一种融合蛋白及一种犬弓形虫亚单位疫苗及其疫苗组合物的制作方法

[0001]
本发明涉及免疫学和生物学领域，具体的说，本发明涉及一种犬弓形虫基因工程亚单位疫苗和制备方法及其应用，主要涉及一种用于犬弓形虫疫苗的核苷酸序列、融合蛋白、疫苗和制备方法及其应用。


背景技术：

[0002]
犬弓形虫又名刚地弓形虫(toxoplasma gondii，t.gondii)，属于原生动物界、顶覆门、孢子虫纲、真球虫目、肉孢子虫科、弓形虫属的单细胞寄生虫，几乎能够侵染所有温血动物的有核细胞，是严格的专性细胞内寄生虫，只有入侵至细胞内的虫体才能进行增殖。弓形虫的发现已有100多年的历史，早在1900年，学者laveran从麻雀体内发现了疑似弓形虫的寄生虫，但当时并未对其命名弓形虫；1908年，nicolle和manceaux报道了从北非刚地梳趾鼠肝脏和脾脏中发现呈月牙形的寄生虫，由此命名为刚地弓形虫。1937年，弓形虫首次在人体中被发现；直至1941年，在一例急性脑炎患者体内分离出一株弓形虫，被并名为弓形虫rh株；1964年，我国发现首例弓形虫病。人和动物感染弓形虫的来源主要是卵囊污染的食物、未被煮熟的含有包囊的肉制品及器官移植等。近年来，在海洋哺乳动物体内发现有弓形虫感染。根据弓形虫的毒力强弱，目前弓形虫被分为三个主要的基因型：ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型；ⅰ型为强毒株，rh株为其代表虫株；ⅱ型和ⅲ型为弱毒株。弓形虫病是由弓形虫引起的一种全世界范围的人兽共患食源性寄生虫病。弓形虫作为一种机会性致病的原虫，在正常情况下，80％～90％的人感染无临床表现或有轻微的流感症状；但当机体在免疫缺陷的情况下(如艾滋病人、器官移植病人或放射治疗的病人)，将会出现为严重的临床症状，甚至引发死亡；另外，孕妇在怀孕期间初次感染弓形虫将会引起胎儿流产、死胎或畸形等。弓形虫在全世界范围内均有分布，全球约有1/3的人口受弓形虫的威胁，但不同国家、地区的感染率差异较大，例如欧洲和南美部分地区的弓形虫感染率高达80％～90％，我国弓形虫的感染率在10％左右。调查发现，癌症患者的感染弓形虫的比率明显高于健康人，尤其肺癌患者感染弓形虫率高达60.94％，其次，宫颈癌患者感染弓形虫率为50％。；而且弓形虫感染可能会导致一些精神性疾病，如精神分裂、自闭症、精神抑郁等。犬作为伴侣动物更是掀起一阵“犬宠物热”，犬作为弓形虫的重要中间宿主，与人接触亲密，成为人类弓形虫病的主要传染源。目前，抗弓形虫的主要药物有磺胺类药物(如磺胺嘧啶和乙胺嘧啶)和螺旋霉素等，主要用于抑制滋养体时期虫体，而且毒副作用较大。总之，弓形虫病严重威胁着人类的健康。
[0003]
迄今为止国内外仍然没有商品化防治弓形虫病的疫苗上市。自上世纪60年代开始，弓形虫疫苗的研制经历了全虫疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗等几个阶段。全虫疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗，全虫灭活疫苗保护率低，因此无实际应用价值；减毒活疫苗存在减毒不充分和毒力返祖等危险，生物安全存在极大的隐患，因此不能广泛使用；亚单位疫苗是从虫体裂解物或排泄-分泌抗原中提取特定组分作为疫苗，具有较好的免疫原性，但纯化费时、费力，并且价格昂贵；核酸疫苗仍旧无法解决免疫原性低的问题，因此普遍研究进展缓慢；基因工程亚单位疫苗是将弓形虫抗原基因在高效表达载体中表达，
从而得到大量纯化的单一抗原，保护率高，生产效率高，生产成本低，且具有极好的生物安全性。综合以上论述可以发现，基因工程疫苗是弓形虫疫苗发展的希望，具有潜在的开发应用价值。


技术实现要素：

[0004]
为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种能用于预防犬感染弓形虫疫病的弓形虫cyp融合蛋白及其疫苗组合物。本发明还提供了含有所述弓形虫cyp融合蛋白的药物组合物，如疫苗组合物。此外，本发明还提供了编码所述融合蛋白的核苷酸以及制备该融合蛋白的方法等。
[0005]
针对目前问题，本发明提供一种用于预防犬弓形虫感染的核苷酸序列、载体、蛋白、疫苗和制备方法及其应用。人工合成弓形虫亲环素cyp突变体基因(本发明所提供的人工合成弓形虫cyp突变体基因即为本发明中所述弓形虫cyp抗原表位突变体的基因)，并将cyp突变体基因转入工程菌进行表达，经诱导后重组抗原获得高效表达，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的基因工程疫苗，能够预防犬弓形虫疫病的流行。
[0006]
1)本发明提供了一种新的能用于预防犬弓形虫的疫苗多肽及其疫苗组合物。含有弓形虫保守结构基因cyp的突变体基因seq id no:1(本发明提供的弓形虫cyp突变体基因，即弓形虫cyp抗原表位突变体基因)，弓形虫cyp突变体基因后面连接一个t细胞表位(seq id no:3)。本发明所提供的用于预防犬弓形虫的蛋白工程疫苗中除了含有主要免疫原性蛋白外，还包含非免疫活性物质。用于本发明的非免疫活性物质主要有纯化标签和c端多聚腺苷酸等，包括his亲和层析纯化标签，gel01佐剂等。本发明中，药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐，抗原融合蛋白缓冲液优选的是pbs缓冲液；佐剂为gel01佐剂；纯化标签及c端多聚核苷酸都是载体上自带的，优选的是pet-28a上所带有的纯化标签及c端多聚核苷酸。
[0007]
2)本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明1)所述的犬弓形虫基因工程亚单位疫苗蛋白。本发明中核苷酸是双链dna形式，通过人工合成方式合成，经过基因工程操作，将基因片段克隆入载体，制备得到重组载体。将重组载体转化入大肠杆菌中，经筛选、发酵、纯化后获得含有预防犬弓形虫病的融合蛋白。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：pcr、限制性内切酶酶切、连接，转化等。核酸设计5
’
端和3
’
端均加入酶切位点，所述的基因操作技术为本领域技术人员所熟知。
[0008]
3)本发明提供了一种载体，其除了含有本发明2)所述的编码犬弓形虫基因工程亚单位疫苗氨基酸的核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达(转录和翻译)所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、核糖体结合位点、增强子、选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。优选实施方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，优选的是pet-28a。
[0009]
4)本发明提供了一种表达菌株，其宿主细胞优选为大肠杆菌，优选的是大肠杆菌bl21(de3)。所述表达菌株含有本发明3)所述的重组载体。宿主细胞经转化含有本发明所述编码融合蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的遗传和表达稳定性后，可用于发酵表达生产所需的犬弓形虫基因工程亚单位疫苗。
[0010]
5)本发明提供了一种犬弓形虫基因工程亚单位疫苗的制备方法，其包括以下步
骤：利用本发明所构建的基因工程菌株bl21(de3)-pet-28a-cyp发酵,诱导表达抗原融合蛋白，经过镍离子亲和层析纯化工艺以及后续乳化工艺，获得制备犬弓形虫基因工程亚单位疫苗所需要的抗原融合蛋白。其中涉及的方法包括但不限制于菌体破碎、离心、澄清、过滤、亲和层析、乳化等。本发明中涉及的制备方法为本领域技术人员所熟知。
[0011]
6)本发明提供了一种用于预防犬弓形虫病的疫苗，其包括本发明1)所述的蛋白以及药学上可接受的载体。本发明所述的药学上可接受的载体为免疫增强剂或免疫佐剂，优选免疫佐剂为gel01佐剂。
[0012]
7)本发明提供了一种用于预防犬弓形虫病的疫苗应用。疫苗可以一定有效剂量进行肌肉注射，皮内或皮下注射免疫犬，能够激发机体的体液免疫反应和细胞免疫。
[0013]
本发明所述弓形虫基因工程亚单位疫苗、弓形虫基因工程疫苗、预防弓形虫的蛋白工程疫苗、预防弓形虫的疫苗、弓形虫蛋白工程疫苗均为本发明的弓形虫亚单位疫苗。优选的，可作为犬弓形虫基因工程亚单位疫苗(犬弓形虫基因工程疫苗、预防犬弓形虫的蛋白工程疫苗、预防犬弓形虫的疫苗、犬弓形虫蛋白工程疫苗、犬弓形虫亚单位疫苗。本发明所述1)-7)优选的，用于制备犬弓形虫疫苗。
[0014]
本发明提供了一种融合蛋白，包括弓形虫cyp蛋白突变体亚单位，所述融合蛋白还包括t细胞抗原表位。t细胞抗原表位显著提高了融合蛋白的免疫原性。
[0015]
优选的是，所述弓形虫cyp突变体蛋白亚单位为弓形虫cyp抗原表位突变体，根据
[0016]
ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)弓形虫亲环素(cyclophilin，cyp)其登录号：kyf42711.1，共含有179个氨基酸，以其作为参照，用dnastar软件分析分析后，cyp本发明通过选取了弓形虫cyp突变体蛋白亚单位的156个氨基酸，即去掉第2～17位氨基酸和第173～179位氨基酸，并将第116～125位氨基酸替换为enagvrkaym，所述弓形虫cyp抗原表位突变体的氨基酸序列为seq id no:2。将其作为弓形虫cyp抗原表位突变体用于构建融合蛋白，与现有技术相比，使所得到的融合蛋白为可溶性表达，而非表达在包涵体中，在有效提高融合蛋白表达量的同时，保持了弓形虫cyp抗原表位突变体的免疫原性。
[0017]
上述任一项优选的是，所述t细胞抗原表位的氨基酸序列为seq id no:4所示的氨基酸序列。本发明所选取的t细胞抗原表位序列用于融合蛋白疫苗的制备，尤其是首次用于犬弓形虫病疫苗的制备，其作用是提高弓形虫cyp抗原表位突变体的免疫原性，同时使弓形虫cyp抗原表位突变体-t细胞抗原表位融合蛋白高效表达，并且所得到的融合蛋白为可溶性表达，而非表达在包涵体中。
[0018]
上述任一项优选的是，所述弓形虫cyp抗原表位突变体的编码序列包含seq id no:1所示的核苷酸序列。上述任一项优选的是，所述t细胞抗原表位的编码序列包含seq id no:3所示的t细胞抗原表位的核苷酸序列。
[0019]
上述任一项优选的是，所述融合蛋白含有1个弓形虫cyp抗原表位突变体和1个t细胞抗原表位。进一步优选的是，所述弓形虫cyp抗原表位突变体的最后一个氨基酸与所述t细胞抗原表位的第一个氨基酸直接连接，所述弓形虫cyp抗原表位突变体的最后一个氨基酸与所述t细胞抗原表位的第一个氨基酸不包含任何连接氨基酸。
[0020]
上述任一项所述的融合蛋白，用于本发明所述的预防犬弓形虫的疫苗多肽及其疫苗组合物、犬弓形虫基因工程亚单位疫苗蛋白、犬弓形虫基因工程亚单位疫苗、犬弓形虫蛋白工程疫苗、预防犬弓形虫病的疫苗。
[0021]
本发明还提供了一种核酸分子，编码上述任一项所述的融合蛋白。
[0022]
优选的是，所述核酸分子的编码序列包括如seq id no:5所示核苷酸序列。
[0023]
上述任一项优选的是，所述核酸分子编码的氨基酸序列为seq id no:6所示氨基酸序列。
[0024]
本发明还提供了一种弓形虫亲环素融合蛋白组合物，包含上述任一项所述的融合蛋白和/或上述任一项的核酸分子所编码的氨基酸序列。
[0025]
优选的是，所述弓形虫亲环素融合蛋白组合物用于预防犬感染弓形虫疫病，或上述任一项所述的融合蛋白和/或上述任一项的核酸分子所编码的氨基酸序列用于预防犬感染弓形虫疫病。
[0026]
本发明还提供了一种犬弓形虫亚单位疫苗及其疫苗组合物，包含上述任一项所述的融合蛋白和/或上述任一项所述的核酸分子编码的氨基酸序列。
[0027]
优选的是，所述犬弓形虫亚单位疫苗及其组合物用于预防犬感染弓形虫。
[0028]
本发明的犬弓形虫基因工程亚单位疫苗，其融合基因分为两部分，第一部分：选取了弓形虫cyp部分基因通过dnastar软件进行了密码子优化，其序列为seq id no:2，称之为cyp突变体基因；第二部分：选取一个t细胞抗原表位，将以上两个基因拼接在一起形成一个cyp融合基因，将该基因插入大肠杆菌表达载体进行表达、纯化后获得重组的融合蛋白，加入佐剂制备成犬弓形虫基因工程亚单位疫苗。可以预防犬感染弓形虫病。优选的是，所述疫苗组合物还包括非活性物质和药学上可接受的盐，进一步优选的是，所述疫苗组合物含有免疫佐剂，进一步优选的是所述免疫佐剂为gel01佐剂。
[0029]
在现有技术中，弓形虫疫苗还没有成功的产品上市。弓形虫具有很多型分型，像其他细菌或病毒一样，每一个物种都是分很多型号，或者是基因型，或者是血清型，各种血清型或基因型下面还会有各种分离株。而不同分型，不同分离株的基因型存在差别，因此，在已有的科学研究中，关于可用于制备弓形虫疫苗的抗原片段种类非常多，抗原片段长度的选择也各不相同，因此，不同研究中抗原片段的选择都是随机的，是否能够有好的效果，都要看最后免疫动物的结果来验证。本发明在不计其数的抗原片段选择中，选用本发明所提供的弓形虫cyp抗原表位突变体，同时与t细胞表位基因融合，制备得到的疫苗经过实验验证能够有效的保护动物，并优选的可作为犬弓形虫病的预防疫苗。
[0030]
本发明的有益技术效果在于，提供了一种弓形虫cyp抗原表位突变体-t细胞表位融合蛋白以及一种用于预防犬感染弓形虫的疫苗及其疫苗组合物，与现有技术相比，所述融合蛋白可在菌液上清中可溶性表达，具有高表达量、高免疫原性的特点。所述疫苗及疫苗组合物，可有效预防犬感染弓形虫并且疫苗稳定性高。
附图说明
[0031]
图1.弓形虫cyp抗原表位突变体基因与t细胞抗原表位基因的融合基因扩增结果。
[0032]
图2.弓形虫cyp融合基因重组表达蛋白的sds-page结果。
[0033]
图3.弓形虫cyp融合基因重组表达蛋白纯化sds-page结果。
[0034]
图4.弓形虫cyp融合基因重组表达蛋白western blot结果。
具体实施方式
[0035]
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。除特殊说明，所使用的试剂、载体、菌体、细胞均为现有技术中熟知的商业化产品。
[0036]
实施例1：弓形虫重组蛋白原核表达载体的构建，根据ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)弓形虫亲环素(cyclophilin，cyp)其登录号：kyf42711.1，共含有179个氨基酸，以其作为参照，用dnastar软件分析后，去掉第2～17位氨基酸和第173～179位氨基酸，去掉两端对蛋白结构域影响较小的无规则卷曲序列，不但对蛋白的生物学功能影响小，还能够提高蛋白的稳定性。将第116～125位氨基酸替换为enagvrkaym，可有效提高蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达效力，最后组成的氨基酸序列为seq id no:2，在弓形虫亲环素突变体后面偶联一个t细胞表位,形成弓形虫亲和素突变体融合蛋白，其氨基酸序列为seq id no:6。根据弓形虫亲和素突变体融合蛋白的氨基酸序列设计其基因序列为seq id no:6，根据原核表达载体pet-28a物理图谱设计引物并引入酶切位点bamh i和hind iii。
[0037]
上游：ggatccatggaaaatgccggagtc
[0038]
下游：aagctttggctcctttggaaagattt
[0039]
(在此需要指出，虽然通过软件分析进行序列的优化是一种常规的技术手段，但是对于本领域普通技术人员来说也很清楚，软件分析所得到的序列只是一个推测，并不一定能够保证蛋白的可溶性表达，更不能确保所获得的蛋白能够保留其免疫原性，因此，本发明所得到的突变序列能够用于犬弓形虫病疫苗的制备，是付出了创造性劳动所获得的成果)。
[0040]
本发明中人工合成弓形虫cyp基因突变体基因与t细胞表位基因串联的融合基因(弓形虫cyp抗原表位突变体基因与t细胞抗原表位基因的融合基因以下简称为弓形虫cyp融合基因)。其基因序列为sed id no:5，以其为模板进行pcr扩增，pcr参数为：94℃变性5min；94℃变性30s；55℃复性40s，72℃延伸50s，35个循环后于72℃延伸5min)，将获得的pcr扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，检测结果显示：在5260bp附近出现相应的目的条带，与弓形虫cyp融合基因片段的大小相符。将目的片段使用dna凝胶回收试剂盒回收，并将回收后的目的基因片段分别连接至pmd18-t载体，以构建pmd18-t-cyp克隆载体。连接体系为：目的基因20μl、pmd18-t载体0.5μl、连接酶缓冲液2.0μl、t4dna连接酶1.0μl、灭菌双蒸水8.5μl；反应条件为：16℃、30min。将连接产物加入dh5α感受态细胞，冰上放置30min，然后42℃加热45s，置冰上1min，加入890μl的lb液体培养基，37℃振荡培养60min，将培养物接种含100μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂培养板，37℃培养过夜。观察结果显示：lb固体培养基均出现白色小菌落。挑白色典型菌落，分别接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，200rpm培养10h。使用质粒回收试剂盒提取各转化菌质粒，将其命名为pmd18-t-cyp，并进行酶切鉴定。酶切鉴定结果显示：pmd18-t-cyp酶切后，出现516bp左右的弓形虫cyp融合基因片段。将酶切正确的质粒送基因公司测序，测序结果表明：扩增序列为弓形虫cyp融合基因，并且目的基因和载体连接正确。将pmd18-t-cyp重组质粒、pet-28a表达载体，分别使用bamhi、hindiii双酶切，酶切产物电泳后使用dna回收试剂盒回收弓形虫cyp融合基因片段、
pet-28a基因片段，使用dna连接试剂盒，将cyp融合基因片段、pet-28a基因连接，构建pet-28a-cyp表达载体。将pet-28a-cyp载体导入bal21(de3)感受态细胞并使用lb培养基培养过夜。使用质粒提取试剂盒提取培养菌质粒，获得原核表达质粒pet28a-cyp。融合基因pcr大小为516bp。其结果如图1所示，将质粒进行双酶切鉴定和pcr鉴定，其中各泳道上样顺序分别为：标记物(marker，m)：dl2000 marker；1、重组质粒双酶切鉴定；2、重组质粒pcr鉴定。
[0041]
实施例2：弓形虫cyp融合蛋白的表达与纯化
[0042]
(1)弓形虫cyp融合蛋白的可溶性表达
[0043]
以转化了重组质粒pet-28a-cyp的e.coli bl21(de3)单菌落为犬弓形虫疫苗的工程菌株(bl21(de3)-pet-28a-cyp)，以转化了pet-28a空载体的e.coli bl21(de3)单菌落为空白对照菌株(bl21(de3)-pet-28a)，将以上两种菌株按照1％(v/v)接种量分别接种于含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基100ml，37℃、180rpm培养6-8h，使细菌od
600
在0.6-1.0之间，加入iptg，使终浓度为0.2mmol/l，继续培养5h，离心收集菌体，菌体用10ml可溶性蛋白裂解液悬浮，加入100μl 0.1m pmsf，反复冻融菌体2次(-80℃,1h/37℃,10min)后，400w超声处理30min，离心取上清即为可溶性蛋白(具有活性的蛋白)。将上述两种上清进行sds-page检测以验证疫苗工程菌株目的蛋白的表达，如图2所示，在18kd左右，犬弓形虫疫苗的工程菌株有目的蛋白的表达，而空白对照没有，图2中：m,蛋白marker；1,bl21(de3)-pet-28a空白对照；2,bl21(de3)-pet-28a-cyp。
[0044]
(2)融合表达蛋白的纯化
[0045]
将收集的菌体重悬于10ml破菌缓冲液a(1*pbs ph7.4)，放于恒温摇床内220r/分钟、16℃重悬10分钟，利用超声破碎仪200w，冰浴超声破碎10分钟，破碎条件为：超声功率400瓦，工作5秒，间歇5秒，直至菌液澄清，即将重悬的细菌完全破碎，将破碎液12000r/分钟、4℃离心30分钟，取上清。将5ml镍柱(ge公司提供)使用a液(1*pbs，ph7.4)平衡至稳定，使用a液冲洗系统(akta系统explore 100)，流速20ml/分钟，冲洗2分钟，将平衡后的镍柱连接至上样接口，以流速1ml/分钟流穿样品，共10分钟，使目的蛋白挂柱。流穿结束后，将已挂有目的蛋白的镍柱连接至洗脱接口，首先用a液平衡镍柱，流速1ml/分钟平衡10分钟直至紫外吸收峰低于200mau，洗掉未结合的杂蛋白。保持流速不变，设置洗杂条件，增加b液(1*pbs、1mol/l咪唑ph7.4)浓度梯度为2％，即咪唑浓度为20mmol/l,平衡时间20分钟直至紫外吸收峰低于200mau。保持流速不变，将收集器时间归零，改变洗脱条件，b液浓度为30％，即咪唑浓度为300mmol/l，收集6分钟至10分钟洗脱液。最终结果在6分钟至10分钟之间出现目的蛋白峰，收集目的蛋白，bca蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，其浓度为7.5mg/ml,表达量为120mg/l，其结果见图3，图3中：m：蛋白质maker；1～2：上清；3：流穿峰；4～5：洗杂峰；6～9：洗脱的弓形虫cyp融合蛋白
[0046]
实施例3：western blot鉴定
[0047]
对将bl21(de3)-pet-cyp工程菌诱导表达的融合蛋白进行western blot鉴定。sds-page电泳。转膜：按照凝胶的大小剪出pvdf膜(略大于凝胶大小)，连同凝胶一同浸于膜转移缓冲液中平衡10分钟。按照滤纸/凝胶/pvfd膜/滤纸，凝胶侧放于负极面。以凝胶面积算出电流大小，接通电源，1小时后，取出pvdf膜。用tbst buffer洗pvdf膜，每次5分钟，室温水平缓慢摇动，共三次。将pvdf膜转移至封闭缓冲液中，室温水平缓慢摇动1小时。将pvdf膜加入至稀释后犬弓形虫抗体血清中，室温水平缓慢摇动1～2小时或4℃过夜。将pvdf膜加入
至稀释后hrp标记羊抗犬二抗，室温水平缓慢摇动1小时。显色：按照dab显色试剂盒操作说明书操作。目的蛋白于18kd处应出现特异性条带。
[0048]
其结果如图4，m：预染marker iii；1,bl21(de3)-pet-28a-cyp。
[0049]
实施例4：疫苗的制备
[0050]
将纯化好的弓形虫cyp融合蛋白抗原cyp和弓形虫亲cyp蛋白抗原(氨基酸未进行突变)的两种蛋白分别经0.22微米除菌过滤器过滤除菌，将其分装置两个已高压灭菌并进行内毒素处理的灌体中。用无菌且无内毒素0.01mol/l pbs(ph7.4)将两种抗原蛋白均稀释至120μg/ml，再将gel01佐剂分别装至另两个乳化灌中，121℃维持40分钟高压灭菌。利用压缩空气分别将两个抗原蛋白注入两个乳化罐中，水相与油相比例为1:9。乳化条件设置：25℃，搅拌速度90rpm，搅拌30分钟。疫苗进行无菌检验合格，内毒素含量低于100eu/1ml，将乳化好的疫苗以12000rpm离心1min，疫苗未出现分层现象，说明疫苗稳定性良好。两种疫苗分别命名为cyp-1(弓形虫cyp融合蛋白),cyp-2(弓形虫cyp蛋白抗原未进行氨基酸突变)。
[0051]
实施例5:弓形虫rh株速殖子培养及纯化
[0052]
将液氮保存的弓形虫速殖子取出后，放入37℃水浴锅中，在水中缓慢摇动冻存管，使弓形虫的冻存液溶解，约2分钟，待其溶解后，将计数后取1
×
105个速殖子接种入t25细胞培养瓶生长良好的单层vero细胞中，4小时后换液，37℃5％co2恒温培养箱培养，每隔24小时换液。培养4-7天，观察到细胞全部破碎，弓形虫全部溢出细胞后收集弓形虫速殖子并计数。弓形虫速殖子收集方法：用细胞刮将弓形虫从细胞瓶中刮下，1000g离心10分钟，用2ml rpmi1640培养基重悬，分别用20g、27g针头的注射器吹打2遍，轻轻加入到45％percoll(sigma)的上层，1000g，离心30分钟。去上层液体，下层液体再用0.01mol/l的pbs洗涤2-3遍，每次2000g离心20分钟，除去上层液体，加入1ml的0.01mol/l的pbs重悬并计数，每瓶细胞至少收集5
×
106个弓形虫速殖子。
[0053]
实施例6:犬弓形虫重组亚单位疫苗的效力检验
[0054]
3月龄比格犬15只，随机分成3组：每组5只。第一组为cyp-1疫苗组，第二组为cyp-2疫苗组，第三组为攻毒对照组，弓形虫rh株速殖子疫作为强毒。疫苗组每只犬肌肉注射2ml疫苗，14日后按相同接种剂量和途径第二次免疫。二免后14天，疫苗组及攻毒对照组每只犬以耳缘静脉注射方式攻虫1
×
102个，攻虫后10天进行剖检。分别取心、肝、脾、肺、肾、脑、生殖器(睾丸或子宫)、舌肌、腹膜肌、颈下淋巴结，将以上组织研磨后进行基因组提取，然后进行槽式pcr检测弓形虫p30基因。每只犬任何一个组织检测到弓形虫p30基因即判定为感染。疫苗组每组5只犬应至少有3只不感染，对照组5只应至少有4只感染。其结果见表1。
[0055]
表1重组弓形虫cyp融合蛋白免疫后对受试动物(犬)的保护效应
[0056]
分组免疫途径免疫次数(次)犬感染数量保护率cyp-1疫苗组肌肉注射20100％cyp-2疫苗组肌肉注射2180％攻毒对照组
ꢀꢀ
50％
[0057]
通过以上结果显示，cyp-1疫苗组，攻毒后，5只比格犬均未发生感染，cyp-2疫苗组有一只犬发生弓形虫感染。阴性对照组攻毒后，5只比格犬全部发生感染，说明cyp-1疫苗的保护效果最佳。
[0058]
实施例7：犬弓形虫重组亚单位疫苗的安全性检验
[0059]
将cyp-1疫苗肌肉注射3月龄比格犬5只，4ml/只，观察14日，疫苗注射后没有出现局部不良反应及全身的不良反应，说明cyp-1疫苗安全。
[0060]
综合上述实验结果，本发明提供的犬弓形虫基因工程亚单位疫苗具有有效的保护效果并且安全稳定，可以用于预防弓形虫病，尤其是可以用来作为犬弓形虫病的预防疫苗。
[0061]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。本发明所使用的化学试剂均未可商业化购买得到的滑雪试剂，如sigmaaldrich等。所使用的实验技术如无特殊说明均记载于《分子克隆实验指南》等实验技术手册中。

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