用于原位检测核酸的进一步增强信号放大的方法与流程

用于原位检测核酸的进一步增强信号放大的方法
[0001]
发明背景
[0002]
本申请要求于2018年4月9日提交的美国临时申请号62/655,143和2018年5月4日提交的美国临时申请号62/667,237的权益，其每一个的全部内容通过引用并入本文。
[0003]
本发明总体上涉及核酸的检测，并且更具体地涉及核酸的原位检测。
[0004]
原位杂交(ish)是允许检测和定位形态学保存的单个细胞，组织学组织切片或染色体制备物中的特定核酸分子的一种技术。ish基于核酸探针(通常为寡核苷酸)与特定靶标核酸(例如dna或rna)的互补杂交。
[0005]
核酸的ish检测在生命科学研究和诊断中很重要，因为它允许将与检测到的核酸相关的分子信号定位到相应的细胞，从而可以洞悉正在研究的生物系统或与诊断应用相关的疾病病况。使用ish的一个重要方面，尤其是在检测低丰度核酸时，是提供与靶标核酸的阳性检测以及低背景和非特异性结合探针相关的高信号。
[0006]
因此，存在以高灵敏度和特异性检测核酸分子的方法的需求。本发明满足了该需求并且还提供了相关的优点。


技术实现要素：

[0007]
在一个实施方案中，本发明提供了包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(pre-pre-amplifier)(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二碱基ppa的碱基ppa对，其中所述第一碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，和(iii)包含第一延伸预-预扩增子(延伸ppa)的结合位点的区段；并且其中所述第二碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个第二预扩增子结合区段重复(第二pa-bsr)的区段，和(iii)包含第二延伸ppa的结合位点的区段；其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列，并且其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(c)包含所述第一和第二延伸ppa的延伸ppa组，其中所述第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；并且其中所述第二延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；(d)多个预扩增子(pre-amplifier)(pa)，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(e)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)多
个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成sgc。
[0008]
在此类组合物的一个实施方案中，所述延伸ppa组包含至少一个额外的第一延伸ppa和至少一个额外的第二延伸ppa，其中所述额外的第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第一延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；其中所述额外的第二延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第二延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；并且其中所述至少一个额外的第一ppa任选地包括包含所述第一延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)，并且所述至少一个额外的第二ppa任选地包括包含所述第二延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序。
[0009]
在此类组合物的一个实施方案中，所述第一碱基ppa与所述第一延伸ppa之间和/或所述延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa与所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸ppa之间的结合位点包含互补序列。
[0010]
在此类组合物的一个实施方案中，所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系。
[0011]
在此类组合物的一个实施方案中，所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸ppa拴系至所述第一延伸ppa，并将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第二延伸ppa。
[0012]
在此类组合物的一个实施方案中，所述第一碱基ppa和/或所述第一延伸ppa包括包含所述第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，其中所述ppa的区段按(i)、(ii)、(iv)、(iii)的顺序。
[0013]
在另一实施方案中，本发明提供包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的一对ppa，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一
pa-bsr)的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)多个碱基预扩增子(碱基pa)，其中所述碱基pa包括包含四个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段，和(iv)与延伸预扩增子(延伸pa)结合的区段，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)、(iv)的顺序；(d)多个延伸pa，其中所述延伸pa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点结合的区段，和(ii)多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)；并且其中所述延伸pa任选地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(e)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成sgc。
[0014]
在此类组合物的一个实施方案中，所述碱基pa和所述延伸pa之间的结合位点包含互补序列。在此类组合物的一个实施方案中，所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点和/或所述延伸pa的所述延伸pa结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa拴系至所述碱基pa上和/或将所述延伸pa彼此拴系。
[0015]
在另一实施方案中，本发明提供包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的一对ppa，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)多个预扩增子(pa)，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(d)多个碱基扩增子(碱基amp)，其中所述碱基amp包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段，和(iii)与延伸扩增子(延伸amp)结合的区段，按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(e)多个延伸amp，其中所述延伸amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点结合的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；并且其中所述延伸amp任选地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成sgc。
[0016]
在此类组合物的一个实施方案中，所述碱基amp与所述延伸amp之间的结合位点包
含互补序列。在此类组合物的一个实施方案中，所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点和/或所述延伸amp的所述延伸amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸amp拴系至所述碱基amp上和/或将所述延伸amp彼此拴系。
[0017]
在本发明的组合物的一些实施方案中，(i)其中所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述区段按(i)、(iii)、(ii)的顺序；和(ii)其中所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)，其中所述区段按(iv)、(i)、(ii)、(iii)的顺序；或其中所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述区段按(iii)、(i)、(ii)的顺序。
[0018]
在另一实施方案中，本发明提供包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的一对ppa，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，其中所述第一pa-bsr包含两个区段，(ia)包含第一预扩增子(第一pa)的结合位点的区段和(ib)包含第二pa的结合位点的区段，其中所述第一ppa的区段按(i)、(ia)、(ib)的顺序；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第二pa-bsr包含两个区段，(iia)包含所述第二pa的结合位点的区段和(iib)包含所述第一pa的结合位点的区段，其中所述第二ppa的区段按(i)、(iia)、(iib)的顺序；(c)多个所述第一pa和多个所述第二pa，其中所述第一pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第二pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第一pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；并且其中所述第二pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(d)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(e)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成sgc。
[0019]
在此类组合物的一个实施方案中，所述ppa包含碱基ppa和延伸ppa。在此类组合物的一个实施方案中，所述pa包含碱基pa和延伸pa。在此类组合物的一个实施方案中，所述amp包含碱基amp和延伸amp。
[0020]
在此类组合物的一些实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述第一碱基ppa和所述第一延伸ppa之间和/或所述第一延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa和所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸
ppa之间的结合位点包含互补序列；和/或其中所述碱基pa和延伸pa之间的结合位点，和或所述碱基amp和延伸amp之间的结合位点包含互补序列。
[0021]
在此类组合物的一些实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系；或其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点和/或所述延伸pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa或amp拴系至所述碱基pa或amp上和/或将所述延伸pa或amp彼此拴系。
[0022]
在此类组合物的一些实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸ppa拴系至所述第一延伸ppa，并将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第二延伸ppa。
[0023]
在此类组合物的一些实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述第一碱基ppa和/或所述第一延伸ppa包括包含所述第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点第四区段(iv)，其中所述ppa的区段按(i)、(ii)、(iv)、(iii)的顺序。
[0024]
在此类组合物的一些实施方案中，(i)所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；并且其中所述区段按(i)、(iii)、(ii)的顺序；和(ii)所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)，其中所述区段按(iv)、(i)、(ii)、(iii)的顺序；或所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述区段按(iii)、(i)、(ii)的顺序。
[0025]
在本发明的组合物的一些实施方案中，所述组合物进一步包含第二sgc，其中所述第二sgc包含与所述第一靶标不同的第二靶标，其中所述sgc包含独立于所述第一sgc的构造的所述第二靶标的sgc构造，并且其中所述第二sgc与所述第一sgc是可区分的。在此类组合物中，所述组合物进一步包含第三sgc，其中所述第三sgc包含与所述第一和第二靶标不同的第三靶标，其中所述sgc包含独立于所述第一sgc和/或所述第二sgc的构造的sgc构造，并且其中所述第三sgc与所述第一和第二sgc是可区分的。
[0026]
在一个实施方案中，本发明的组合物包含与所述tp对结合的靶标核酸。在一个实
施方案中，本发明的组合物进一步包含细胞。
[0027]
在一个实施方案中，本发明提供检测靶标核酸的方法，其包括使样品核酸与用于组装上述的组合物中的sgc的组分接触，将sgc组装在所述靶标核酸上，并检测所述靶标核酸。在此类方法的一个实施方案中，所述核酸在细胞中。
[0028]
在一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含用于组装sgc的组分，其中所述试剂盒包含上述任何所述组合物的所述的ppa、pa、amp和lp。在此类试剂盒的一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含上述任何所述组合物的所述的tp。
[0029]
在一个实施方案中，本发明提供了固定且透化的细胞的样品，所述细胞包含组装的上述任何组合物的sgc。
[0030]
在一个实施方案中，本发明提供了载玻片，其上固定化有多个固定且透化的细胞，其包含含有靶标核酸以及组装的上述任何组合物的sgc的至少一个固定且透化的细胞。
[0031]
在一个实施方案中，本发明提供了包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二碱基ppa的碱基ppa对，其中所述第一碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，和(iii)包含第一延伸预-预扩增子(延伸ppa)的结合位点的区段；并且其中所述第二碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个第二预扩增子结合区段重复(第二pa-bsr)的区段，和(iii)包含第二延伸ppa的结合位点的区段；其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)包含所述第一和第二延伸ppa的延伸ppa组，其中所述第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；并且其中所述第二延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；(d)多个预扩增子(pa)，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(e)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成sgc。
[0032]
在此类组合物的一个实施方案中，所述延伸ppa组包含至少一个额外的第一延伸ppa和至少一个额外的第二延伸ppa，其中所述额外的第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第一延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；其中所述额外的第二延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第二延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；并且其中所述至少一个额外的第一ppa任选地包括包含所述第一延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)，并且所
述至少一个额外的第二ppa任选地包括包含所述第二延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)。
[0033]
在此类组合物的一个实施方案中，所述第一碱基ppa与所述第一延伸ppa之间和/或所述延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa与所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸ppa之间的结合位点包含互补序列。
[0034]
在一个实施方案中，所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系。
[0035]
在一个实施方案中，所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸ppa拴系至所述第一延伸ppa，并将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第二延伸ppa。
[0036]
在此类组合物的一个实施方案中，所述第一碱基ppa和/或所述第一延伸ppa包括包含所述第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点第四区段(iv)。
[0037]
在另一实施方案中，本发明提供包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的一对ppa，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)多个碱基预扩增子(碱基pa)，其中所述碱基pa包括包含四个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段，和(iv)与延伸预扩增子(延伸pa)结合的区段；(d)多个延伸pa，其中所述延伸pa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点结合的区段和(ii)多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)；并且其中所述延伸pa任选地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)；(e)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)
包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成sgc。
[0038]
在此类组合物的一个实施方案中，所述碱基pa和所述延伸pa之间的结合位点包含互补序列。
[0039]
在一个实施方案中，所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点和/或所述延伸pa的所述延伸pa结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa拴系至所述碱基pa上和/或将所述延伸pa彼此拴系。
[0040]
在另一实施方案中，本发明提供包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的一对ppa，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)多个预扩增子(pa)，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(d)多个碱基扩增子(碱基amp)，其中所述碱基amp包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段，和(iii)与延伸扩增子(延伸amp)结合的区段；(e)多个延伸amp，其中所述延伸amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点结合的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；并且其中所述延伸amp任选地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成sgc。
[0041]
在此类组合物的一个实施方案中，所述碱基amp与所述延伸amp之间的结合位点包含互补序列。
[0042]
在一个实施方案中，所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点和/或所述延伸amp的所述延伸amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸amp拴系至所述碱基amp上和/或将所述延伸amp彼此拴系。
[0043]
在本发明的组合物的一个实施方案中，(i)其中所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；和(ii)其中所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)；或其中所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)。
[0044]
在另一实施方案中，本发明提供包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的一对ppa，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，其中所述第一pa-bsr包含两个区段，(ia)包含第一预扩增子(第一pa)的结合位点的区段和(ib)包含第二pa的结合位点的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第二pa-bsr包含两个区段，(iia)包含所述第二pa的结合位点的区段和(iib)包含所述第一pa的结合位点的区段；(c)多个所述第一pa和所述第二pa，其中所述第一pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第二pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第一pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；并且其中所述第二pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(d)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(e)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成sgc。
[0045]
在此类组合物的一个实施方案中，所述ppa包含碱基ppa和延伸ppa。在此类组合物的一个实施方案中，所述pa包含碱基pa和延伸pa。在此类组合物的一个实施方案中，所述amp包含碱基amp和延伸amp。
[0046]
在此类组合物的一个实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述第一碱基ppa和所述第一延伸ppa之间和/或所述第一延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa和所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸ppa之间的结合位点包含互补序列；和/或其中所述碱基pa和延伸pa之间的结合位点，和或所述碱基amp和延伸amp之间的结合位点包含互补序列。
[0047]
在此类组合物的一个实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系；或其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点和/或所述延伸pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa或amp拴系至所述碱基pa或amp上和/或将所述延伸pa或amp彼此拴系。
[0048]
在此类组合物的一个实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个
部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸ppa拴系至所述第一延伸ppa，并将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第二延伸ppa。
[0049]
在此类组合物的一个实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述第一碱基ppa和/或所述第一延伸ppa包括包含所述第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点第四区段(iv)。
[0050]
在此类组合物的一个实施方案中，(i)其中所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；和(ii)其中所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)；或其中所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)。
[0051]
在一个实施方案中，所述组合物进一步包含第二sgc，其中所述第二sgc包含与上述所述组合物的第一靶标不同的第二靶标，其中所述sgc独立于所述第一sgc的构造包含上述任何组合物的sgc构造，并且其中所述第二sgc与所述第一sgc是可区分的。
[0052]
在一个实施方案中，所述组合物进一步包含第三sgc，其中所述第三sgc包含与上述组合物的第一靶标和第二靶标不同的第三靶标，其中所述sgc独立于所述第一sgc和/或所述第二sgc的构造包含上述组合物的sgc构造，并且其中所述第三sgc与所述第一和第二sgc是可区分的。
[0053]
在一个实施方案中，所述组合物包含与所述tp对结合的靶标核酸。在一个实施方案中，所述组合物进一步包含细胞，例如包含靶标核酸的细胞。
[0054]
在另一实施方案中，本发明提供检测靶标核酸的方法，其包括使样品核酸与用于组装上述任何组合物中的sgc的组分接触，将sgc组装在所述靶标核酸上，并检测所述靶标核酸。在此类方法的一个实施方案中，所述核酸在细胞中。
[0055]
在另一实施方案中，本发明提供试剂盒，其包含用于组装sgc的组分，其中所述试剂盒包含上述任何组合物的ppa、pa、amp和lp。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含上述任何组合物的tp。
[0056]
在另一实施方案中，本发明提供了细胞的样品，所述细胞包含组装的上述任何组合物的sgc。所述细胞可以任选地是固定的和/或透化的。
[0057]
在另一实施方案中，本发明提供载玻片，其上固定化有多个细胞，其包含含有靶标核酸以及组装的上述任何组合物sgc的至少一个细胞。所述细胞可以任选地是固定的和/或透化的。
[0058]
附图的简要说明
[0059]
图1a-1c显示了使用信号产生复合物(sgc)检测核酸靶标的前述方法的示意图。
ppa，预-预扩增子；pa，预扩增子；amp，扩增子；lp，标记探针。
[0060]
图2a-2c显示了通过延伸sgc的放大组分来检测核酸的示例性实施方案。
[0061]
图3a-3d显示了连接延伸组分的示例性实施方案。
[0062]
图4显示了使用对称协同杂交检测核酸的示例性实施方案。
[0063]
图5显示了通过利用对称协同杂交增加sgc的密度来检测核酸的示例性实施方案。
[0064]
图6显示了核酸多重检测的示例性实施方案。
[0065]
图7a和7b显示了通过使用扩增寡核苷酸延伸的原位杂交来检测核酸。
[0066]
图8a-8c显示了通过使用对称扩增分子以增加每个sgc内的标记探针的量的原位杂交来检测核酸。
[0067]
图9a和9b显示了通过用于检测同一组织样品内的多个靶标的原位杂交来检测核酸。
[0068]
发明详述
[0069]
本发明涉及在检测核酸的样品中增加信噪比的方法的应用。该方法利用扩增分子的级(tier)或层(layer)来增加与检测到的核酸相关的信号，而同时扩增层的组分被配置成减少假阳性，从而增加信噪比。如本文所述，扩增层可以包含预-预扩增子(ppa)、预扩增子(pa)和扩增子(amp)。
[0070]
本发明涵盖了增强核酸靶标原位检测的现有方法的信号放大能力的方法，其包括诸如剪接点、点突变、microrna和融合rna转录物的短靶标。在这些现有方法中，使用杂交扩增系统来促进靶标核酸的检测和可视化。先前在us 2009/0081688中描述的方法的一个实例在图1a中显示，其中使用结合靶标核酸中的相邻核酸序列的一对或更多对靶标探针(以“z”构造显示)来检测靶标核酸，其通过杂交与称为预扩增子(pa)的长核酸分子结合。pa含有多个重复的序列区段或结构域，每个序列区段或结构域结合称为扩增子(amp)的另一个长核酸分子。每个amp还含有多个重复的序列区段或结构域，每个序列区段或结构域都结合标记探针分子(lp)。此连续的杂交过程构建了信号产生复合物(sgc)，其包括靶标核酸序列、靶标探针对、所有扩增分子层和标记探针分子，其用于产生可检测的信号。可以通过多种标记方法生成来自sgc的可检测信号，例如用于直接可视化的荧光或发色标记，直接添加可检测的金属同位素，或产生荧光、发色或其他可检测信号的酶促或化学反应，如本领域中已知的和本文所述。此类原位检测方法可以用于固定化在载玻片上的组织标本上，悬浮液中的单个细胞(例如从血液样品中分离的外周血单个核细胞)上，在靶标核酸以均质状态存在的基于溶液的测定中，或在靶标核酸已被选择性捕获到固体基质上的样品中。
[0071]
在图1中，靶标探针以“z”构造描绘，如例如在美国专利号7,709,198，美国公布2008/0038725和2009/0081688以及wo 2007/001986和wo 2007/002006中所述。图1中所示的z构造在两个靶标探针对中具有相同定向的靶标结合位点(即，靶标结合位点在预扩增子或预-预扩增子结合位点的5'，或靶标结合位点在预扩增子或预-预扩增子结合位点的3
’
)。应该理解，如图1中所描绘的此类构造仅仅是示例性的。应该理解，靶标探针对可以独立地处于任一定向，即，一对靶标探针中的一个成员可以具有预扩增子或预-预扩增子结合位点5
’
或3
’
的靶标结合位点，并且可以与具有预扩增子或预-预扩增子结合位点的5
’
或3
’
的第二探针配对，使得靶标探针对具有四种可能的定向组合。
[0072]
现有的原位杂交(ish)方法的一个重大挑战是由于sgc组分的非特异性结合或捕
获，可能在不存在靶标核酸的情况下产生信号。成功应用ish方法的关键要求是，通过特异性识别靶标序列产生的真实信号应足够强以易于检测，而在不存在靶标核酸的情况下，任何假信号应足够低，以不可检测或可与真实的靶标产生的信号容易区分。在存在或不存在靶标核酸的情况下产生的信号的最大信号差异(也称为高“信噪比”)对于具有高灵敏度和特异性的稳健的原位检测是重要的。
[0073]
对于更长的靶标核酸，可以通过使用结合至同一靶标核酸分子的多个靶标探针对来实现高信噪比。在这种情况下，由任何单个探针对产生的sgc可以足够小，使得不足以产生可检测的信号，从而需要从紧邻的多个探针对生成sgc，以允许信号检测。需要通过多个靶标探针对杂交以产生可见信号来对同一靶标进行冗余检测，这为这些长靶标产生了高度的检测特异性。为了检测较短的核酸序列，其中仅一对靶标探针供选择使用，或者由于靶标核酸序列太短而无法结合多个探针对，例如由于靶标核酸的长度短，单个sgc必须足够大以产生可检测的信号。
[0074]
通过增加能够在sgc内杂交的标记探针的总数，可以生成更稳健的信号。一种方法是增加任何一组扩增分子的长度，从而增加杂交区段的数量，并因此增加可以在sgc中结合的标记探针的数量。但是，使用较大的扩增分子可能会出现问题，因为较大的分子可能难以扩散到ish分析的细胞的细胞基质中，也难以进入靶标核酸上的杂交位点。另外，较大的分子也更倾向于非特异性地结合或粘附，产生背景噪声或假阳性信号。此外，长分子的产生要昂贵得多。使用较短的扩增分子可以将它们合成为寡核苷酸，其可以经济、一致地制备。
[0075]
另一种方法是在sgc内添加额外的扩增分子层，即使每个组成分子的大小受到限制，也允许生成大的sgc。如图1b中所示，可以添加称为预-预扩增子(ppa)的额外的扩增分子层以生成sgc。使用ppa产生含有更多的标记探针的更大的sgc，并且允许改善细胞渗透性，同时将非特异性结合或捕获引起的背景噪音保持在低水平。但是，这种增加扩增层数的方法对于可以添加的层数有限制。例如，如果sgc中最接近靶标探针的扩增子分子(例如图1b中的ppa)非特异性地结合或捕获，则大的sgc可能建立在分子上，从而产生假阳性信号。
[0076]
在us 2017/0101672中已经描述了另一种方法，其通过在sgc的任何层中要求多个不同分子的协同杂交以允许下一层的杂交，在us 2009/0081688中描述的方法上进行了改进。如图1c中所示，图1b中显示的与两个靶标探针结合的ppa分子以两个分子ppa-1和ppa-2提供，每个分子都与两个靶标探针之一结合。当每个pa与ppa-1和ppa-2同时杂交时，它们只能在sgc中稳定结合。在这种方法中，仅一个扩增分子(例如一个ppa)可能被非特异性地捕获或杂交，不足以允许sgc的生长。但是，当存在扩增分子层组装所需的两个或更多个组分时，它们允许下一层或级(在此情况下为pa)稳定杂交。该方法在不负面影响信噪比的情况下增加了扩增层的数量。也许令人惊讶的是，即使这种策略也可能有局限性，因为在多个扩增层中具有许多协同杂交可以在结构上削弱sgc，可以增加总杂交时间，从而可以降低测定的稳健性。
[0077]
在先前描述的方法的基础上，本发明提供了进一步提高sgc内的放大能力，同时还减少了人工非靶标特异性信号的产生。这是通过在sgc创建过程中进行额外的核酸杂交，将单个扩增分子分为多个较小片段的集合以及增加能够在单个sgc内进行杂交的标记探针数量的另外的方法来实现的，从而允许更稳健地检测靶标核酸序列。同时，使用多个较短的扩增分子允许样品更有效地渗透，并减少样品内扩增分子的非特异性捕获(其可以在不存在
靶标核酸的情况下产生信号)。增加信号检测同时减少非特异性信号提供了对核酸靶标的更稳健、特异性的检测，尤其是在样品内罕见、序列短、与其他核酸序列高度同源和/或部分降解的核酸靶标。此外，本发明有助于在同一样品内同时检测该性质的多个不同的核酸靶标。
[0078]
用于原位检测核酸靶标的先前方法包括组装分支dna以形成信号产生复合物(sgc)。例如，在三层杂交放大系统中，预-预扩增子分子与靶标探针杂交，然后是一层与预-预扩增子杂交的预扩增子分子，然后是一层与预扩增子杂交的扩增子分子(参见图1b)。标记探针是连接到信号产生元件(例如荧光或发色标签，金属同位素或信号产生酶)的专门分子。标记探针与扩增子分子杂交以形成完整的sgc(图1a)。靶标检测的特异性通过要求在同一扩增层上多个不同元件的同时杂交来管理。对于更长的核酸靶标，可以通过要求同时结合多个相邻的靶标探针对来有效控制信号特异性，其中仅通过单个靶标探针对的结合产生的sgc不足以产生可检测的信号，但是由多个相邻靶标探针对形成sgc产生的累积的信号足以允许信号检测。在仅可以使用单个靶标探针对的情况下，可以通过要求以更高的放大水平同时结合多个元件来获得信号特异性。在使用此类协同杂交的放大水平上，杂交结构域被划分在多个扩增分子之间(图1c)。与使用多个探针对时相比，使用单个探针对进行信号检测需要生成可作为单个实体检测到的较大的sgc。
[0079]
本发明基于在靶标核酸之间构建复合物以便用可检测的标记物标记靶标核酸。此类复合物有时被称为信号产生复合物(sgc；参见，例如，us 20170101672)。此类复合物或sgc是通过构建分子层来实现的，该分子层允许将大量标记物附着到靶标核酸上。
[0080]
本发明的方法可以采用信号产生复合物(sgc)，其中sgc包含多个分子而不是单个分子。此类sgc对于扩增可检测信号，提供靶标核酸更高灵敏度检测特别有用。此类用于放大信号的方法描述于例如美国专利号5,635,352、5,124,246、5,710,264、5,849,481和7,709,198，以及美国公布2008/0038725和2009/0081688，以及wo 2007/001986和wo 2012/054795中，其每一个均通过引用并入本文。sgc的产生是rnascope
tm
测定的原理(参见美国专利号7,709,198、8,658,361和9,315,854，美国公布2008/0038725、2009/0081688和2016/0201117，以及wo 2007/001986和wo 2012/054795，其每一个都通过引用并入本文)。
[0081]
在图1a中示出了基本的信号产生复合物(sgc)(参见us 2009/0081688)。一对靶标探针(此处描述为一对“z”)与标记为“靶标”的互补分子序列杂交。每个靶标探针均含有与预扩增子分子(pa)互补的额外的序列，其必须同时与靶标探针对的两个成员杂交才能稳定结合。预扩增子分子由两个结构域组成：具有与每个靶标探针杂交的区域的一个结构域，和含有一系列核苷酸序列重复的一个结构域，每个都与扩增子分子(amp)上的序列互补。该序列的多个重复的存在允许多个扩增子分子与一个预扩增子杂交，这增加了整体信号放大。每个扩增子分子由两个结构域组成，具有与预扩增子杂交的一个区域的一个结构域，和含有一系列核苷酸序列重复的一个结构域，每个都与标记探针(lp)上的序列互补，从而允许多个标记探针与每个扩增子分子杂交，进一步增加了总信号放大。每个标记探针均含有两个组分。一个组分由与扩增子分子上的重复序列互补的核苷酸序列组成，以允许标记探针杂交。此核苷酸序列与第二组分相连，该组分可以是任何信号产生实体，包括用于直接可视化的荧光或发色标记，可直接检测的金属同位素，或能够促进化学反应产生荧光、发色或其他可检测信号的酶或其他化学物质。在图1a中，标记探针描绘为代表核酸组分的线和代表
信号生成组分的星号。从靶标探针到标记探针组装在一起称为信号产生复合物(sgc)。
[0082]
图1b示出了通过添加扩增分子层(在这种情况下是预-预扩增子分子(ppa，以红色显示))而扩大的sgc。ppa结合至一个结构域中的两个靶标探针和另一结构域中的多个pa。
[0083]
图1c示出了在预扩增子水平上使用协同杂交的不同的sgc结构(参见us 2017/0101672)。与图1a和1b中形成的sgc相似，一对靶标探针与靶标分子序列杂交。每个靶标探针均含有与独特的预-预扩增子分子(ppa-1；ppa-2)互补的额外的序列。两个独立分子的使用为需要协同杂交建立了基础。每个预-预扩增子分子由两个结构域组成：具有与靶标探针之一杂交的一个区域的一个结构域，和含有一系列核苷酸序列重复的一个结构域，每个都含有与预扩增子(pa)内的序列互补的序列，以及促进ppa-pa结合效率的间隔子序列。为了稳定地附着在不断增长的sgc上，每个pa必须同时与两个ppa分子杂交。每个预扩增子分子由两个结构域组成，含有与两个预-预扩增子互补的序列以允许杂交的一个结构域，和含有一系列核苷酸序列重复(每个与扩增子分子(amp)上的序列互补)的一个结构域。扩增子杂交序列的多个重复允许多个扩增子分子与每个预扩增子杂交，从而进一步提高信号放大。为了简化说明，显示了与一个预扩增子分子杂交的扩增子分子。每个扩增子分子含有一系列与标记探针(lp)内的序列互补的核苷酸序列重复，从而允许若干标记探针与每个扩增子分子杂交。每个标记探针均含有一个信号产生元件以提供信号检测。
[0084]
如本文所用，术语“标记探针”是指直接或间接，通常间接地与靶标分子结合并允许检测靶标的实体。标记探针(或“lp”)含有核酸结合部分，典型地为单链多核苷酸或寡核苷酸，其包含直接或间接提供可检测信号的一种或多种标记。标记可以共价附于多核苷酸，或者多核苷酸可以配置为与标记结合。例如，生物素化多核苷酸可以结合链霉抗生物素蛋白缔合的标记。标记探针可以例如直接与靶标核酸杂交。通常，标记探针可以与核酸杂交，该核酸继而与靶标核酸杂交或者同与靶标核酸杂交的一个或多个其他核酸杂交。因此，标记探针可以包含与靶标核酸的多核苷酸序列(特别是一部分)互补的多核苷酸序列。或者，如本文所述，标记探针可以包含至少一个与在扩增子、预扩增子、预-预扩增子、信号产生复合物(sgc)等中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。通常，在本发明的实施方案中，标记探针与扩增子结合。如本文所用，包含酶标记的标记探针是指包含核酸结合部分(如寡核苷酸)和偶联至核酸结合部分的酶的标记探针。如本文所公开的，酶与核酸结合部分的偶联可以是共价的或通过高亲和力的结合相互作用，例如生物素/抗生物素蛋白或其他类似的高亲和力的结合分子。
[0085]
如本文所用，“靶标探针”是能够与靶标核酸杂交并捕获标记探针或信号产生复合物(sgc)组分(例如，扩增子、预扩增子或预-预扩增子)或者将其与该靶标核酸结合的多核苷酸。靶标探针可以直接与标记探针杂交，或者它可以与一个或多个核酸杂交，所述一个或多个核酸继而与标记探针杂交；例如，靶标探针可以与sgc中的扩增子、预扩增子或预-预扩增子杂交。因此，靶标探针包括与靶标核酸的多核苷酸序列互补的第一多核苷酸序列和与标记探针、扩增子、预扩增子、预-预扩增子等的多核苷酸序列互补的第二多核苷酸序列。通常，在本发明的实施方案中，靶标探针与图1a中的预扩增子结合，或与图1b和1c中的预-预扩增子结合。靶标探针通常是单链的，因此互补序列可用于与相应的靶标核酸、标记探针、扩增子、预扩增子或预-预扩增子杂交。
[0086]
如本文所用，“扩增子”是能够与多个标记探针杂交的分子，通常是多核苷酸。通
常，该扩增子与多个相同的标记探针杂交。该扩增子还可以与靶标核酸，与一对靶标探针中的至少一个靶标探针，与一对靶标探针中的两个靶标探针，或与结合至靶标探针的核酸(例如，预扩增子或预-预扩增子)杂交。例如，扩增子可以与至少一个靶标探针和多个标记探针，或者与预扩增子和多个标记探针杂交。通常，在本发明的实施方案中，扩增子可以与预扩增子杂交。扩增子可以是例如线性、叉状、梳状或分支核酸。如本文所述，对于所有多核苷酸，扩增子可以包括经修饰的核苷酸和/或非标准核苷酸间连接以及标准脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或磷酸二酯键。合适的扩增子描述于例如美国专利号5,635,352、5,124,246、5,710,264、5,849,481和7,709,198以及美国公布2008/0038725和2009/0081688中，其每一个均通过引用并入本文。通常，在本发明的实施方案中，所述扩增子与预扩增子和标记探针结合(参见图1)。
[0087]
如本文所用，“预扩增子”是充当一个或多个靶标探针和一个或多个扩增子之间的中间结合组分的分子，通常是多核苷酸。通常，预扩增子同时与一个或多个靶标探针以及多个扩增子杂交。示例性的预扩增子描述于例如美国专利号5,635,352、5,681,697和7,709,198以及美国公布2008/0038725、2009/0081688和2017/0101672中，其每一个均通过引用并入本文。通常，在本发明的实施方案中，预扩增子与靶标探针对的两个成员(参见图1a)，与可以结合靶标探针对的预-预扩增子(参见图1b)，或与可以结合靶标探针对的一对预-预扩增子的两个成员(参见图1c)结合。预扩增还与扩增子结合(参见图1)。
[0088]
如本文所用，“预-预扩增子”是充当一个或多个靶标探针和一个或多个预扩增子之间的中间结合组分的分子，通常是多核苷酸。通常，预-预扩增子同时与一个或多个靶标探针以及多个预扩增子杂交。示例性的预-预扩增子描述于例如美国专利号2017/0101672中，其通过引用并入本文。通常，在本发明的实施方案中，预-预扩增子与靶标探针对(参见图1b)或靶标探针对的成员(参见图1c)和预扩增子(参见图1b和1c)结合。
[0089]
如本文所述，无论是否使用图1a、1b或1c中描绘的构造，sgc的组分被设计成使得需要两个靶标探针的结合以构建sgc。在图1a和1b的构造的情况下，预扩增子(图1a)(或图1b中的预-预扩增子)必须与靶标探针对的两个成员结合才能发生稳定结合。这是通过设计靶标探针和预扩增子(或预-预扩增子)之间的结合位点，从而使两个靶标探针与预扩增子(或预-预扩增子)的结合比单个靶标探针与预扩增子(或预-预扩增子)的结合具有更高的解链温度(tm)来实现的，并且其中单个靶标探针的结合在测定条件下不稳定。先前该设计已描述于例如美国专利号7,709,198，美国公开2008/0038725和2009/0081688，wo 2007/001986wo 2007/002006，wang et al.,同上,2012,anderson et al.,同上,2016中。通过以这种方式构造sgc组分，当两个靶标探针都结合到靶标核酸和预扩增子(或预-预扩增子)时，即可实现sgc的组装，从而由于最小化了sgc组装为假阳性，因此减少了背景噪声。
[0090]
在图1c的构造的情况下，通过要求预扩增子与两个预-预扩增子结合，实现仅在靶标探针对的两个成员都与靶标核酸结合时才形成sgc的要求，两个预-预扩增子继而分别与靶标探针对的两个成员结合。该要求是通过设计预-预扩增子和预扩增子之间的结合位点，从而使两个预-预扩增子与预扩增子之间的结合的解链温度(tm)比单独的任一预-预扩增子的解链温度更高来实现的，并且其中一个预-预扩增子与预扩增子的结合在测定条件下是不稳定的。先前该设计已描述于例如us 20170101672，wo 2017/066211和baker et al.,同上,2017中。除非将预扩增子与两个预-预扩增子结合，否则扩增子和标记探针不能组装
成与靶标核酸结合的sgc，从而由于最小化了sgc组装为假阳性，因此减少了背景噪声。
[0091]
也可以通过增加扩增分子的长度来增加sgc的大小，从而提高其有效放大能力。但是，扩增分子越长，当它渗透到样品中时就越容易受到非特异性捕获的影响。被捕获的或非特异性杂交的分子可以播种(seed)非特异性信号的产生，因为随后的扩增分子和标记探针在不存在靶标核酸序列的情况下杂交以形成功能性sgc。如本文所公开，为了限制此类背景产生，扩增分子的多个较短的区段可以彼此杂交以形成延长的序列，而无需使用较长的分子。该方法可以应用于放大过程的任何水平。
[0092]
在使用放大组分的延伸的本发明方法的一个实施方案中，使用三层放大系统，其中延伸包含预-预扩增子(ppa)的第一扩增层(图2a)。单个靶标探针对与靶标序列杂交，该靶标序列可以是短靶标核酸，然后将预-预扩增子(ppa)分子与每个单独的靶标探针对杂交。如图2a中所描绘，与靶标探针杂交的预-预扩增子在本文称为碱基ppa。在这个阶段，在添加预扩增子分子之前，通过多个延长分子(在本文中称为延伸ppa)的杂交来延伸每个预-预扩增子序列，其在延伸碱基预-预扩增子时添加了额外的杂交结构域，从而延长了ppa层。如上所述，在完成预-预扩增子层之后，预扩增子分子协同杂交至碱基和延伸预-预扩增子两者上的结合序列，然后进行扩增子、标记探针的杂交以及信号的产生。
[0093]
在使用放大组分的延伸的本发明方法的第二实施方案中，使用三层放大系统，其中延伸包含预扩增子(pa)的第二扩增层(图2b)。单个探针对与短靶标序列杂交，然后将预-预扩增子分子与每个单独的探针对杂交。在添加第二扩增层的过程中，预扩增子分子协同杂交至预-预扩增子。如图2b中所描绘，结合ppa的预扩增子在本文中称为碱基pa。通过多个延长分子(在本文中称为延伸pa)的杂交来延伸碱基pa，其将额外的杂交结构域添加至碱基预扩增子，从而增加了预扩增子层的长度。如上所述，完成延长预扩增子层之后，进行扩增子、标记探针的杂交以及信号的产生。
[0094]
在使用放大组分的延伸的本发明的方法的第三实施方案中，使用三层放大系统，其中延伸包含预扩增子(amp)的第三扩增层(图2c)。在该实施方案中，单个探针对与靶标序列，例如短靶标核酸杂交。这之后预-预扩增子分子与每个单独的探针对杂交，然后进行预扩增子分子与预-预扩增子的协同杂交。在添加第三扩增层的过程中，扩增子分子与预扩增子杂交以形成碱基扩增子(碱基amp)。通过多个扩增子延伸分子(在本文中称为延伸amp)的杂交来延长碱基amp，当它们延长了扩增子层时，其增加了额外的标记探针杂交结构域。如上所述，在扩增子层完成之后是标记探针的杂交和信号的产生。
[0095]
如图2中所示和如上所述，可以通过增加sgc的放大能力来改善信号检测。这可以通过增加一层或多层扩增分子上的杂交结构域的数量来实现，从而使总数更多的标记探针可以在sgc内杂交。但是，增加扩增分子的总长度会增加样品内这些分子非特异性捕获的倾向，其在不存在核酸靶标的情况下可以产生错误信号。如上所述，为了在不使用易于捕获的较长分子的情况下增加杂交结构域的数量，可以通过“拼接(tiling)”多个短分子以产生累积更高数量的杂交结构域来延伸任何放大步骤。
[0096]
在图2中，靶标探针对(z)与靶标序列杂交，然后将一个预-预扩增子分子(ppa)与每个靶标探针杂交。预扩增子分子(pa)与两个ppa协同杂交，其中杂交pa的总数通过ppa长度延伸而增加(例如图2a)。扩增子分子(amp)与所有结合的pa杂交。在图2中，为了简化图示，将amp描绘为与一个pa杂交，但是应当理解，amp可以与sgc中的所有pa分子杂交。标记探
针(lp)与每个amp内的杂交序列重复序列结合，从而形成一个完整的sgc。在图2a中，通过拼接多个较短的分子以构建具有更多的用于预扩增子结合的杂交结构域的最终的，延伸的预-预扩增子(碱基ppa加上延伸ppa)来增加sgc的放大能力。在图2b中，通过拼接多个较短的分子以构建具有更多扩增子杂交结构域的预扩增子(碱基pa加上延伸pa)来增加sgc的放大能力。在图2c中，通过拼接多个较短的分子以构建具有更多用于标记探针杂交的结构域的扩增子(碱基amp加上延伸amp)来增加sgc的放大能力。
[0097]
扩增分子的延伸涉及多个扩增分子区段(碱基ppa/pa/amp加上延伸ppa/pa/amp)的连接以构建具有更多杂交结构域的更长序列(在本文中也称为结合区段重复(bsr))，从而允许更大量的分子在下一个扩增层或级中杂交并构建更大的sgc(图3a)。可以使用多种方法将碱基扩增分子附接至延伸扩增分子。例如，碱基和延伸扩增分子可以彼此直接连接，使用每个扩增分子末端的互补序列以允许彼此直接杂交(参见图3b)。可选地，在另一实施方案中，较小的桥接分子(在本文中称为桥或桥分子)可以用于与碱基和延伸扩增分子两者或与相邻的延伸扩增分子杂交，充当连接两个扩增分子的分子“带(tape)”。该桥接分子可以直接与每个扩增分子(碱基和延伸ppa/pa/amp)杂交，以连接两个区段(图3c)。在另一个替代实施方案中，可以将桥接分子设计为利用协同杂交分别与两种扩增分子，特别是ppa杂交(图3d)。此类构造可以为组装的sgc提供进一步的结构稳定性。
[0098]
图3中描述了扩增分子延伸的示例性实施方案。在图3a中，示出了使用扩增分子延伸的sgc的示意图。一对靶标探针(z)与靶标序列杂交，并且各自与预-预扩增子分子(ppa)(本文称为碱基ppa)结合。通过将一个或多个其他ppa分子(延伸ppa)同与靶标探针杂交的每个碱基ppa杂交，可以延伸总ppa序列的长度。两个ppa延伸分子与两个碱基ppa的附接在图3中用虚线椭圆突出显示。预扩增子分子(pa)与每个碱基和延伸ppa上的结合区段重复(bsr)杂交，从而增加了sgc内的信号放大。扩增子分子(amp)与每个pa上的结合序列重复(bsr)杂交。为了简单说明，所示的amp分子每ppa延伸层仅与一个pa杂交，但是应当理解，amp可以与任何和所有pa结合。标记探针(lp)与每个amp分子内的互补结合区段重复结合，从而形成一个完整的sgc。为了更仔细地观察扩增分子延伸的示例性实施方案，图3b-d示出了图3a中示出的并且由虚线框突出显示的sgc的一部分的特写视图。
[0099]
在一个实施方案中，如图3b中所示，拼接的扩增延伸分子经由每个分子末端的互补核苷酸序列直接杂交(在图3b中描绘为延伸的ppa)。在另一实施方案中，如图3c中所示，可以使用与碱基和延伸扩增分子两者或两个相邻的延伸扩增分子退火的桥分子(“桥(bridge)”)来连接拼接的分子。在第三实施方案中，如图3d种所示，使用与两个扩增分子退火的桥连接并稳定拼接的扩增分子对。每个实施方案既可以用于涉及平行使用不同分子的放大步骤(如图3中所描绘)，例如用作协同杂交的基础，又可以用于延伸单独起作用的扩增分子(例如如图1和1b中所描绘)。
[0100]
扩增分子延伸的用途在实施例1中描述，并在图7中显示。如实施例1中所述，在福尔马林固定石蜡包埋的培养的hela细胞中，使用单对靶标探针检测人polr2a mrna转录物的一小区域。使用三层(三级)放大系统放大信号，并通过直接杂交延伸预扩增子序列(如图3b中所描绘)。在图7a中所示的实验中，通过将彼此直接退火将两个预-预扩增子分子结合在一起(碱基ppa加延伸ppa)，从而增加了可用于预扩增子杂交的结合区段重复(bsr)的数量。在图7b中所示的实验中，通过将彼此直接退火将三个预-预扩增子分子结合在一起(碱
基ppa加两个延伸ppa)，从而进一步增加了可用于预扩增子杂交的结合区段重复(bsr)的数量，以及因此由每个sgc产生的放大能力和总点大小。
[0101]
增加信号放大程度允许更好地检测sgc信号。然而，这也增加了通过扩增分子的捕获或非特异性杂交可能产生非特异性信号的风险。如前所述和图1c中所示，可以通过使用协同杂交来增加信号检测的特异性。必须与多个分子协同杂交以成功附接到生长中的sgc的扩增分子可能会经历较低的总体杂交效率，因为它们只有在与多个分子间分摊(split)的完整杂交序列关联时才能稳定地结合。通过在每个碱基扩增分子上的结合区段重复之间引入间隔子序列以允许更大的结合可及性，可以改善杂交效率(参见图1c，其描绘了用于结合多个pa的结合区段重复序列之间的间隔子)。可以利用先前未占据的“间隔子”序列，利用每个结合区段重复之间的额外的核苷酸长度，以相反的结合定向添加第二个不同的、协同杂交的扩增分子。此类构造在图4中描绘。通过以对称方式协同杂交，两个结合扩增分子有效地紧密拴系另外两个扩增分子，从而提供了稳定性并促进了任何进一步的杂交。对称协同杂交可以用于放大过程或扩增分子级的任何步骤，包括扩增分子与靶标探针的杂交，扩增分子的延伸，和/或新的扩增分子层或级的添加(图4)。
[0102]
如前所述，可以用于增加信号特异性的一种方法要求在同一扩增层内多个不同分子的协同杂交，以便成功产生最终的可检测信号(us 2017/0101672)。当使用多个不同的分子时，可以通过在不同分子之间划分下一级杂交分子的杂交序列(结合区段重复)，使两个分子对于进一步的sgc组装都是必需的。由于成功附接下一级的扩增分子需要与多个不同的分子杂交，因此协同杂交的扩增分子可能经历较低的总体杂交效率，因为它们只有在与多个碱基分子中分摊的完整杂交序列关联时才能稳定地结合。如上所述，可以通过在每个部分的杂交序列重复之间引入间隔子序列以允许更大的结合可及性来改善杂交效率。间隔子序列的这种使用允许利用先前未结合的“间隔子”区域以相反的定向添加第二个不同的、协同杂交的扩增分子。通过这种方式，两个不同的扩增分子可以以对称方式协同杂交，从而通过有效地紧密拴系扩增分子来提供稳定性并改善与扩增分子上其他结合区段重复的杂交效率(参见图4)。
[0103]
图4显示了对称协同杂交的三种可能用途。如在图4中更详细地描绘的，两个靶标探针(“z1”和“z2”)与靶标序列杂交。两个预-预扩增子分子(ppa-1和ppa-2)每个都使用对称协同杂交与两个靶标探针杂交(在图4的下部虚线圆圈中描绘)。每个预-预扩增子分子通过含有相同预扩增子结合区段重复的其他预-预扩增子分子(延伸ppa)的附接而延伸(ppa-1e和ppa-2e)(在图4中的中间虚线圆中描绘)。这些延伸扩增分子各自使用对称协同杂交与ppa-1和ppa-2杂交。如图4中所示，可以在sgc形成的任何水平上使用对称协同杂交，包括将扩增分子附接到靶标探针(图4，下部虚线圆圈)，延伸平行扩增分子(图4，中间虚线圆圈)，和/或附接其他扩增分子级或层(图4，上部的虚线圆圈)。
[0104]
在一个实施方案中，可以使用对称协同杂交来增加sgc的密度和放大能力(图5)。协同杂交的使用通过使扩增分子同时与较低级的扩增分子杂交，从而允许其仅稳定地附接至生长的sgc，从而提高了信号放大的特异性。但是，同时杂交至两个扩增分子的要求也可能降低杂交效率。如上所述，在每个部分杂交序列之间包括间隔子序列可以通过允许对较低级扩增分子的更大可及性来提高杂交效率。使用对称协同杂交，可以在“间隔子”核苷酸序列内杂交其他扩增分子，从而使每个重复的相同长度的扩增分子的放大能力加倍(参见
图5)。该实施方案通过将扩增分子紧密拴系在一起，在允许增加sgc的放大能力的同时，提供了进一步的稳定性，并提高了杂交效率。
[0105]
图5显示了用于增加sgc的密度的构造。具有最大放大能力的sgc的形成取决于扩增分子的有效杂交和组装，使得sgc内的所有结合区段重复都可以被完全占据。单个sgc内最大可能数量的扩增分子的杂交允许添加最可能量的标记探针，以产生最稳健的信号检测。如上所述，在结合区段重复之间引入间隔子序列可以促进扩增子结合，以允许更大的杂交结构域占据。但是，这会导致相当长的未占据的“浪费”序列。为了在使用间隔子序列时提高sgc的总体密度，可以通过使用以对称方式协同杂交的两个不同的扩增分子将单个sgc内的放大量增加加倍。除了增加sgc的理论放大能力外，对称协同杂交还可以通过在新层中每个扩增分子的杂交过程中使扩增分子更靠近在一起，稳定生长的sgc和促进新的扩增层或级中的进一步协同杂交事件以有助于建立具有更高效率的完整sgc。
[0106]
如图5中所示，两个靶标探针(“z”)与靶标序列杂交。这些靶标探针在靶标杂交和ppa杂交区域均具有不同的核苷酸序列。不同的ppa-杂交序列允许两个不同序列的独立ppa分子(ppa-1和ppa-2)分别与一个相应的靶标探针唯一地杂交。每个ppa均含有用于附接预扩增子层的杂交序列(结合区段重复)。两个预扩增子pa-1和pa-2分别由两个结构域组成：含有ppa-1和ppa-2两个杂交序列的一个结构域，和含有多个用于扩增子分子(amp)杂交的结合区段重复的一个结构域。pa-1和pa-2内的ppa-1和ppa-2杂交序列是截然不同的，且定向使得每个pa-1与靶标探针结合位点附近的ppa-1杂交，且ppa-2邻近ppa-1并在其靶标结合位点远端杂交。pa-2与靶标探针结合位点近端的ppa-2杂交，且ppa-1邻近ppa-2并在其靶标结合位点远端杂交。这种对称协同杂交“交叉”允许相同的核苷酸长度(包括结合序列和间隔子序列两者)通过两个预扩增子分子(而不是一个)进行协同杂交。结果，两倍的扩增子分子(amp)，以及由此两倍的标记探针(lp，用具有星形的线表示)可以在sgc内杂交，从而提高了sgc的密度和整体放大能力。为了简化说明，描绘扩增子分子(amp)仅与一个pa-1和一个pa-2杂交，但是应理解，扩增子分子可以与sgc内的任何和所有的pa-1和pa-2杂交。
[0107]
图8中展示了对称协同杂交的使用。在图8中所示的实验中，在福尔马林固定石蜡包埋的培养的hela细胞中，单对靶标探针检测人polr2a mrna转录物的一小区域，并使用三层放大系统放大信号。在此实施例中，在放大的第二层采用对称协同杂交，使用两个不同的预-预扩增子分子建立两个对称的协同杂交位点，从而允许两个不同的预扩增子以平衡的定向结合，如图5中所描绘。
[0108]
本文所述的方法可以用于在多重分析中检测多个靶标核酸序列。多个靶标可以在相同核酸分子内或在不同的核酸分子上，例如不同的mrna转录物。在图6中示出了用于多个靶标检测的目的，这些方法的组合使用的一个实施方案。在该实施方案中，用单个不同的靶标探针对同时检测三个短核酸靶标序列以检测每个靶标。每个靶标探针对与一组独特的预-预扩增子分子杂交，每个包含用于不同的预扩增子分子的不同的杂交结构域序列(结合区段重复)。预扩增子与两个预-预扩增子分子协同杂交。当检测短靶标核酸时，此类构造可以用于增加使用单个探针对产生的信号的特异性。独特的扩增子与用于每种不同靶标核酸的预扩增子分子杂交，然后与每种sgc的独特标记探针杂交。用于每个靶标的sgc内的标记探针均包含不同的可检测元件，以确保可以检测和区分所有三个靶标核酸序列。
[0109]
本文所述的方法可以应用于同时检测同一样品内的多个不同的靶标核酸序列。例
如，图6说明了在同一样品中检测三个不同的核酸靶标，每个靶标使用一种放大方法，该方法涉及使用两个成对的平行预-预扩增子，其分别通过直接退火以延伸预扩增子对称协同杂交结构域的数量而拼接。两个不同的预扩增子与每个预-预扩增子分子对称杂交，从而增加了每个最终sgc内杂交的扩增子数量，随后增加了标记探针的数量。对于每个不同的核酸靶标，使用具有独特核酸序列的靶标探针、扩增分子和标记探针来防止交叉检测，并且在每个靶标的sgc内使用的标记探针产生不同的可检测信号，从而允许多个靶标核酸是可区分的。
[0110]
在图6中，用三个特异性靶标探针对(“zz”，靶标1；靶标2；靶标3)分别检测了三个独立的核酸靶标。两个不同的ppa与每个靶标探针对杂交，每个ppa与两个靶标探针之一杂交(对于靶标1：ppa-1和ppa-a；对于靶标2：ppa-2和ppa-b；对于靶标3：ppa-3和ppa-c)。每个ppa对都含有不同的pa结合序列，以及一个延伸杂交序列，以允许附接包含其他pa结合序列重复的第二ppa层。在每个生长的sgc上，两个不同的pa与每个ppa对协同杂交(pa-1和pa-a，每个与ppa-1和ppa-a两者协同杂交；pa-2和pa-b，每个与ppa-2和ppa-b两者协同杂交；pa-3和pa-c，每个与ppa-3和ppa-c两者协同杂交)，从而允许增加信号特异性和放大每个靶标。给定“树”(即sgc)的两个pa包含不同的ppa-杂交序列，但具有相同的amp-杂交序列重复(结合区段重复)，从而允许单一设计的amp分子与两个pa杂交(amp-1与pa-1和pa-a两者杂交；amp-2与pa-2和pa-b两者杂交；amp-3与pa-3和pa-c两者杂交)。包括用于与特定amp杂交的核酸序列的不同标记探针与生长的sgc杂交(lp-1与amp-1杂交；lp-2与amp-2杂交；lp-3与amp-3杂交)。除了核酸杂交结构域，每个标记探针包含独特的信号产生元件，从而允许从每个靶标产生的独立的sgc是可区分的。
[0111]
图9中显示了用于检测多个靶标的概括方法的组合使用。在图9a中所示的实验中，在福尔马林固定的石蜡包埋的培养的hela细胞中，一对靶标探针检测到第一靶标，即人polr2a mrna转录物的一小区域(染成红色)，而另一对探针检测到第二靶标，即人ppib mrna转录物的一小区域(染成绿色)。使用具有直接杂交允许扩增子分子延伸的多层放大系统放大代表每个靶标的信号(参见图6)。在图9b中，使用相同的信号放大方法检测福尔马林固定的石蜡包埋的人结肠癌肿瘤中的人polr2a mrna转录物(染成红色)和人ppib mrna转录物(染成绿色)。
[0112]
在一个实施方案中，本发明包括包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其包含如图2-6的任意一个或多个中所描绘的靶标探针、预-预扩增子、预扩增子、扩增子和/或标记探针及其构造的任意组合，和/或与靶标核酸的检测兼容。
[0113]
在一个实施方案中，本发明提供包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二碱基ppa的碱基ppa对，其中所述第一碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，和(iii)包含第一延伸预-预扩增子(延伸ppa)的结合位点的区段；并且其中所述第二碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与
所述第二tp的所述第二碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个第二预扩增子结合区段重复(第二pa-bsr)的区段，和(iii)包含第二延伸ppa的结合位点的区段；其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列，并且其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(c)包含所述第一和第二延伸ppa的延伸ppa组，其中所述第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；并且其中所述第二延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；(d)多个预扩增子(pa)，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(e)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc(参见图2a)。
[0114]
在一个实施方案中，所述延伸ppa组包含至少一个额外的第一延伸ppa和至少一个额外的第二延伸ppa，其中所述额外的第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第一延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；其中所述额外的第二延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第二延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；并且其中所述至少一个额外的第一ppa任选地包括包含所述第一延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)，并且所述至少一个额外的第二ppa任选地包括包含所述第二延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序。
[0115]
在另一实施方案中，所述第一碱基ppa和所述第一延伸ppa之间和/或所述延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa和所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸ppa之间的结合位点包含互补序列(参见图2a和3b)。
[0116]
在另一实施方案中，所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系(参见图2a和3c)。
[0117]
在另一实施方案中，所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸ppa拴系至所述第一延伸ppa，并且将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第
二延伸ppa(参见图2a和3d)。
[0118]
在另一实施方案中，所述第一碱基ppa和/或所述第一延伸ppa包括包含所述第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，其中所述ppa的区段按(i)、(ii)、(iv)、(iii)的顺序(参见图2a和图4，中间圆圈)。
[0119]
在另一实施方案中，本发明提供包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的ppa对，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)多个碱基预扩增子(碱基pa)，其中所述碱基pa包括包含四个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段，和(iv)与延伸预扩增子(延伸pa)结合的区段，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)、(iv)的顺序；(d)多个延伸pa，其中所述延伸pa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点结合的区段，和(ii)多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)；并且其中所述延伸pa任选地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(e)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc(参见图2b)。
[0120]
在一个实施方案中，所述碱基pa和所述延伸pa之间的结合位点包含互补序列(图2b和3b)。在另一实施方案中，所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点和/或所述延伸pa的所述延伸pa结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa拴系至所述碱基pa和/或将所述延伸pa彼此拴系(参见图2b和图3c)。
[0121]
在另一实施方案中，本发明提供包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的ppa对，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第
二pa-bsr是不同的序列；(c)多个预扩增子(pa)，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(d)多个碱基扩增子(碱基amp)，其中所述碱基amp包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段，和(iii)与延伸扩增子(延伸amp)结合的区段，按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(e)多个延伸amp，其中所述延伸amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点结合的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；并且其中所述延伸amp任选地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc(参见图2c)。
[0122]
在另一实施方案中，所述碱基amp和所述延伸amp之间的结合位点包含互补序列(参见图2c和图3b)。在另一实施方案中，所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点和/或所述延伸amp的所述延伸amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸amp拴系至所述碱基amp和/或将所述延伸amp彼此拴系(参见图2c和图3c)。
[0123]
在上述组合物的一个实施方案中，(i)所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；并且其中所述区段按(i)、(iii)、(ii)的顺序；和(ii)所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)，其中所述区段按(iv)、(i)、(ii)、(iii)的顺序；或所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述区段按(iii)、(i)、(ii)的顺序(图4a，下部圆圈)。
[0124]
在另一实施方案中，本发明提供包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的ppa对，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，其中所述第一pa-bsr包含两个区段，(ia)包含第一预扩增子(第一pa)的结合位点的区段和(ib)包含第二pa的结合位点的区段，其中所述第一ppa的区段按(i)、(ia)、(ib)的顺序；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第二pa-bsr包含两个区段，(iia)包含所述第二pa的结合位点的区段和(iib)包含所述第一pa的结合位点的区段，其中所述第二ppa的区段按(i)、(iia)、(iib)的顺序；(c)多个所述第一pa和多个所述第二pa，其中所述第一pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第二
pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第一pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；并且其中所述第二pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(d)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(e)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc(参见图5)。
[0125]
在另一实施方案中，所述ppa包含碱基ppa和延伸ppa(参见图5和图2a)。在另一实施方案中，所述pa包含碱基pa和延伸pa(参见图5和图2b)。在另一实施方案中，所述amp包含碱基amp和延伸amp(参见图5和图2c)。
[0126]
在另一实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述第一碱基ppa和所述第一延伸ppa之间和/或所述第一延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa和所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸ppa之间的结合位点包含互补序列；和/或其中所述碱基pa和延伸pa之间的结合位点，和或所述碱基amp和延伸amp之间的结合位点包含互补序列(参见图5和图3b)。
[0127]
在另一实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系；或其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点和/或所述延伸pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa或amp拴系至所述碱基pa或amp和/或将所述延伸pa或amp彼此拴系(参见图5和图3c)。
[0128]
在另一实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸ppa拴系至所述第一延伸ppa，并且将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第二延伸ppa(参见图5和图3d)。
[0129]
在另一实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述第一碱基ppa和/或所述第一延伸ppa包括包含所述第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点第四区段(iv)，其中所述ppa的区段按(i)、(ii)、(iv)、(iii)的顺序(参见图2a和图4，
中间圆圈)。
[0130]
在另一实施方案中，(i)其中所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；并且其中所述区段按(i)、(iii)、(ii)的顺序；和(ii)其中所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)，其中所述区段按(iv)、(i)、(ii)、(iii)的顺序；或其中所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述区段按(iii)、(i)、(ii)的顺序(参见图4a，下部圆圈)。
[0131]
在另一实施方案中，本发明提供如上所述或本文公开任何组合物，所述组合物进一步包含第二sgc，其中所述第二sgc包含与所述第一sgc的靶标不同的第二靶标，其中所述sgc独立于所述第一sgc的构造包含上述任一项的sgc的sgc构造，并且其中所述第二sgc与所述第一sgc是可区分的(参见图6)。
[0132]
在另一实施方案中，所述组合物进一步包含第三sgc，其中所述第三sgc包含与所述第一靶标和所述第二靶标的靶标不同的第三靶标，其中所述sgc独立于所述第一sgc和/或所述第二sgc的构造包含上述或本文公开的任一项sgc的sgc构造，并且其中所述第三sgc与所述第一和第二sgc是可区分的。
[0133]
在另一实施方案中，本发明的组合物进一步包含与所述tp对结合的靶标核酸。在另一实施方案中，本发明的组合物进一步包含细胞。
[0134]
在另一实施方案中，本发明提供检测靶标核酸的方法，其包括使样品核酸与用于组装上述或本文公开的sgc的组分接触，包括在图2-6的任一个中，将sgc组装在所述靶标核酸上，并检测所述靶标核酸。在一个实施方案中，所述核酸在细胞中。在一个实施方案中，所述细胞在原位测定法中分析。在一个实施方案中，所述细胞在载玻片上。
[0135]
应当理解，本发明的组合物的构造可以以任何期望的顺序，只要组分可以结合以提供用于检测靶标核酸的sgc。此外，相对于核酸分子的5
’
或3
’
末端，sgc的组分的结合区段的构造可以以任何期望的顺序排列，只要结合区段提供了sgc的组装以用于检测靶标核酸。还应理解，当将区段的定向以(i)、(ii)、(iii)的顺序提及而不涉及核酸分子的5
’
或3
’
末端时，应理解为这样的定向，即以5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)或(iii)、(ii)、(i)的顺序。另外应理解，如本文所述，其他定向也是可能的。此外，当使用两个相似的组分时(例如，第一和第二tp，第一和第二碱基ppa，第一和第二延伸ppa等)，应理解的是，两个相似的组分可以具有独立选择的区段顺序，例如，第一碱基ppa按照(i)、(ii)、(iii)的顺序，而第二碱基ppa按照(ii)、(iii)、(i)的顺序等。
[0136]
在一个实施方案中，本发明提供了包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二碱基ppa的碱基ppa对，其中所述第一碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个
第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，和(iii)包含第一延伸预-预扩增子(延伸ppa)的结合位点的区段；并且其中所述第二碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个第二预扩增子结合区段重复(第二pa-bsr)的区段，和(iii)包含第二延伸ppa的结合位点的区段；其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)包含所述第一和第二延伸ppa的延伸ppa组，其中所述第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；并且其中所述第二延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；(d)多个预扩增子(pa)，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(e)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc(参见图2a)。
[0137]
在一些实施方案中，所述第一和第二碱基ppa的区段按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)；或(iii)、(ii)、(i)的顺序。在一些实施方案中，所述pa的区段按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)；或(iii)、(ii)、(i)的顺序。
[0138]
在一个实施方案中，所述延伸ppa组包含至少一个额外的第一延伸ppa和至少一个额外的第二延伸ppa，其中所述额外的第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第一延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；其中所述额外的第二延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第二延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；并且其中所述至少一个额外的第一ppa任选地包括包含所述第一延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)，并且所述至少一个额外的第二ppa任选地包括包含所述第二延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)。
[0139]
在一些实施方案中，所述第一ppa的区段按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)；或(iii)、(ii)、(i)的顺序。
[0140]
在另一实施方案中，所述第一碱基ppa和所述第一延伸ppa之间和/或所述延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa和所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸ppa之间的结合位点包含互补序列(参见图2a和3b)。
[0141]
在另一实施方案中，所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系(参见图2a和3c)。
[0142]
在另一实施方案中，所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第
一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸ppa拴系至所述第一延伸ppa，并且将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第二延伸ppa(参见图2a和3d)。
[0143]
在另一实施方案中，所述第一碱基ppa和/或所述第一延伸ppa包括包含所述第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点第四区段(iv)(参见图2a和图4中间圆圈)。
[0144]
在一些实施方案中，所述第一和第二碱基ppa和/或第一和第二延伸ppa的区段按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)、(iv)；(i)、(ii)、(iv)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)、(iv)；(i)、(iii)、(iv)、(ii)；(i)、(iv)、(ii)、(iii)；(i)、(iv)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)、(iv)；(ii)、(i)、(iv)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)、(iv)；(ii)、(iii)、(iv)、(i)；(ii)、(iv)、(i)、(iii)；(ii)、(iv)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)、(iv)；(iii)、(i)、(iv)、(ii)；(iii)、(ii)、(i)、(iv)；(iii)、(ii)、(iv)(i)；(iii)、(iv)、(i)、(ii)；(iii)、(iv)、(ii)、(i)；(iv)、(i)、(ii)、(iii)；(iv)、(i)、(iii)、(ii)；(iv)、(ii)、(i)、(iii)；(iv)、(ii)、(iii)、(i)；(iv)、(iii)、(i)、(ii)；或(iv)、(iii)、(ii)、(i)的顺序。
[0145]
在另一实施方案中，本发明提供包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的ppa对，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)多个碱基预扩增子(碱基pa)，其中所述碱基pa包括包含四个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段，和(iv)与延伸预扩增子(延伸pa)结合的区段；(d)多个延伸pa，其中所述延伸pa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点结合的区段，和(ii)多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)；并且其中所述延伸pa任选地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)；(e)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc(参见图2b)。
[0146]
在一些实施方案中，所述碱基pa的区段按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)、(iv)；(i)、(ii)、(iv)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)、(iv)；(i)、(iii)、(iv)、(ii)；(i)、(iv)、(ii)、(iii)；
(i)、(iv)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)、(iv)；(ii)、(i)、(iv)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)、(iv)；(ii)、(iii)、(iv)、(i)；(ii)、(iv)、(i)、(iii)；(ii)、(iv)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)、(iv)；(iii)、(i)、(iv)、(ii)；(iii)、(ii)、(i)、(iv)；(iii)、(ii)、(iv)(i)；(iii)、(iv)、(i)、(ii)；(iii)、(iv)、(ii)、(i)；(iv)、(i)、(ii)、(iii)；(iv)、(i)、(iii)、(ii)；(iv)、(ii)、(i)、(iii)；(iv)、(ii)、(iii)、(i)；(iv)、(iii)、(i)、(ii)；或(iv)、(iii)、(ii)、(i)的顺序。在一些实施方案中，所述延伸pa的区段按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)；或(iii)、(ii)、(i)的顺序。
[0147]
在一些实施方案中，所述碱基pa和所述延伸pa之间的结合位点包含互补序列(参见图2b和3b)。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点和/或所述延伸pa的所述延伸pa结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa拴系至所述碱基pa和/或将所述延伸pa彼此拴系(参见图2b和3c)。
[0148]
在一个实施方案中，本发明提供包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的ppa对，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)多个预扩增子(pa)，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(d)多个碱基扩增子(碱基amp)，其中所述碱基amp包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段，和(iii)与延伸扩增子(延伸amp)结合的区段；(e)多个延伸amp，其中所述延伸amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点结合的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；并且其中所述延伸amp任选地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc(参见图2c)。
[0149]
在一些实施方案中，所述pa的区段按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)；或(iii)、(ii)、(i)的顺序。在一些实施方案中，所述碱基amp的区段按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)；或(iii)、(ii)、(i)的顺序。在一些实施方案中，所述延伸amp的区段按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)；或(iii)、(ii)、(i)的顺序。
[0150]
在一些实施方案中，所述碱基amp和所述延伸amp之间的结合位点包含互补序列
(参见图2c和3b)。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点和/或所述延伸amp的所述延伸amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸amp拴系至所述碱基amp和/或将所述延伸amp彼此拴系(参见图2c和3c)。
[0151]
在一些实施方案中，(i)其中所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；和(ii)其中所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)；或其中所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)(参见图14a，下部圆圈)。
[0152]
在一些实施方案中，所述第一和第二tp的区段按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)；或(iii)、(ii)、(i)的顺序。在一些实施方案中，所述第一和第二碱基ppa的区段按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)、(iv)；(i)、(ii)、(iv)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)、(iv)；(i)、(iii)、(iv)、(ii)；(i)、(iv)、(ii)、(iii)；(i)、(iv)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)、(iv)；(ii)、(i)、(iv)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)、(iv)；(ii)、(iii)、(iv)、(i)；(ii)、(iv)、(i)、(iii)；(ii)、(iv)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)、(iv)；(iii)、(i)、(iv)、(ii)；(iii)、(ii)、(i)、(iv)；(iii)、(ii)、(iv)(i)；(iii)、(iv)、(i)、(ii)；(iii)、(iv)、(ii)、(i)；(iv)、(i)、(ii)、(iii)；(iv)、(i)、(iii)、(ii)；(iv)、(ii)、(i)、(iii)；(iv)、(ii)、(iii)、(i)；(iv)、(iii)、(i)、(ii)；或(iv)、(iii)、(ii)、(i)的顺序。在一些实施方案中，所述第一和第二ppa的区段的按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)；或(iii)、(ii)、(i)的顺序。
[0153]
在一个实施方案中，本发明提供包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的ppa对，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，其中所述第一pa-bsr包含两个区段，(ia)包含第一预扩增子(第一pa)的结合位点的区段和(ib)包含第二pa的结合位点的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第二pa-bsr包含两个区段，(iia)包含所述第二pa的结合位点的区段和(iib)包含所述第一pa的结合位点的区段；(c)多个所述第一pa和多个所述第二pa，其中所述第一pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第二pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第一pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；并且其中所述第二pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(d)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)
与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(e)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc(参见图5)。
[0154]
在一些实施方案中，所述第一ppa的区段按5
’
至3
’
(i)、(ia)、(ib)；(i)、(ib)、(ia)；(ia)、(i)、(ib)；(ia)、(ib)、(i)；(ib)、(i)、(ia)；或(ib)、(ia)、(i)的顺序。在一些实施方案中，所述第二ppa的区段按5
’
至3
’
(i)、(iia)、(iib)；(i)、(iib)、(iia)；(iia)、(i)、(iib)；(iia)、(iib)、(i)；(iib)、(i)、(iia)；或(iib)、(iia)、(i)的顺序。
[0155]
在一些实施方案中，所述ppa包含碱基ppa和延伸ppa(参见图5和2a)。在一些实施方案中，所述pa包含碱基pa和延伸pa(参见图5和2b)。在一些实施方案中，所述amp包含碱基amp和延伸amp(参见图5和2c)。
[0156]
在一些实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述第一碱基ppa和所述第一延伸ppa之间和/或所述第一延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa和所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸ppa之间的结合位点包含互补序列；和/或其中所述碱基pa和延伸pa之间的结合位点，和或所述碱基amp和延伸amp之间的结合位点包含互补序列(参见图5和3b)。
[0157]
在一些实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系；或其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点和/或所述延伸pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa或amp拴系至所述碱基pa或amp和/或将所述延伸pa或amp彼此拴系(参见图5和3c)。
[0158]
在一些实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸ppa拴系至所述第一延伸ppa，并且将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第二延伸ppa(参见图5和3d)。
[0159]
在一些实施方案中，所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：所述第一碱基ppa和/或所述第一延伸ppa包括包含所述第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点第四区段(iv)(参见图5和2a和图4，中间圆圈)。
[0160]
在一些实施方案中，所述第一和第二ppa和/或所述第一和第二延伸ppa的区段按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)、(iv)；(i)、(ii)、(iv)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)、(iv)；(i)、(iii)、(iv)、(ii)；(i)、(iv)、(ii)、(iii)；(i)、(iv)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)、(iv)；(ii)、(i)、(iv)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)、(iv)；(ii)、(iii)、(iv)、(i)；(ii)、(iv)、(i)、(iii)；(ii)、(iv)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)、(iv)；(iii)、(i)、(iv)、(ii)；(iii)、(ii)、(i)、(iv)；(iii)、(ii)、(iv)(i)；(iii)、(iv)、(i)、(ii)；(iii)、(iv)、(ii)、(i)；(iv)、(i)、(ii)、(iii)；(iv)、(i)、(iii)、(ii)；(iv)、(ii)、(i)、(iii)；(iv)、(ii)、(iii)、(i)；(iv)、(iii)、(i)、(ii)；或(iv)、(iii)、(ii)、(i)的顺序。
[0161]
在一些实施方案中，(i)其中所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；和(ii)其中所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)；或其中所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)(参见图5和图4,下部圆圈)。
[0162]
在一些实施方案中，所述第一和第二tp的区段按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)；或(iii)、(ii)、(i)的顺序。在一些实施方案中，所述第一和第二碱基ppa的区段按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)、(iv)；(i)、(ii)、(iv)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)、(iv)；(i)、(iii)、(iv)、(ii)；(i)、(iv)、(ii)、(iii)；(i)、(iv)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)、(iv)；(ii)、(i)、(iv)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)、(iv)；(ii)、(iii)、(iv)、(i)；(ii)、(iv)、(i)、(iii)；(ii)、(iv)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)、(iv)；(iii)、(i)、(iv)、(ii)；(iii)、(ii)、(i)、(iv)；(iii)、(ii)、(iv)(i)；(iii)、(iv)、(i)、(ii)；(iii)、(iv)、(ii)、(i)；(iv)、(i)、(ii)、(iii)；(iv)、(i)、(iii)、(ii)；(iv)、(ii)、(i)、(iii)；(iv)、(ii)、(iii)、(i)；(iv)、(iii)、(i)、(ii)；或(iv)、(iii)、(ii)、(i)的顺序。在一些实施方案中，所述第一和第二ppa的区段按5
’
至3
’
(i)、(ii)、(iii)；(i)、(iii)、(ii)；(ii)、(i)、(iii)；(ii)、(iii)、(i)；(iii)、(i)、(ii)；或(iii)、(ii)、(i)的顺序。
[0163]
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含第二sgc，其中所述第二sgc包含与第一靶标不同的第二靶标，其中所述sgc独立于所述第一sgc的构造包含上述任一个sgc的sgc构造，并且其中所述第二sgc与所述第一sgc是可区分的(参见图6)。
[0164]
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含第三sgc，其中所述第三sgc包含与第一靶标和第二靶标不同的第三靶标，其中所述sgc独立于所述第一sgc和/或所述第二sgc的构造包含上述任一个sgc的sgc构造，并且其中所述第三sgc与所述第一和第二sgc是可区分的。
[0165]
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含与所述tp对结合的靶标核酸。在一些实施方案中，所述组合物包含细胞，例如包含靶标核酸的细胞。
[0166]
在一些实施方案中，本发明提供检测靶标核酸的方法，其包括使样品核酸与用于组装上述sgc的组分接触，将sgc组装在所述靶标核酸上，并检测所述靶标核酸。在一些实施方案中，所述核酸在细胞中。
[0167]
如本文所述，本发明的方法通常涉及靶标核酸的原位检测。核酸的原位检测方法
manual,third ed.,cold spring harbor laboratory,new york(2001)；ausubel et al.,current protocols in molecular biology,john wiley and sons,baltimore,md(1999))。例如，naoh、lioh或koh或其他高ph缓冲液(ph＞11)可以用于使双链核酸如dna变性。另外，可以结合使用热和化学变性方法。
[0170]
如本文所用，术语“多个”应理解为是指两个或更多个。因此，多个可以指例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、55个或更多个、60个或更多个、65个或更多个、70个或更多个、75个或更多个、80个或更多个、85个或更多个、90个或更多个、95个或更多个、100个或更多个、110个或更多个、120个或更多个、130个或更多个、140个或更多个、150个或更多个、160个或更多个、170个或更多个、180个或更多个、190个或更多个、200个或更多个、300个或更多个、400个或更多个、500个或更多个、600个或更多个、700个或更多个、800个或更多个、900个或更多个、或1000个或更多个，或甚至更大数字，如果期望特殊用途。
[0171]
在设计包含互补序列的两个核酸序列之间的结合位点时，可以任选地设计互补序列以最大化解链温度(dt
m
)的差异。这可以通过使用本领域已知的解链温度计算算法来完成(参见例如，santalucia,proc.natl.acad.sci.u.s.a.95:1460
–
1465(1998))。此外，已知人工修饰的碱基如锁核酸(lna)或桥接核酸(bna)和天然存在的2
’-
o-甲基rna增强互补对之间的结合强度(petersen and wengel,trends biotechnol.21:74
–
81(2003)；majlessi et al.,nucl.acids res.26:2224-2229(1998))。可以根据需要将这些修饰的碱基策略性地引入sgc组分之间的结合位点。
[0172]
一种方法是利用修饰的核苷酸(lna、bna或2
’-
o-甲基rna)。因为每个修饰的碱基都可以增加解链温度，所以可以大大缩短两个核酸序列(即互补序列)之间的结合区的长度。修饰的碱基与其补体的结合强度更强，并且解链温度(dt
m
)的差异增加。另一个实施方案是在待杂交的例如信号产生复合物(sgc)的核酸组分的互补序列中或在两个核酸组分之间使用三个修饰的碱基(例如，三个lna、bna或2
’-
o-甲基rna碱基，或两个或三个不同的修饰的碱基的组合)。此类组分可以是例如预-预扩增子、预扩增子、扩增子、标记探针或一对靶标探针。
[0173]
修饰的碱基，例如lna或bna，可以用于sgc的选定组分的区段中，特别是在介导核酸组分之间结合的那些区段中，其增加了碱基与其互补碱基的结合强度，从而允许减少互补区段的长度(参见例如petersen and wengel,trends biotechnol.21:74
–
81(2003)；美国专利号7,399,845)。可以将扩展天然的4个字母的字母表的人工碱基，例如人工扩展遗传信息系统(aegis；yang et al.,nucl.acids res.34(21):6095-6101(2006))并入sgc的相互作用组分之间的结合位点。这些人工碱基可以增加相互作用组分的特异性，其进而可以
允许较低严格性杂交反应产生较高的信号。
[0174]
sgc还包含多个标记探针(lp)。每个lp包含可检测的区段。可检测的组分可直接附接至lp，或lp可以与包含可检测的组分(即标记)的另一种核酸杂交。如本文所用，“标记”是促进分子检测的部分。在本发明的上下文中，常用标记包括荧光、发光、光散射和/或比色标记。合适的标记包括酶，和荧光和发色部分，以及放射性核素、底物、辅因子、抑制剂、化学发光部分、磁性颗粒、稀土金属、金属同位素等。在本发明的一个具体实施方案中，标记是酶。示例性的酶标记包括但不限于辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(ap)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等，以及各种蛋白酶。其他标记包括但不限于荧光团、二硝基苯基(dnp)等。标记是本领域技术人员众所周知的，例如在hermanson,bioconjugate techniques,academic press,san diego(1996),以及美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241中所述。许多标记是可商购的并且可以用于本发明的方法和测定中，包括可检测的酶/底物组合(pierce,rockford il；santa cruz biotechnology,dallas tx；invitrogen,carlsbad ca)。在本发明的一个具体实施方案中，如本文所述，酶可以利用发色或荧光底物产生可检测的信号。示例性标记在本文中描述。
[0175]
可以利用多种酶或非酶标记中的任何一种，只要可以分别检测酶活性或非酶标记即可。该酶从而产生可检测的信号，其可以用于检测靶标核酸。特别有用的可检测信号是发色或荧光信号。因此，用作标记的特别有用的酶包括可利用其发色或荧光底物的那些。可以通过酶促反应将此类发色或荧光底物转化为易于检测的发色或荧光产物，其可以使用显微术或光谱术容易地检测和/或定量。此类酶是本领域技术人员熟知的，包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等(参见hermanson,bioconjugate techniques,academic press,san diego(1996))。具有众所周知的发色或荧光底物的其他酶包括各种肽酶，其中发色或荧光肽底物可以用于检测蛋白水解切割反应。发色底物和荧光底物的使用在细菌诊断中也是众所周知的，包括但不限于使用α-和β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、6-磷酸-β-d-半乳糖苷6-磷酸半乳糖苷水解酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、淀粉酶、神经氨酸酶、酯酶、脂肪酶等(manafi et al.,microbiol.rev.55:335-348(1991))，并且此类具有已知发色或发荧光底物的酶可以容易地适于在本发明的方法中使用。
[0176]
产生可检测信号的各种发色底物或荧光底物是本领域技术人员熟知的并且可商购。可以用于产生可检测信号的示例性底物包括但不限于用于辣根过氧化物酶的3,3
’-
二氨基联苯胺(dab)、3,3
’
,5,5
’-
四甲基联苯胺(tmb)、氯萘酚(4-cn)(4-氯-1-萘酚)、2,2
’-
连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts)、邻苯二胺二盐酸盐(opd)和3-氨基-9-乙基咔唑(aec)；用于碱性磷酸酶的5-溴-4-氯-3-吲哚基-1-磷酸(bcip)、硝基蓝四唑(nbt)、固红(fast red tr/as-mx)和对硝基苯磷酸盐(pnpp)；用于β-半乳糖苷酶的1-甲基-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷(galactopyranoside)和2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-d-吡喃半乳糖苷；用于β-葡糖苷酶的2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-d-吡喃葡萄糖苷；等等。示例性的荧光底物包括但不限于用于碱性磷酸酶的4-(三氟甲基)伞形基(umbelliferyl)磷酸盐；用于磷酸酶的4-甲基伞形基磷酸双(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)、4-甲基伞形基磷酸双(环己基铵(cyclohexylammonium))和4-甲基伞形基磷酸；用于辣根过氧化物酶的quantablu
tm
和quantared
tm
；用于β-半乳糖苷酶的4-甲基伞形基β-d-吡喃半乳糖苷、荧光素二(β-d-吡喃半乳糖苷)和萘荧光素二-(β-d-吡喃半乳糖苷)；用于β-葡糖苷酶的3-乙酰伞
465、atto 488、atto 490ls、atto 495、atto 514、atto 520、atto 532、atto rho6g、atto 542、atto 550、atto 565、atto rho3b、atto rho11、atto rho12、atto thio12、atto rho101、atto 590、atto 594、atto rho13、atto 610、atto 620、atto rho14、atto 633、atto 643、atto 647、atto 647n、atto 655、atto oxa12、atto 665、atto 680、atto 700、atto 725、atto 740、cyan 500nhs-ester(atto-tech，siegen，germany)等。示例性的发色团包括但不限于酚酞、孔雀石绿、硝基芳香族如硝基苯基、重氮染料、dabsyl(4-二甲基氨基偶氮苯-4
’-
磺酰基)等。
[0180]
可以利用诸如显微术、细胞计量术(例如，大量细胞计数法、质谱流式细胞术(cytometry by time of flight，cytof)、流式细胞术)或光谱术的众所周知的方法来可视化与相应靶标核酸相关的发色、荧光或金属可检测信号。通常，如果在同一测定法中使用了不同的标记物，则利用发色底物或荧光底物，或发色或荧光标记物，或稀土或金属同位素用于特定测定，使得可以使用单一类型的仪器用于检测同一样品中的核酸靶标。
[0181]
如本文所公开的，本发明基于构建与靶标核酸结合的信号产生复合物(sgc)，以便检测细胞中靶标核酸的存在。用于构建sgc的组分通常包含核酸，使得核酸杂交反应用于将sgc的组分结合至靶标核酸。选择适当区域并设计与靶标核酸结合的特异性和选择性试剂(特别是与靶标核酸特异性且选择性结合的寡核苷酸或探针，或sgc的其他组分)的方法是本领域技术人员众所周知的(参见sambrook et al.,molecular cloning:a laboratory manual,third ed.,cold spring harbor laboratory,new york(2001)；ausubel et al.,current protocols in molecular biology,john wiley and sons,baltimore,md(1999))。可以使用适当选择靶标核酸的区域以及结合剂(如寡核苷酸或探针)的适当长度实现所期望的特异性，并且此类选择方法是是本领域技术人员众所周知的。因此，本领域技术人员将容易理解并可以容易地确定适当的试剂，如寡核苷酸或探针，其可以用于将一个特定的靶标核酸靶向于另一个靶标或非靶标核酸(即，与期望的靶标核酸特异性杂交)，或提供与sgc的组分的结合。
[0182]
如本文所述，本发明的实施方案包括使用结合至靶标核酸的靶标探针对。在一对靶标探针与同一预扩增子结合的情况下(图1a)，可以使用有时称为“z”构造的探针构造。此类构造及其用于提高灵敏度并降低背景的优点描述于例如美国专利号7,709,198，美国公开2008/0038725和2009/0081688，以及wo 2007/001986和wo 2007/002006中，其每一个通过引用并入本文。美国专利号7,709,198和美国公开2008/0038725和2009/0081688另外描述了用于选择靶标探针的特性的细节，如靶标探针对，包括长度、定向、杂交条件等。本领域的技术人员可以基于本文以及例如美国专利号7,709,198，美国公布2008/0038725和2009/0081688以及wo 2007/001986和wo 2007/002006中的教导容易地确定合适的构造。
[0183]
如本文所述，靶标探针对中靶标探针的靶标结合位点可以处于任何期望的定向和组合。例如，靶标探针对中一个成员的靶标结合位点可以是预扩增子或预-预扩增子结合位点的5
’
或3
’
，而该对的另一个成员可以独立地定向，其中靶标结合位点在预扩增子或预-预扩增子结合位点的5
’
或3
’
。
[0184]
在另一实施方案中，用于检测靶标核酸的存在的sgc基于sgc的一个或多个组分的协同杂交(参见us 20170101672和wo 2017/066211，其每一个通过引用并入本文)。此类协同杂交在本文中也称为basescope
tm
。在协同杂交作用中，sgc的两个组分之间的结合由两个
结合位点介导，且同时与两个位点结合的解链温度高于结合单独一个位点的解链温度(参见us 20170101672和wo 2017/066211)。如us 20170101672和wo 2017/066211中所述，可以通过靶标探针组构造来增强协同杂交作用。
[0185]
本发明的方法和相关组合物可以利用协同杂交来在核酸靶标的原位检测中增加特异性并减少背景，其中复杂的物理化学环境和大量的非靶标分子的存在可以产生高噪音。使用此类协同杂交方法，仅当sgc与靶标核酸结合时才发生标记探针的结合。如us 20170101672和wo 2017/066211中所述并在其图1中示出的，可以通过增加sgc的一个或多个组分中的协同杂交的数量来容易地修改该方法以提供期望的信噪比。
[0186]
在另一实施方案中，协同杂交可以应用于sgc的多种组分。例如，如本文所述，sgc的组分之间的结合可以是稳定的反应，或者也如本文所述，可以将结合配置为需要协同杂交。在这种情况下，设计用于协同杂交的结合组分，使得该组分含有结合至另一组分的两个区段。
[0187]
因此，用于检测靶标核酸的方法可以利用协同杂交进行检测系统中任何一种或所有组分之间的结合反应，从而提供特异性结合至靶标核酸的sgc。可以基于所期望的测定条件、所测定的样品的类型、所期望的测定灵敏度等来选择要进行协同杂交的组分的数量以及哪些组分要进行协同杂交。协同杂交结合反应的任何一种或组合可以用于增加测定的灵敏度和特异性。在本发明的实施方案中，协同杂交可以在预-预扩增子和预扩增子之间，在预扩增子和扩增子之间，在扩增子和标记探针之间，或其组合(参见例如，us 20170101672和wo 2017/066211)。
[0188]
如本文所公开，组分通常直接彼此结合。在含有核酸的组分的情况下，结合反应通常通过杂交进行。在杂交反应的情况下，组分之间的结合是直接的。如果期望的话，可以包括中间组分，使得一种组分与另一种组分的结合是间接的，例如，该中间组分含有互补的结合位点以桥接另外两种组分。
[0189]
如本文所公开，本发明方法的步骤(凭此将组分组装成结合至靶标核酸的sgc)可以以任何顺序同时或顺序地进行，只要可以检测到靶标核酸。在一些情况下，可以期望减少测定步骤的数量，例如减少杂交和洗涤步骤的数量。减少测定步骤数量的一种方法是在与细胞接触之前预组装sgc的一些或所有组分。可以通过在接触靶标核酸之前使sgc的一些或所有组分杂交在一起来进行此类预组装。如果期望的话，还可以通过预制备sgc的一些部分以通过化学合成整合sgc的多个组分来减少测定步骤。
[0190]
应当理解，只要检测到靶标核酸，可以以任何期望的顺序实施本发明。因此，如所期望的，在本发明的方法中，使细胞与用于sgc的组装的任何组分接触的步骤可以以任何期望的顺序进行，可以顺序地进行，或者可以同时进行，或者可以顺序地进行一些步骤而其他则同时进行，只要检测到靶标核酸。还应理解，如所期望的，本文公开的实施方案可以独立地与本文公开的其他实施方案组合，以利用各种构造、组分大小、测定条件、测定灵敏度等。
[0191]
应理解，本发明可以以提供检测靶标核酸的任何形式进行。尽管本文中一般使用原位杂交来描述本发明的实施，但应理解，如本领域众所周知的，也可以进行本发明以检测其他形式的靶标核酸，特别是检测细胞中的靶标核酸。可以用于检测细胞中靶标核酸的一种方法是流式细胞术，如本领域众所周知的(参见例如，shapiro,practical flow cytometry 3rd ed.,wiley-liss,new york(1995)；ormerod,flow cytometry,2nd ed.,
springer(1999))。因此，本发明的方法、样品和试剂盒可以以原位杂交测定形式或另一种形式(如流式细胞术)使用。核酸检测方法(包括原位杂交)在流式细胞术中的应用先前已有描述(参见例如，hanley et al.,plos one,8(2):e57002.doi:10.1371/journal.pone.0057002(2013)；baxter et al.,nature protocols 12(10):2029-2049(2017))。
[0192]
如本文所述，可以选择各种组分的构造以提供所期望的稳定或协同的杂交结合反应。应当理解，即使在本文中将结合反应例示为稳定的或不稳定的反应(如对于协同杂交)，只要检测到靶标核酸，就可以如所期望的修改任何结合反应。还应理解，可以根据要使用的测定和杂交条件来改变和选择构造。通常，如果期望结合反应稳定，则组分之间的互补核酸序列的区段通常在10至50个核苷酸的范围内，或更大，例如16至30个核苷酸，如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸或更大。如果期望结合反应相对不稳定(如当采用协同杂交结合反应时)，则组分之间的互补核酸序列的区段通常在5至18个核苷酸的范围内，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个核苷酸。应当理解，取决于测定中所采用的条件，对于稳定或不稳定的杂交，核苷酸长度可以稍微更短或更长。如本文所公开，应进一步理解的是，经修饰的核苷酸如lna或bna可以用于增加修饰的碱基处的结合强度，从而允许结合区段的长度减少。因此，应当理解，关于与其他核酸区段互补的核酸区段的长度，如果期望的话，可以进一步减小本文所述的长度。
[0193]
在本文公开的一些实施方案中，通过使用碱基和延伸扩增分子，例如碱基和延伸ppa、碱基和延伸pa、和/或碱基和延伸amp来延伸扩增分子的级或层。在此类实施方案中，碱基和延伸扩增分子的积累在本文中也称为“拼接(tile)”。如本文所述，“拼接”可以用于延伸扩增分子层的长度。如本文所用，碱基扩增分子是在分子的级内与较低级结合的分子，例如，碱基ppa与tp结合，碱基pa与ppa结合，和/或碱基amp与pa结合，而延伸ppa与碱基ppa和/或另一个延伸ppa结合，延伸pa与碱基pa和/或另一个延伸pa结合，和/或延伸amp与碱基amp和/或另一个延伸amp结合。
[0194]
每个拼接的长度将取决于每个拼接中的重复的数量和每个重复单元(即ppa/pa/amp结合区段重复(bsr))的大小。根据需要，重复的数量可以在2至20个重复的范围内或者甚至更高。对于ppa，每个拼接的长度通常将在56至560个碱基的范围内，但是应理解，可以根据需要使用更短或更长的序列，例如约50至约600个碱基，或之间的任何整数长度。对于pa，每个拼接的长度通常将在50至500的范围内，但是应理解，可以根据需要使用更短或更长的序列，例如约35至约600个碱基，或之间的任何整数长度。对于amp，每个拼接的长度通常将在36至360的范围内，但是应理解，可以根据需要使用更短或更长的序列，例如约25至约400个碱基，或之间的任何整数长度。结合区段重复(bsr)的长度通常在10-50个碱基的范围内，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50。在一个具体的实施方案中，ppa的pa-bsr的长度是28个碱基。在一个具体的实施方案中，pa的amp-bsr的长度是25个碱基。在一个具体的实施方案中，amp的lp-bsr的长度是18个碱基。
[0195]
关于靶标探针对，可以将靶标探针对设计为结合至靶标核酸的紧邻区段或在靶标探针对的靶标探针结合位点之间具有一个至多个碱基的区段上。通常，将靶标探针对设计
为与靶标核酸结合，使得在靶标核酸上的结合位点之间通常存在0至500个碱基，例如0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480或500个碱基，或之间的任何整数长度。
[0196]
在本发明的一些实施方案中，靶标探针作为对靶标核酸特异的组提供，其中该组包含与相同靶标核酸特异性杂交的两对或更多对靶标探针。在这种情况下，对靶标核酸特异的靶标探针组中的靶标探针对与靶标核酸的不同且不重叠的序列结合。当使用具有两对或更多对可以与同一靶标核酸特异性杂交的靶标探针的靶标探针组时，与靶标探针对结合的分子(预扩增子(参见图1a)或预-预扩增子(参见图1b和1c))通常对于同一靶标探针组中的靶标探针对是相同的。因此，可以将与相同靶标核酸结合的靶标探针对设计成包含与靶探针对结合的sgc中分子(即，预扩增子或预-预扩增子)的相同结合位点。使用多个靶标探针对检测靶标核酸提供与同一靶标核酸上的多个sgc组装相关的更高信号。在一些实施方案中，用于结合相同靶标核酸的靶标探针对的数量在每靶标1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、1-120、1-130、1-140、1-150、1-160、1-170、1-180、1-190或1-200对范围内，或更多对，或之间的任何整数对，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200等。
[0197]
本发明的方法可以用于实现所期望靶标核酸的检测。在一个实施方案中，用多个靶标探针对检测靶标核酸。在这种情况下，靶标探针对被设计成与靶标核酸的一个以上区域结合，以允许组装多个sgc到靶标核酸上。应当理解，如果多个靶标探针对用于结合相同的靶标核酸，则一个靶标探针对的靶标结合位点不与另一靶标探针对的靶标结合位点重叠。
[0198]
在本发明的一个实施方案中，通过本发明的方法检测的靶标核酸可以是细胞样品中存在的任何靶标核酸。因此，待检测的靶标核酸可以是但不一定是相同类型的核酸。靶标核酸包括但不限于rna，包括信使rna(mrna)、micro rna(mirna)，核糖体rna(rrna)、线粒体rna，非编码rna等，或dna等，或dna/rna杂交体。在靶标核酸是rna的情况下，应理解靶标核酸可以独立地选自由信使rna(mrna)、micro rna(mirna)、核糖体rna(rrna)、线粒体rna和非编码rna组成的组。因此，靶标核酸可以独立地是单链或双链的dna，或单链或双链的任何类型的rna，或dna/rna杂交体。
[0199]
在另一实施方案中，本发明的方法可以应用于靶标核酸的多重检测。在一个实施方案中，本发明的方法应用于检测两种或更多种靶标核酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多种靶标核酸。可以检测的靶标核酸的数量取决于检测标记。对于荧光标记，通常可以检测高达10个核酸靶标。对于使用基于质谱的检测的金属标记探针，靶标核酸的数量可以高达
150个。本领域技术人员可以容易地选择合适的独特标记，以允许检测样品中的一种以上靶标核酸。
[0200]
在又一个实施方案中，本发明的方法可以应用于同时检测双链核酸和单链核酸，例如，检测同一样品中的dna和rna。在这种情况下，可以设计探针以检测单链核酸，例如rna(参见例如，美国专利号7,709,198，美国公开2008/0038725和2009/0081688和2017/0101672)和双链核酸，使得可以在同一样品中检测到双链核酸和单链核酸两者(例如dna和rna)。
[0201]
本文所述的发明通常涉及样品中核酸的检测。应当理解，本发明的方法可以附加地应用于检测样品中的靶标核酸以及任选地其他分子，特别是与靶标核酸在相同的细胞中。例如，除了检测靶标核酸之外，还可以同时检测细胞中表达的蛋白质。细胞中蛋白质的检测是本领域技术人员众所周知的，例如，通过使用任何熟知的检测系统，包括本文所述的用于检测靶标核酸的检测系统，检测蛋白质特异性抗体的结合。已经描述了靶标核酸和蛋白质的检测(参见例如schulz et al.,cell syst.6(1):25-36(2018))。
[0202]
原位检测方法可以用于固定化在载玻片上的组织标本上，悬浮液中的单个细胞上，例如从血液样品中分离的外周血单个核细胞(pbmc)等。组织标本包括例如组织活检样品。血液样品包括例如出于诊断目的而采集的血液样品。在血液样品的情况下，可以直接分析血液，例如在血液涂片中进行分析，或者可以对血液进行处理，例如裂解红细胞，分离pbmc或白细胞，分离靶标细胞等，使得通过本发明的方法分析的样品中的细胞在血液样品中或衍生自血液样品。类似地，可以对组织标本进行处理，例如，将组织标本切碎并进行物理或酶处理，以将组织破碎成单个细胞或细胞簇。另外，如果需要，可以处理细胞学样品以分离细胞或破坏细胞簇。因此，可以使用本领域公知的方法获得并处理组织、血液和细胞学样品。本发明的方法可以用于诊断应用中，以基于核酸靶标的存在与否来鉴定病理细胞的存在与否，所述核酸靶标是指示病理学的生物标志物。
[0203]
本领域技术人员应理解，使用本发明的方法，可以使用许多合适的样品中的任何一种来检测靶标核酸。用于本发明方法的样品通常将是生物样品或组织样品。此类样品可以从生物学受试者获得，包括从个体或一些其他生物学材料来源，例如活检、尸检或法医材料收集的生物学组织或液体来源的样品。生物样品还包括来自生物学受试者的含有或怀疑含有癌前或癌细胞或组织的区域的样品，例如组织活检，包括细针抽吸物，血液样品或细胞学标本。此类样品可以是但不限于从生物体例如哺乳动物分离的器官、组织、组织级分和/或细胞。示例性的生物学样品包括但不限于细胞培养物，包括原代细胞培养物、细胞系、组织、器官、细胞器、生物体液等。另外的生物学样品包括但不限于皮肤样品、组织活检，包括细针抽吸物、细胞学样品、粪便、体液，包括血液和/或血清样品、唾液、精液等。此类样品可以用于医学或兽医诊断目的。样品也可以从其他来源获得，例如食物、土壤、物体表面等，以及需要检测核酸的其他材料。因此，本发明的方法可以用于检测来自从个人或其他来源获得的生物样品的一种或多种病原体(例如dna或rna病毒、细菌、真菌、单细胞生物体，例如寄生虫等)。
[0204]
用于通过本发明的方法进行分析的细胞学样品的收集在本领域中是熟知的(参见例如dey,“cytology sample procurement,fixation and processing”in basic and advanced laboratory techniques in histopathology and cytology pp.121-132,
springer,singapore(2018)；“non-gynocological cytology practice guideline”american society of cytopathology,adopted by the asc executive board march 2,2004)。用于分析宫颈组织(包括组织活检和细胞学样品)的处理样品的方法在本领域中是熟知的(参见例如，cecil textbook of medicine,bennett and plum,eds.,20th ed.,wb saunders,philadelphia(1996)；colposcopy and treatment of cervical intraepithelial neoplasia:a beginner
’
s manual,sellors and sankaranarayanan,eds.,international agency for research on cancer,lyon,france(2003)；kalaf and cooper,j.clin.pathol.60:449-455(2007)；brown and trimble,best pract.res.clin.obstet.gynaecol.26:233-242(2012)；waxman et al.,obstet.gynecol.120:1465-1471(2012)；cervical cytology practice guidelines toc,approved by the american society of cytopathology(asc)executive board,november 10,2000))。在一个实施方案中，细胞学样品是宫颈样品，例如宫颈涂片。在一个实施方案中，样品是细针抽吸物。
[0205]
在本发明的具体实施方案中，样品是组织标本或衍生自组织标本。在本发明的其他具体实施方案中，样品是血液样品或衍生自血液样品。在本发明的其他具体实施方案中，样品是细胞学样品或衍生自细胞学样品。
[0206]
本发明还提供了包含一个或多个细胞的样品。细胞可以任选地被固定。细胞可以任选地被透化。固定和/或透化细胞特别适用于原位测定。在一个实施方案中，本发明提供了包含本文所述的组装的sgc的细胞样品。细胞可以任选地是固定和/或透化的。
[0207]
本发明另外提供了包含一个细胞或多个细胞的载玻片。任选地，一个细胞或多个细胞固定在载玻片上。任选地，一个细胞或多个细胞被透化。在具体的实施方案中，载玻片上的细胞被固定和/或透化用于原位测定。在一个实施方案中，本发明提供了载玻片，其上固定化有多个细胞，其包含含有靶标核酸和如上所述的组装的sgc的至少一个细胞。细胞可以任选地是固定的和/或透化的。
[0208]
本发明还提供了试剂盒，其包含如本文所述的sgc的组分，其中所述试剂盒不包括靶标核酸。如本文所公开的，此类试剂盒可以包含预扩增子(pa)、扩增子(amp)和标记探针(lp)，以及任选地预-预扩增子(ppa)。任选地，试剂盒可以包含针对特定靶标核酸或多种靶核酸的靶标探针(tp)。本发明的试剂盒的组分可以任选地在容器中，并且任选地可以提供使用该试剂盒的说明书。
[0209]
在一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含用于组装sgc的组分，其中所述试剂盒包含上述或本文公开的、包括图2-6中的任一个中的任何一种sgc的ppa、pa、amp和lp。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含一种或多种靶标核酸的tp。
[0210]
实施方案1.包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二碱基ppa的碱基ppa对，其中所述第一碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，和(iii)包含第一延伸预-预扩增子(延伸ppa)的结合位点的
区段；并且其中所述第二碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个第二预扩增子结合区段重复(第二pa-bsr)的区段，和(iii)包含第二延伸ppa的结合位点的区段；其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列，并且其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(c)包含所述第一和第二延伸ppa的延伸ppa组，其中所述第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；并且其中所述第二延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；(d)多个预扩增子(pa)，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(e)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc。
[0211]
实施方案2.实施方案1所述的组合物，其中所述延伸ppa组包含至少一个额外的第一延伸ppa和至少一个额外的第二延伸ppa，其中所述额外的第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第一延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；其中所述额外的第二延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第二延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；并且其中所述至少一个额外的第一ppa任选地包括包含所述第一延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)，并且所述至少一个额外的第二ppa任选地包括包含所述第二延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序。
[0212]
实施方案3.实施方案1或2所述的组合物，其中所述第一碱基ppa与所述第一延伸ppa之间和/或所述延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa与所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸ppa之间的结合位点包含互补序列。
[0213]
实施方案4.实施方案1或2所述的组合物，其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系。
[0214]
实施方案5.实施方案1或2所述的组合物，其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸
ppa拴系至所述第一延伸ppa，并将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第二延伸ppa。
[0215]
实施方案6.实施方案1或2所述的组合物，其中所述第一碱基ppa和/或所述第一延伸ppa包括包含所述第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，其中所述ppa的区段按(i)、(ii)、(iv)、(iii)的顺序。
[0216]
实施方案7.包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的ppa对，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)多个碱基预扩增子(碱基pa)，其中所述碱基pa包括包含四个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段，和(iv)与延伸预扩增子(延伸pa)结合的区段，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)、(iv)的顺序；(d)多个延伸pa，其中所述延伸pa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点结合的区段，和(ii)多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)；并且其中所述延伸pa任选地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(e)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc。
[0217]
实施方案8.实施方案7所述的组合物，其中所述碱基pa和所述延伸pa之间的结合位点包含互补序列。
[0218]
实施方案9.实施方案7所述的组合物，其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点和/或所述延伸pa的所述延伸pa结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa拴系至所述碱基pa和/或将所述延伸pa彼此拴系。
[0219]
实施方案10.包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的ppa对，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段；
并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)多个预扩增子(pa)，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(d)多个碱基扩增子(碱基amp)，其中所述碱基amp包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段，和(iii)与延伸扩增子(延伸amp)结合的区段，按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(e)多个延伸amp，其中所述延伸amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点结合的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；并且其中所述延伸amp任选地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc.
[0220]
实施方案11.实施方案10所述的组合物，其中所述碱基amp与所述延伸amp之间的结合位点包含互补序列。
[0221]
实施方案12.实施方案10所述的组合物，其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点和/或所述延伸amp的所述延伸amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸amp拴系至所述碱基amp和/或将所述延伸amp彼此拴系。
[0222]
实施方案13.实施方案1-12中任一项所述的组合物：(i)其中所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；并且其中所述区段按(i)、(iii)、(ii)的顺序；和(ii)其中所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)，其中所述区段按(iv)、(i)、(ii)、(iii)的顺序；或其中所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述区段按(iii)、(i)、(ii)的顺序。
[0223]
实施方案14.包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的ppa对，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，其中所述第一pa-bsr包含两个区段，(ia)包含第一预扩增子(第一pa)的结合位点的区段和(ib)包含第二pa的结合位点的区段，其中所述第一ppa的区段按(i)、(ia)、(ib)的顺序；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第二pa-bsr包含两个区段，(iia)包含所述第二pa的结合位点的区段和(iib)包含所述第一pa的结合位
点的区段，其中所述第二ppa的区段按(i)、(iia)、(iib)的顺序；(c)多个所述第一pa和多个所述第二pa，其中所述第一pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第二pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第一pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；并且其中所述第二pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(d)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(e)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc。
[0224]
实施方案15.实施方案14所述的组合物，其中所述ppa包含碱基ppa和延伸ppa.
[0225]
实施方案16.实施方案14所述的组合物，其中所述pa包含碱基pa和延伸pa。
[0226]
实施方案17.实施方案14所述的组合物，其中所述amp包含碱基amp和延伸amp。
[0227]
实施方案18.实施方案14-17中任一项所述的组合物，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述第一碱基ppa和所述第一延伸ppa之间和/或所述第一延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa和所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸ppa之间的结合位点包含互补序列；和/或其中所述碱基pa和延伸pa之间的结合位点，和或所述碱基amp和延伸amp之间的结合位点包含互补序列。
[0228]
实施方案19.实施方案14-17中任一项所述的组合物，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系；或其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点和/或所述延伸pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa或amp拴系至所述碱基pa或amp和/或将所述延伸pa或amp彼此拴系。
[0229]
实施方案20.实施方案14-17中任一项所述的组合物，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸ppa拴系至所述第一延伸ppa，并且将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第二延伸ppa。
[0230]
实施方案21.实施方案14-17中任一项所述的组合物，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述第一碱基ppa和/或所述第一延伸ppa包括包含所述
第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点第四区段(iv)，其中所述ppa的区段按(i)、(ii)、(iv)、(iii)的顺序。
[0231]
实施方案22.实施方案14-21中任一项所述的组合物，(i)其中所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；并且其中所述区段按(i)、(iii)、(ii)的顺序；和(ii)其中所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)，其中所述区段按(iv)、(i)、(ii)、(iii)的顺序；或其中所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述区段按(iii)、(i)、(ii)的顺序。
[0232]
实施方案23.实施方案1-22中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含第二sgc，其中所述第二sgc包含与实施方案1-22的所述靶标不同的第二靶标，其中所述sgc独立于所述第一sgc的构造包含实施方案1-22中任一项的sgc构造，并且其中所述第二sgc与所述第一sgc是可区分的。
[0233]
实施方案24.实施方案23所述的组合物，其中所述组合物进一步包含第三sgc，其中所述第三sgc包含与实施方案1-22的所述靶标和所述第二靶标不同的第三靶标，其中所述sgc独立于所述第一sgc和/或所述第二sgc的构造包含实施方案1-22中任一项的sgc构造，并且其中所述第三sgc与所述第一和第二sgc是可区分的。
[0234]
实施方案25.实施方案1-24中任一项所述的组合物，其进一步包含与所述tp对结合的靶标核酸。
[0235]
实施方案26.实施方案1-25中任一项所述的组合物，其进一步包含细胞。
[0236]
实施方案27.检测靶标核酸的方法，其包括使样品核酸与用于组装如实施方案1-26中任一项的sgc的组分接触，将sgc组装在所述靶标核酸上，并检测所述靶标核酸。
[0237]
实施方案28.实施方案27所述的方法，其中所述核酸在细胞中。
[0238]
实施方案29.试剂盒，其包含用于组装sgc的组分，其中所述试剂盒包含实施方案1-26中任一项所述的ppa、pa、amp和lp。
[0239]
实施方案30.实施方案29所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含实施方案1-26中任一项所述的tp。
[0240]
实施方案31.固定且透化的细胞的样品，所述细胞包含组装的实施方案1-26中任一项的sgc。
[0241]
实施方案32.载玻片，其上固定化有多个固定且透化的细胞，其包含含有靶标核酸以及组装的实施方案1-26中任一项的sgc的至少一个固定且透化的细胞。
[0242]
实施方案33.包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二碱基ppa的碱基ppa对，其中所述第一碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与
所述第一tp的所述第一碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，和(iii)包含第一延伸预-预扩增子(延伸ppa)的结合位点的区段；并且其中所述第二碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个第二预扩增子结合区段重复(第二pa-bsr)的区段，和(iii)包含第二延伸ppa的结合位点的区段；其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)包含所述第一和第二延伸ppa的延伸ppa组，其中所述第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；并且其中所述第二延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；(d)多个预扩增子(pa)，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(e)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc。
[0243]
实施方案34.实施方案33所述的组合物，其中所述延伸ppa组包含至少一个额外的第一延伸ppa和至少一个额外的第二延伸ppa，其中所述额外的第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第一延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；其中所述额外的第二延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第二延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；并且其中所述至少一个额外的第一ppa任选地包括包含所述第一延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)，并且所述至少一个额外的第二ppa任选地包括包含所述第二延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)。
[0244]
实施方案35.实施方案33或34所述的组合物，其中所述第一碱基ppa与所述第一延伸ppa之间和/或所述延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa与所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸ppa之间的结合位点包含互补序列。
[0245]
实施方案36.实施方案33或34所述的组合物，其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系。
[0246]
实施方案37.实施方案33或34所述的组合物，其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点
结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸ppa拴系至所述第一延伸ppa，并将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第二延伸ppa。
[0247]
实施方案38.实施方案33或34所述的组合物，其中所述第一碱基ppa和/或所述第一延伸ppa包括包含所述第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点第四区段(iv)。
[0248]
实施方案39.包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的ppa对，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)多个碱基预扩增子(碱基pa)，其中所述碱基pa包括包含四个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段，和(iv)与延伸预扩增子(延伸pa)结合的区段；(d)多个延伸pa，其中所述延伸pa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点结合的区段，和(ii)多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)；并且其中所述延伸pa任选地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)；(e)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc。
[0249]
实施方案40.实施方案39所述的组合物，其中所述碱基pa和所述延伸pa之间的结合位点包含互补序列。
[0250]
实施方案41.实施方案39所述的组合物，其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点和/或所述延伸pa的所述延伸pa结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa拴系至所述碱基pa和/或将所述延伸pa彼此拴系。
[0251]
实施方案42.包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的ppa对，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结
合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)多个预扩增子(pa)，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(d)多个碱基扩增子(碱基amp)，其中所述碱基amp包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段，和(iii)与延伸扩增子(延伸amp)结合的区段；(e)多个延伸amp，其中所述延伸amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点结合的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；并且其中所述延伸amp任选地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)；(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc。
[0252]
实施方案43.实施方案42所述的组合物，其中所述碱基amp与所述延伸amp之间的结合位点包含互补序列。
[0253]
实施方案44.实施方案42所述的组合物，其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点和/或所述延伸amp的所述延伸amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸amp拴系至所述碱基amp和/或将所述延伸amp彼此拴系。
[0254]
实施方案45.实施方案33-44中任一项所述的组合物，(i)其中所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；和(ii)其中所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)；或其中所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)。
[0255]
实施方案46.包含信号产生复合物(sgc)的组合物，其中所述组合物包含：(a)靶标探针(tp)对，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的ppa对，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，其中所述第一pa-bsr包含两个区段，(ia)包含第一预扩增子(第一pa)的结合位点的区段和(ib)包含第二pa的结合位点的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第二pa-bsr包含两个区段，(iia)包含所述第二pa的结合位点的区段和(iib)包含所述第一pa的结合位点的区段；(c)多个所述第一pa和多个所述第二pa，其中所述第一pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第二pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第一pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；并且其中所述第二pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)
与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(d)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(e)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成所述sgc。
[0256]
实施方案47.实施方案46所述的组合物，其中所述ppa包含碱基ppa和延伸ppa。
[0257]
实施方案48.实施方案46所述的组合物，其中所述pa包含碱基pa和延伸pa。
[0258]
实施方案49.实施方案46所述的组合物，其中所述amp包含碱基amp和延伸amp。
[0259]
实施方案50.实施方案46-49中任一项所述的组合物，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述第一碱基ppa和所述第一延伸ppa之间和/或所述第一延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa和所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸ppa之间的结合位点包含互补序列；和/或其中所述碱基pa和延伸pa之间的结合位点，和或所述碱基amp和延伸amp之间的结合位点包含互补序列。
[0260]
实施方案51.实施方案46-49中任一项所述的组合物，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系；或其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点和/或所述延伸pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa或amp拴系至所述碱基pa或amp和/或将所述延伸pa或amp彼此拴系。
[0261]
实施方案52.实施方案46-49中任一项所述的组合物，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸ppa拴系至所述第一延伸ppa，并且将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第二延伸ppa。
[0262]
实施方案53.实施方案46-49中任一项所述的组合物，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：所述第一碱基ppa和/或所述第一延伸ppa包括包含所述第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点第四区段(iv)。
[0263]
实施方案54.实施方案46-53中任一项所述的组合物：(i)其中所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述
第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；和(ii)其中所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)；或其中所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)。
[0264]
实施方案55.实施方案33-54中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含第二sgc，其中所述第二sgc包含与实施方案33-54的所述靶标不同的第二靶标，其中所述sgc独立于所述第一sgc的构造包含实施方案33-54中任一项的sgc构造，并且其中所述第二sgc与所述第一sgc是可区分的。
[0265]
实施方案56.实施方案55所述的组合物，其中所述组合物进一步包含第三sgc，其中所述第三sgc包含与实施方案33-54的所述靶标和所述第二靶标不同的第三靶标，其中所述sgc独立于所述第一sgc和/或所述第二sgc的构造包含实施方案33-54中任一项的sgc构造，并且其中所述第三sgc与所述第一和第二sgc是可区分的。
[0266]
实施方案57.实施方案33-56中任一项所述的组合物，其进一步包含与所述tp对结合的靶标核酸。
[0267]
实施方案58.实施方案33-57中任一项所述的组合物，其进一步包含细胞。
[0268]
实施方案59.检测靶标核酸的方法，其包括使样品核酸与用于组装如实施方案33-58中任一项的sgc的组分接触，将sgc组装在所述靶标核酸上，并检测所述靶标核酸。
[0269]
实施方案60.实施方案59所述的方法，其中所述核酸在细胞中。
[0270]
实施方案61.试剂盒，其包含用于组装sgc的组分，其中所述试剂盒包含实施方案33-58中任一项所述的ppa、pa、amp和lp。
[0271]
实施方案62.实施方案61所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含实施方案33-58中任一项所述的tp。
[0272]
实施方案63.固定且透化的细胞的样品，所述细胞包含组装的实施方案33-58中任一项的sgc。
[0273]
实施方案64.载玻片，其上固定化有多个固定且透化的细胞，其包含含有靶标核酸以及组装的实施方案33-58中任一项的sgc的至少一个固定且透化的细胞。
[0274]
实施方案65.检测靶标核酸的方法，其包括(a)使包含靶标核酸的样品与靶标探针(tp)对接触，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)使所述样品与包含所述第一和第二碱基ppa的碱基ppa对接触，其中所述第一碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，和(iii)包含第一延伸预-预扩增子(延伸ppa)的结合位点的区段；并且其中所述第二碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个第二预扩增子结合区段重复(第二pa-bsr)的区段，和(iii)包含第二延伸ppa的结合位点的区段；其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列，并且其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(c)使所述样品
与包含所述第一和第二延伸ppa的延伸ppa组接触，其中所述第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；并且其中所述第二延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；(d)使所述样品与多个预扩增子(pa)接触，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(e)使所述样品与多个扩增子(amp)接触，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)使所述样品与多个标记探针(lp)接触，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成信号产生复合物(sgc)，从而检测所述靶标核酸。
[0275]
66.实施方案65所述的方法，其中所述延伸ppa组包含至少一个额外的第一延伸ppa和至少一个额外的第二延伸ppa，其中所述额外的第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第一延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；其中所述额外的第二延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第二延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；并且其中所述至少一个额外的第一ppa任选地包括包含所述第一延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)，并且所述至少一个额外的第二ppa任选地包括包含所述第二延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序。
[0276]
实施方案67.实施方案65或66所述的方法，其中所述第一碱基ppa与所述第一延伸ppa之间和/或所述延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa与所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸ppa之间的结合位点包含互补序列。
[0277]
实施方案68.实施方案65或66所述的方法，其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系。
[0278]
实施方案69.实施方案65或66所述的方法，其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸ppa拴系至所述第一延伸ppa，并将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第二延伸ppa。
[0279]
实施方案70.实施方案65或66所述的方法，其中所述第一碱基ppa和/或所述第一
延伸ppa包括包含所述第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，其中所述ppa的区段按(i)、(ii)、(iv)、(iii)的顺序。
[0280]
实施方案71.检测靶标核酸的方法，其包括(a)使包含靶标核酸的样品与靶标探针(tp)对接触，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)使所述样品与包含所述第一和第二ppa的ppa对接触，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)使所述样品与多个碱基预扩增子(碱基pa)接触，其中所述碱基pa包括包含四个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段，和(iv)与延伸预扩增子(延伸pa)结合的区段，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)、(iv)的顺序；(d)使所述样品与多个延伸pa接触，其中所述延伸pa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点结合的区段，和(ii)多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)；并且其中所述延伸pa任选地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(e)使所述样品与多个扩增子(amp)接触，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)使所述样品与多个标记探针(lp)接触，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成信号产生复合物(sgc)，从而检测所述靶标核酸。
[0281]
实施方案72.实施方案71所述的方法，其中所述碱基pa和所述延伸pa之间的结合位点包含互补序列。
[0282]
实施方案73.实施方案71所述的方法，其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点和/或所述延伸pa的所述延伸pa结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa拴系至所述碱基pa和/或将所述延伸pa彼此拴系。
[0283]
实施方案74.检测靶标核酸的方法，其包括(a)使包含靶标核酸的样品与靶标探针(tp)对接触，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)使所述样品与包含所述第一和第二ppa的ppa对接触，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第
二pa-bsr是不同的序列；(c)使所述样品与多个预扩增子(pa)接触，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(d)使所述样品与多个碱基扩增子(碱基amp)接触，其中所述碱基amp包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段，和(iii)与延伸扩增子(延伸amp)结合的区段，按(i)、(ii)、(iii)的顺序；(e)使所述样品与多个延伸amp接触，其中所述延伸amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点结合的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；并且其中所述延伸amp任选地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)，其中所述区段按(i)、(ii)、(iii)的顺序；和(f)使所述样品与多个标记探针(lp)接触，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成信号产生复合物(sgc)，从而检测所述靶标核酸。
[0284]
实施方案75.实施方案74所述的方法，其中所述碱基amp与所述延伸amp之间的结合位点包含互补序列。
[0285]
实施方案76.实施方案74所述的方法，其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点和/或所述延伸amp的所述延伸amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸amp拴系至所述碱基amp和/或将所述延伸amp彼此拴系。
[0286]
实施方案77.实施方案65-76中任一项所述的方法，(i)其中所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；并且其中所述区段按(i)、(iii)、(ii)的顺序；和(ii)其中所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)，其中所述区段按(iv)、(i)、(ii)、(iii)的顺序；或其中所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述区段按(iii)、(i)、(ii)的顺序。
[0287]
实施方案78.检测靶标核酸的方法，其包括(a)使包含靶标核酸的样品与靶标探针(tp)对接触，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)使所述样品与包含所述第一和第二ppa的ppa对接触，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，其中所述第一pa-bsr包含两个区段，(ia)包含第一预扩增子(第一pa)的结合位点的区段和(ib)包含第二pa的结合位点的区段，其中所述第一ppa的区段按(i)、(ia)、(ib)的顺序；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第二pa-bsr包含两个区段，(iia)包含所述第二pa的结合位点的区段和(iib)包含所述
第一pa的结合位点的区段，其中所述第二ppa的区段按(i)、(iia)、(iib)的顺序；(c)使所述样品与多个所述第一pa和多个所述第二pa接触，其中所述第一pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第二pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第一pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；并且其中所述第二pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(d)使所述样品与多个扩增子(amp)接触，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(e)使所述样品与多个标记探针(lp)接触，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成信号产生复合物(sgc)，从而检测所述靶标核酸。
[0288]
实施方案79.实施方案78所述的方法，其中所述ppa包含碱基ppa和延伸ppa。
[0289]
实施方案80.实施方案78所述的方法，其中所述pa包含碱基pa和延伸pa。
[0290]
实施方案81.实施方案78所述的方法，其中所述amp包含碱基amp和延伸amp。
[0291]
实施方案82.实施方案78-81中任一项所述的方法，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述第一碱基ppa和所述第一延伸ppa之间和/或所述第一延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa和所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸ppa之间的结合位点包含互补序列；和/或其中所述碱基pa和延伸pa之间的结合位点，和或所述碱基amp和延伸amp之间的结合位点包含互补序列。
[0292]
实施方案83.实施方案78-81中任一项所述的方法，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系；或其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点和/或所述延伸pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa或amp拴系至所述碱基pa或amp和/或将所述延伸pa或amp彼此拴系。
[0293]
实施方案84.实施方案78-81中任一项所述的方法，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸ppa拴系至所述第一延伸ppa，并且将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第二延伸ppa。
[0294]
实施方案85.实施方案78-81中任一项所述的方法，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述第一碱基ppa和/或所述第一延伸ppa包括包含所述第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点第四区段(iv)，其中所述ppa的区段按(i)、(ii)、(iv)、(iii)的顺序。
[0295]
实施方案86.实施方案78-85中任一项所述的方法，(i)其中所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；并且其中所述区段按(i)、(iii)、(ii)的顺序；和(ii)其中所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)，其中所述区段按(iv)、(i)、(ii)、(iii)的顺序；或其中所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述区段按(iii)、(i)、(ii)的顺序。
[0296]
实施方案87.实施方案65-86中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包含第二sgc，其中所述第二sgc包含与实施方案33-54的所述靶标不同的第二靶标，其中所述sgc独立于所述第一sgc的构造包含实施方案33-54中任一项的sgc构造，并且其中所述第二sgc与所述第一sgc是可区分的。
[0297]
实施方案88.实施方案87所述的方法，其中所述组合物进一步包含第三sgc，其中所述第三sgc包含与实施方案65-86的所述靶标和所述第二靶标不同的第三靶标，其中所述sgc独立于所述第一sgc和/或所述第二sgc的构造包含实施方案65-86中任一项的sgc构造，并且其中所述第三sgc与所述第一和第二sgc是可区分的。
[0298]
实施方案89.实施方案65-88中任一项所述的方法，其进一步包含与所述tp对结合的靶标核酸。
[0299]
实施方案90.实施方案65-89中任一项所述的方法，其中所述样品包括包含所述靶标核酸的细胞。
[0300]
实施方案91.检测靶标核酸的方法，其包括(a)使包含靶标核酸的样品与靶标探针(tp)对接触，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二碱基ppa的碱基ppa对，其中所述第一碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，和(iii)包含第一延伸预-预扩增子(延伸ppa)的结合位点的区段；并且其中所述第二碱基ppa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二碱基ppa结合位点结合的区段，(ii)包含多个第二预扩增子结合区段重复(第二pa-bsr)的区段，和(iii)包含第二延伸ppa的结合位点的区段；其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)包含所述第一和第二延伸ppa的延伸ppa组，其中所述第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；并且其中所述第二延伸ppa包括包含两个区段的
核酸序列，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；(d)多个预扩增子(pa)，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(e)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成信号产生复合物(sgc)，从而检测所述靶标核酸。
[0301]
实施方案92.实施方案91所述的方法，其中所述延伸ppa组包含至少一个额外的第一延伸ppa和至少一个额外的第二延伸ppa，其中所述额外的第一延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第一延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第一pa-bsr的区段；其中所述额外的第二延伸ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述第二延伸ppa的结合位点的区段，和(ii)包含多个所述第二pa-bsr的区段；并且其中所述至少一个额外的第一ppa任选地包括包含所述第一延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)，并且所述至少一个额外的第二ppa任选地包括包含所述第二延伸ppa的第二结合位点的第三区段(iii)。
[0302]
实施方案93.实施方案91或92所述的方法，其中所述第一碱基ppa与所述第一延伸ppa之间和/或所述延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa与所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸ppa之间的结合位点包含互补序列。
[0303]
实施方案94.实施方案91或92所述的方法，其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系。
[0304]
实施方案95.实施方案91或92所述的方法，其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸ppa拴系至所述第一延伸ppa，并将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第二延伸ppa。
[0305]
实施方案96.实施方案91或92所述的方法，其中所述第一碱基ppa和/或所述第一延伸ppa包括包含所述第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点第四区段(iv)。
[0306]
实施方案97.检测靶标核酸的方法，其包括(a)使包含靶标核酸的样品与靶标探针(tp)对接触，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第
一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的ppa对，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)多个碱基预扩增子(碱基pa)，其中所述碱基pa包括包含四个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段，和(iv)与延伸预扩增子(延伸pa)结合的区段；(d)多个延伸pa，其中所述延伸pa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点结合的区段，和(ii)多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)；并且其中所述延伸pa任选地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)；(e)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成信号产生复合物(sgc)，从而检测所述靶标核酸。
[0307]
实施方案98.实施方案97所述的方法，其中所述碱基pa和所述延伸pa之间的结合位点包含互补序列。
[0308]
实施方案99.实施方案97所述的方法，其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa的所述延伸pa结合位点和/或所述延伸pa的所述延伸pa结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa拴系至所述碱基pa和/或将所述延伸pa彼此拴系。
[0309]
实施方案100.检测靶标核酸的方法，其包括(a)使包含靶标核酸的样品与靶标探针(tp)对接触，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一预-预扩增子(ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的ppa对，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第一和第二pa-bsr是不同的序列；(c)多个预扩增子(pa)，其中所述pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(d)多个碱基扩增子(碱基amp)，其中所述碱基amp包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段，和(iii)与延伸扩增子(延伸amp)结合的区段；(e)多个延伸amp，其中所述延伸amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点结合的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；并且其中所述延伸amp任选
地包括包含所述延伸pa的结合位点的第三区段(iii)；(f)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成信号产生复合物(sgc)，从而检测所述靶标核酸。
[0310]
实施方案101.实施方案100所述的方法，其中所述碱基amp与所述延伸amp之间的结合位点包含互补序列。
[0311]
实施方案102.实施方案100所述的方法，其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基amp的所述延伸amp结合位点和/或所述延伸amp的所述延伸amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸amp拴系至所述碱基amp和/或将所述延伸amp彼此拴系。
[0312]
实施方案103.实施方案91-102中任一项所述的方法：(i)其中所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；和(ii)其中所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)；或其中所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)。
[0313]
实施方案104.检测靶标核酸的方法，其包括(a)使包含靶标核酸的样品与靶标探针(tp)对接触，其中所述tp对的第一tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含靶标核酸的第一区段的结合位点的区段，和(ii)包含第一碱基预-预扩增子(碱基ppa)的结合位点的区段；并且其中所述tp对的第二tp包括包含两个区段的核酸序列，(i)包含所述靶标核酸的第二区段的结合位点的区段，和(ii)包含第二碱基ppa的结合位点的区段；(b)包含所述第一和第二ppa的ppa对，其中所述第一ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第一tp的所述第一ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第一预扩增子结合区段重复(第一pa-bsr)的区段，其中所述第一pa-bsr包含两个区段，(ia)包含第一预扩增子(第一pa)的结合位点的区段和(ib)包含第二pa的结合位点的区段；并且其中所述第二ppa包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述第二tp的所述第二ppa结合位点结合的区段，和(ii)包含多个第二pa-bsr的区段，其中所述第二pa-bsr包含两个区段，(iia)包含所述第二pa的结合位点的区段和(iib)包含所述第一pa的结合位点的区段；(c)多个所述第一pa和多个所述第二pa，其中所述第一pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第二pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第一pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；并且其中所述第二pa包括包含三个区段的核酸序列，(i)与所述第一pa-bsr互补的区段，(ii)与所述第二pa-bsr互补的区段，和(iii)包含多个扩增子结合区段重复(amp-bsr)的区段；(d)多个扩增子(amp)，其中所述amp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述amp-bsr互补的区段，和(ii)包含多个标记探针结合区段重复(lp-bsr)的区段；和(e)多个标记探针(lp)，其中所述lp包括包含两个区段的核酸序列，(i)与所述lp-bsr互补的区段，和(ii)可检测的区段；其中相应的结合位点和互补区段杂交以形成信号产生复合物(sgc)，从而检测所述靶标核酸。
[0314]
实施方案105.实施方案104所述的方法，其中所述ppa包含碱基ppa和延伸ppa。
[0315]
实施方案106.实施方案104所述的方法，其中所述pa包含碱基pa和延伸pa。
[0316]
实施方案107.实施方案104所述的方法，其中所述amp包含碱基amp和延伸amp。
[0317]
实施方案108.实施方案104-107中任一项所述的方法，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述第一碱基ppa和所述第一延伸ppa之间和/或所述第一延伸ppa之间的结合位点包含互补序列，并且其中所述第二碱基ppa和所述第二延伸ppa之间和/或所述第二延伸ppa之间的结合位点包含互补序列；和/或其中所述碱基pa和延伸pa之间的结合位点，和或所述碱基amp和延伸amp之间的结合位点包含互补序列。
[0318]
实施方案109.实施方案104-107中任一项所述的方法，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的两个部分；并且其中所述第二桥包含与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的两个部分；其中所述桥的结合将所述延伸ppa拴系至所述碱基ppa和/或将所述延伸ppa彼此拴系；或其中所述组合物进一步包含桥，其中所述桥包含两个部分，所述两个部分与所述碱基pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点和/或所述延伸pa或amp的所述延伸pa或amp结合位点结合，其中所述桥的结合将所述延伸pa或amp拴系至所述碱基pa或amp和/或将所述延伸pa或amp彼此拴系。
[0319]
实施方案110.实施方案104-107中任一项所述的方法，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：其中所述组合物进一步包括包含第一桥和第二桥的桥对，其中所述第一桥包含两个部分，(i)与所述第一碱基ppa的所述第一延伸ppa结合位点和/或所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述第二桥包含两个部分，(i)与所述第二碱基ppa的所述第二延伸ppa结合位点和/或所述第二延伸ppa的所述第二延伸ppa结合位点结合的部分，和(ii)与所述第一延伸ppa的所述第一延伸ppa结合位点结合的部分；其中所述桥的结合将所述第二延伸ppa拴系至所述第一碱基ppa或将所述第二延伸ppa拴系至所述第一延伸ppa，并且将所述第一延伸ppa拴系至所述第二碱基ppa或将所述第一延伸ppa拴系至所述第二延伸ppa。
[0320]
实施方案111.实施方案104-107中任一项所述的方法，其中所述碱基和延伸分子通过包含以下的构造进行拴系：所述第一碱基ppa和/或所述第一延伸ppa包括包含所述第二延伸ppa的结合位点的第四区段(iv)，并且其中所述第二碱基ppa和/或所述第二延伸ppa包括包含所述第一延伸ppa的结合位点第四区段(iv)。
[0321]
实施方案112.实施方案104-111中任一项所述的方法：(i)其中所述第一tp进一步包括包含所述第二ppa的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二tp进一步包括包含所述第一ppa的结合位点的第三区段(iii)；和(ii)其中所述第一碱基ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第四区段(iv)；其中所述第二碱基ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第四区段(iv)；或其中所述第一ppa进一步包括包含所述第二tp的结合位点的第三区段(iii)；其中所述第二ppa进一步包括包含所述第一tp的结合位点的第三区段(iii)。
[0322]
实施方案113.实施方案91-112中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包含第二sgc，其中所述第二sgc包含与实施方案91-112的所述靶标不同的第二靶标，其中所述
sgc独立于所述第一sgc的构造包含实施方案91-112中任一项的sgc构造，并且其中所述第二sgc与所述第一sgc是可区分的。
[0323]
实施方案114.实施方案113所述的方法，其中所述组合物进一步包含第三sgc，其中所述第三sgc包含与实施方案33-54的所述靶标和所述第二靶标不同的第三靶标，其中所述sgc独立于所述第一sgc和/或所述第二sgc的构造包含实施方案33-54中任一项的sgc构造，并且其中所述第三sgc与所述第一和第二sgc是可区分的。
[0324]
实施方案115.实施方案91-114中任一项所述的方法，其进一步包含与所述tp对结合的靶标核酸。
[0325]
实施方案116.实施方案91-115中任一项所述的方法，其进一步包含细胞。
[0326]
应当理解，在本文提供的本发明的定义内，还提供了基本上不影响本发明的各个实施方案的活性的修饰。因此，以下实施例旨在说明而非限制本发明。
[0327]
实施例1
[0328]
使用扩增分子延伸检测核酸
[0329]
在使用扩增分子延伸的方法的一个实施方案的示范中，在福尔马林固定石蜡包埋的hela细胞样品中，将单对靶标探针与人rna聚合酶ii亚基a(polr2a)mrna转录物内的短核酸序列的相邻区域杂交。预-预扩增子层被划分在多个分子之间。在图7a中，预-预扩增子被分为两个不同的分子(碱基ppa加一个延伸ppa)。第一预-预扩增子与靶标探针杂交，而第二直接与第一预-预扩增子退火以延伸ppa序列并增加预扩增子杂交结构域(结合区段重复)的数量。在图7b中，预-预扩增子由三个不同的分子(碱基ppa加两个延伸ppa)组成。第一预-预扩增子与靶标探针杂交，第二直接与第一预-预扩增子杂交(如图3b中所述)，且第三直接与第二预-预扩增子杂交。
[0330]
在该实验中，在福尔马林固定石蜡包埋的培养的hela细胞中，使用单对靶标探针检测人polr2a mrna转录物的一小区域。使用三层(三级)放大系统放大信号，并通过直接杂交延伸预-预扩增子序列(如图3b中所描绘)。在图7a中所示的实验中，通过将彼此直接退火将两个预-预扩增子分子结合在一起(碱基ppa加延伸ppa)，从而增加了可用于预扩增子杂交的结合区段重复(bsr)的数量。在图7b中所示的实验中，通过将彼此直接退火将三个预-预扩增子分子结合在一起(碱基ppa加两个延伸ppa)，进一步增加了可用于预扩增子杂交的结合区段重复(bsr)的数量，并因此增加了由每个sgc产生放大能力和总点大小。
[0331]
在这种情况下，由三个分子(碱基ppa加两个延伸ppa；图7b)建立的所得的总预-预扩增子比由两个分子(碱基ppa加一个延伸ppa；图7a)建立的总预-预扩增子序列更长，且所得的增加数量的预扩增子杂交结构域产生了总体上更大的sgc。与图7a相比，这导致图7b中的信号点更大。
[0332]
实施例2
[0333]
使用对称扩增分子检测核酸
[0334]
在使用对称扩增分子以增加每个sgc内的标记探针量的方法的一个实施方案的示范中，将单对靶标探针与人polr2a mrna转录物内短核酸序列的相邻区域杂交。预-预扩增子层与靶标探针对杂交。将两个不同的预扩增子对称地杂交到预-预扩增子层，以允许生成具有增加的放大能力的sgc(参见图4和5)。
[0335]
在该实验中，在福尔马林固定石蜡包埋的培养的hela细胞中，单对靶标探针检测
人polr2a mrna转录物的一小区域，并使用三层放大系统放大信号。在此实施例中，在放大的第二层采用对称协同杂交，使用两个不同的预-预扩增子分子建立两个对称的协同杂交位点，从而允许两个不同的预扩增子以平衡的定向结合，如图5中所描绘。
[0336]
如图8a中所示，在福尔马林固定的石蜡包埋的hela细胞样品中展示了该实施方案。在图8b中，在福尔马林固定的石蜡包埋的人宫颈癌样品中展示了该实施方案。在图8c中，在福尔马林固定的石蜡包埋的人扁桃体样品中展示了该实施方案。
[0337]
实施例3
[0338]
在同一组织样品内检测多个核酸靶标
[0339]
在同时检测同一样品中的多个靶标核酸的示范中，使用本文所述方法的一个实施方案检测了两个不同的核酸靶标，人polr2a(染红色)和人ppib(染绿色)，如图6中所示。
[0340]
在图9a中所示的实验中，在福尔马林固定的石蜡包埋的培养的hela细胞中，一对靶标探针检测到第一靶标，即人rna聚合酶ii亚基a(polr2a)mrna转录物的一小区域(染成红色)，而另一对探针检测到第二靶标，即人肽基脯氨酰异构酶b(ppib)mrna转录物的一小区域(染成绿色)。使用具有直接杂交允许扩增子分子延伸的多层放大系统放大代表每个靶标的信号(参见图6)。在图9b中，使用相同的信号放大方法检测福尔马林固定的石蜡包埋的人结肠癌肿瘤中的人polr2a mrna转录物(染成红色)和人ppib mrna转录物(染成绿色)。
[0341]
在图9a中所示的实验中，使用单个探针对检测福尔马林固定的石蜡包埋的hela细胞中的每个靶标。在图9b中，使用单个探针对检测福尔马林固定的石蜡包埋的人结肠癌组织中的每个靶标。在图9a和9b的每一个中，代表性的“红色”染色用向上的箭头指示，且代表性的“绿色”染色用向下的箭头指示，在整个图像中观察到红色和绿色的染色。在同一样品的hela细胞和人结肠癌组织中均检测到polr2a和ppib mrna两者。
[0342]
在整个本申请中，已经引用了各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用整体并入本申请中，以便更全面地描述本发明所属领域的技术水平。尽管已经参考以上提供的实施例描述了本发明，但是应当理解，可以在不脱离本发明的精神的情况下进行各种修改。

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