或在抗cd28/抗cd3包被的珠子(treg与珠子的比例为2:1)的存在下，或在平板包被的鼠il-23r(1μg/ml)的存在下，或在200μl终体积中的人以及鼠il-23r包被的珠子的剂量递增的存在下。在37℃、5％co2下24小时后，对细胞进行cd4和cd69染色，然后使用流式细胞术进行分析。
[0627]
t细胞增殖的抑制测定
[0628]
在培养的第7天进行抑制测定。在卵白蛋白(100μg/ml)、未转导的treg(多克隆treg)或il-23rmcar treg的存在下，在有或无鼠il-23r包被的珠子或抗cd3/cd28珠子的情况下，将来自otii小鼠的脾细胞(对ova特异的tcr的tg)共培养4天。在第4天，收获细胞，并通过流式细胞术通过确定染料450的稀释度来评估脾细胞中cd4的增殖。tconv增殖的抑制百分比计算如下：
[0629][0630]
咪喹莫德诱导的银屑病样皮肤炎症
[0631]
8至10周龄的小鼠(c57bl/6)连续7天每日在背部剃毛处接受62.5mg的市售imq乳膏(5％)(aldara；3m pharmaceuticals)局部剂量，用对照载体乳膏(vaseline lanette乳霜；fagron)相似地处理对照小鼠。在第2天，腹膜内注射抗il-23(100ug)，并对每只小鼠(多克隆或ail-23r-car)静脉内注射8x106的treg。在第7天处死所有小鼠。为了对背部皮肤的炎症严重性进行评分，基于临床银屑病面积和严重性指数(psoriasis area and severity index，pasi)开发了客观评分系统。以0至4的标度对发红、脱皮(scaling)和增厚单独进行评分：0，无；1，轻微；2，中度；3，显著；4，非常显著。使用带有红色斑点(red taint)的计分表对发红程度进行评分。累积评分(发红加脱皮加增厚)作为炎症严重程度的量度(0-12级)。根据法国关于动物实验的法律，所有实验均由动物伦理委员会批准。
[0632]
结果
[0633]
分离后，在病毒转导之前，用抗cd3/抗cd28包被的珠子以及il-2对鼠treg(mtreg)细胞进行预刺激2天。用嵌合抗原受体(il-23r-mcar)转导mtreg，该嵌合抗原受体由交叉反应性hu/ms抗il-23r的单链可变片段(scfv)组成，并经由鼠cd8的铰链和跨膜区与信号传导序列连接，与鼠cd28的细胞内部分连接，其进而与细胞内鼠cd3ζ链融合(参见图4)。
[0634]
将病毒上清液添加到250μl xvivo培养基中的5x105受刺激的treg中。将细胞培养7天，每2天添加il-2。通过ngfr染色来评估转导效率以及细胞表面的car表达，并且显示了约70％的转导细胞在细胞表面表达car。
[0635]
(图5)。
[0636]
然后，检查了转导的mtreg经由il-23r car被激活的能力。用平板包被的重组鼠il-23r或珠子包被的人以及鼠il-23r刺激mtreg。刺激后24小时，在流式细胞术中通过cd69表达分析激活状态。在平板或珠子包被的重组人/鼠il-23r存在下的cd69上调表明，可以通过car触发来激活il-23r car转导的mtreg(图6)。
[0637]
最后，重要的特征是用il-23r-car转导的foxp3
+
treg细胞通过car触发维持了其
抑制性接触依赖性功能(图7a和b)。
[0638]
最后，如图8a和b所示，测试了il-23r car treg在咪喹莫德诱导的皮肤炎症模型中的体内活性，该模型被描述为由il-23/il-23r轴驱动。抗il-23抗体(白色方形)证实了阻断il-23会导致临床评分的降低。有趣的是，il-23r-car mtreg(白色圆圈)在其i.v.输注后两天也能够引起临床评分的减少，而多克隆treg(白色三角形)对临床进程没有影响。

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