长链非编码RNALINC01207在前列腺癌治疗中的新用途的制作方法

长链非编码rna linc01207在前列腺癌治疗中的新用途
技术领域
[0001]
本发明涉及细胞生物学、基因组学及生物信息学领域的相关技术领域，属于长链非编码rna linc01207在前列腺癌治疗中的新用途。


背景技术：

[0002]
长链非编码rna(lncrnas)在基因调控、基因组稳定性以及癌细胞的生存、增殖和迁移等方面发挥着重要作用，目前现了长链非编码rna linc01207 通过下调microrna-1972和上调lim和sh3蛋白1促进前列腺癌细胞生长和转移，为前列腺癌治疗提供新的生物标志物。


技术实现要素：

[0003]
针对上述问题，本发明的目的是：发现了长链非编码rna linc01207通过下调microrna-1972和上调lim和sh3蛋白1促进前列腺癌细胞生长和转移，为前列腺癌治疗提供新的生物标志物。成为一种治疗前列腺癌的新用途。
[0004]
本发明的技术方案是：长链非编码rna linc01207通过下调 microrna-1972和上调lim和sh3蛋白1促进前列腺癌细胞生长和转移，为前列腺癌治疗提供新的生物标志物。
[0005]
本发明的过程：
[0006]
利用基因芯片技术筛选前列腺癌差异表达基因；
[0007]
rt-qpcr检测linc01207、mir-1972、lim和sh3蛋白1(lasp1)在前列腺癌组织和细胞系中的表达；
[0008]
采用rna-fish、rip和双荧光素酶报告法研究了inc01207、mir-1972和 lasp1之间的相互作用；
[0009]
用mir-1972模拟物/抑制剂、oe/si-linc01207或si-lasp1转染pc-3和 du145细胞，观察其增殖、迁移、侵袭、凋亡及细胞周期；
[0010]
体内检测裸鼠肿瘤形成能力。
[0011]
本发明的有益效果：首次发现长链非编码rna linc01207通过下调 microrna-1972和上调lim和sh3蛋白1促进前列腺癌细胞生长和转移，为前列腺癌治疗提供新的生物标志物。成为一种治疗前列腺癌的新用途。
附图说明
[0012]
图1linc01207在前列腺癌中高表达。
[0013]
a、前列腺癌相关表达数据集gse26910；
[0014]
b、前列腺癌相关表达数据集gse55945中linc01207表达图；
[0015]
c、在gepia数据库中linc01207在前列腺癌中的表达；
[0016]
d、rt-qpcr检测linc01207在前列腺癌组织及癌旁正常组织中的表达 (n＝62)；
[0017]
e、rt-qpcr法检测linc01207在前列腺癌细胞株(pc-3和du145)和正常前列腺上皮
细胞株(rwpe-1)中的表达；
[0018]
图2下调linc01207对前列腺癌细胞生长、转移及肿瘤形成的抑制作用。
[0019]
a、前列腺癌细胞增殖检测edu法的代表性图像及定量分析(200
×
，比例尺＝50μm)；
[0020]
b、tunel法检测前列腺癌细胞凋亡的代表性图像和定量分析(400
×
，比例尺＝25μm)；
[0021]
c、流式细胞术检测前列腺癌细胞周期的代表性图像和定量分析；
[0022]
d、前列腺癌细胞迁移划痕试验的代表性图像及定量分析；
[0023]
e、前列腺癌(200
×
，比例尺＝50μm)细胞浸润的典型图像及定量分析；
[0024]
f、代表性形象裸鼠肿瘤形成；
[0025]
g、裸鼠注射du145细胞后40天肿瘤形态的典型图像(n＝12)；
[0026]
h、裸鼠肿瘤体积；
[0027]
i、裸鼠肿瘤重量的定量分析(n＝12)；
[0028]
图3linc01207对mir-1972有负调控作用。
[0029]
a、diana tools和regna2数据库用于筛选mir-1972与linc01207的结合位点，在线预测网站用于预测mir-1972与linc01207的结合位点；
[0030]
b、rna-fish检测前列腺癌细胞中linc01207的亚细胞定位(400
×
，比例尺＝25μm)；
[0031]
c、rip评估ago2与linc01207和mir-1972的结合；
[0032]
d、双荧光素酶报告法验证linc01207与mir-1972的相互作用；
[0033]
e、rna下拉检测linc01207与mir-1972的结合关系；
[0034]
f、rt-qpcr检测转染oe-linc01207或si-linc01207质粒的前列腺癌细胞株pc-3和du145中mir-1972的表达；
[0035]
图4linc01207通过竞争性结合mir-1972促进前列腺癌细胞的生长和转移。
[0036]
a、rt-qpcr检测mir-1972在前列腺癌组织及癌旁正常组织中的表达 (n＝62)；
[0037]
b、rt-qpcr检测mir-1972在前列腺癌细胞株(pc-3和du145)和正常前列腺上皮细胞株(rwpe-1)中的表达。pc-3和du145细胞系用mir-1972模拟和/或oe-linc01207处理；
[0038]
c、edu法评价细胞增殖的代表性图像及定量分析(200
×
，比例尺＝50μm)；
[0039]
d、tunel法检测细胞凋亡的代表性图像和定量分析(200
×
，比例尺＝50 μm)；
[0040]
e、流式细胞仪检测细胞周期的代表性图像和定量分析；
[0041]
f、代表性图像及划痕定量分析检测细胞迁移；
[0042]
g、代表性图像和定量分析检测细胞侵袭(200
×
，比例尺＝50μm)；
[0043]
图5linc01207通过与mir-1972结合调节lasp1的表达。
[0044]
a、mirdip、targetscan、mirdb和raid数据库交叉筛选mir-1972靶基因；
[0045]
b、一个预测mir-1972和lasp1结合位点的生物预测网站；
[0046]
c、双报告分析评估mir-1972与lasp1的靶向关系；
[0047]
d、rt-qpcr检测mir-1972模拟物或抑制剂对pc-3和du145细胞lasp1 表达的影响；
[0048]
e、western blot检测mir-1972模拟物或抑制剂对pc-3和du145细胞 lasp1表达的影响；
[0049]
f、lasp1在pc-3和du145中的表达，rt-qpcr检测oe-linc01207或 si-linc01207处理的细胞；
[0050]
g、western blot法检测经oe-linc01207或si-linc01207处理的pc-3 和du145细胞中lasp1的表达；
[0051]
h、免疫组化法检测前列腺癌组织及癌旁正常组织中lasp1的表达(400
ꢀ×
，比例尺＝25μm)；
[0052]
图6下调linc01207通过降低lasp1的表达抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。
[0053]
a、edu法评价细胞增殖的代表性图像及定量分析(200
×
，比例尺＝50μm)；
[0054]
b、tunel法检测细胞凋亡(200
×
，比例尺＝50μm)；
[0055]
c、代表性图像和定量分析，流式细胞术检测细胞周期的代表性图像和定量分析；
[0056]
d、代表性图像及划痕定量分析检测细胞迁移；
[0057]
e、代表性图像和定量分析检测细胞侵袭(200
×
，比例尺＝50μm)；
[0058]
图7沉默linc01207通过下调lasp1和上调mir-1972对前列腺癌的生长和转移具有抑制作用。
具体实施方式
[0059]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0060]
实施例：
[0061]
1、利用基因芯片技术筛选前列腺癌差异表达基因。
[0062]
1)前列腺癌相关基因表达数据集(gse26910和gse55945)及其注释探针文件从基因表达综合数据库(geo)下载。以|logfc|>1和p<0.05为筛选标准，利用r语言的limma软件包进行差异分析，筛选出前列腺癌差异表达基因。随后，用r语言中的“expression.r”包构建差异基因表达盒图。
[0063]
2)结果：根据对前列腺癌相关基因表达数据集(gse26910和gse55945) 的分析，结合gepia数据库，发现linc01207在前列腺癌中上调(图1a-c)
[0064]
2、rt-qpcr检测linc01207、mir-1972、lim和sh3蛋白1(lasp1)在前列腺癌组织和细胞系中的表达。
[0065]
1)细胞及试剂
[0066]
实验所需前列腺相关细胞(rwpe-1、pc-3和du-145)购于中科院上海细胞库，1640培养基、胰酶及胎牛血清购于美国hyclone公司；trizol购于美国invitrogen公司；引物购自中国广州锐博生物科技有限公司；cdna逆转录试剂盒、荧光定量pcr试剂盒购自中国大连宝生物公司。
[0067]
2)荧光定量pcr
[0068]
参照说明书，用trizol从临床标本、培养细胞中提取总rna，用分光光度计测定rna浓度和纯度。然后，rna用试剂盒转录成cdna。由广州锐博生物科技有限公司设计合成了
linc01207、microrna-1972、lasp1、u6的引物。产品经实时荧光qpcr(sybr)处理，使用7500荧光qpcr仪器(美国abi公司)进行扩增，基因的相对表达通过相对定量的2-δδct方法测定。
[0069]
3)结果：rt-qpcr显示linc01207在前列腺癌组织中的表达高于癌旁正常组织(p<0.05)(图1d)。linc01207在前列腺癌细胞系中也有高表达(p<0.05) (图1e)。总之，上述结果证明linc01207在前列腺癌中有高表达。
[0070]
3、采用rna-fish、rip和双荧光素酶报告法研究了inc01207、mir-1972 和lasp1之间的相互作用。
[0071]
1)用fish试剂盒检测linc01207的亚细胞定位(f.hoffmann la rocheltd.，巴塞尔，瑞士)。用4％多聚甲醛固定细胞，与地高辛(sigma， st.louis，mo，usa)和linc01207探针杂交液一起孵育，用4'，6-二氨基-2
-ꢀ
苯基吲哚(sigma，st.louis，mo，usa)染色10分钟，然后用激光共聚焦扫描显微镜(fv1000，奥林巴斯，东京，日本)
[0072]
2)使用rip试剂盒(merckmillipore，billerica，ma，usa)检测linc01207 与argonaute2(ago2)蛋白的结合。用ripa裂解缓冲液(p0013b， beyotimebiotechnology ltd.，shanghai，china)在冰浴中裂解细胞5分钟。上清液在14000rpm和4℃离心10分钟后收集。取一部分细胞提取物作为输入，剩余部分用兔抗ago2多克隆抗体(ab32381，1:10000，abcam公司，英国剑桥)或兔抗igg多克隆抗体(ab202985，1:1000，英国剑桥abcam公司)，作为nc。50μl磁珠用100μlof rip-wash缓冲液再悬浮，然后用5μl抗体孵育。将磁珠抗体复合物洗涤，再悬浮于900μl rip-wash缓冲液中，并与 100μl细胞提取物在4℃孵育过夜。将样品放置在磁性支架上以收集磁珠蛋白复合物。分别用蛋白酶k处理样品和输入，提取rna进行rt-qpcr检测。
[0073]
3)基于生物预测网站，分析了linc01207与mir-1972、lasp1与mir-1972 的关系，然后通过双荧光素酶报告分析进行验证。根据linc01207与lasp1 mrna 3'非翻译区(3'utr)或mir-1972的结合序列，分别设计了靶序列和突变序列，并将其插入psicheck-2载体。293t细胞以2
×
105细胞/孔的速度被镀成6孔板。细胞贴壁后，将报告质粒与mir-1972模拟或阴性对照(nc)模拟共转染293t细胞(中国科学院上海细胞库，上海)。转染48小时后，基因公司的双荧光素酶检测试剂盒(d010，北京索拉比奥科技有限公司，北京，中国)使用glomax 20/20光度计(美国威斯康星州麦迪逊市promega公司) 检测荧光素酶活性。
[0074]
4)结果：基于regrna2.0和diana工具，推测mir-1972可能与linc01207 结合(图3a)。rna-fish显示linc01207位于细胞质中(图3b)。rip证明，与igg相比，ago2能够富集mir-1972和linc01207(图3c)。此外，使用双荧光素酶报告分析来验证linc01207是否是mir-1972的靶点(图3d)。结果表明，在mir-1972模拟物存在下，linc01207-wt的荧光素酶活性为。此外， rna下调显示bio-mir-1972-wt显著增加了linc01207的富集(p<0.05)，而 bio-mir-1972-mut对linc01207的富集没有影响(p>0.05)(图3e)。另外， rt-qpcr显示在前列腺癌中mir-1972的表达在沉默linc01207后升高，在过度表达linc01207后降低(p<0.05)(图3f)。以上结果表明，linc01207 过表达抑制mir-1972的表达，linc01207与mir-1972竞争性结合。
[0075]
4、用mir-1972模拟物/抑制剂、oe/si-linc01207或si-lasp1转染pc-3 和du145细胞，观察其增殖、迁移、侵袭、凋亡及细胞周期。
[0076]
1)蛋白定量测定
[0077]
置于1.5ml离心管中，预冷pbs溶液洗涤3次后加入含1％蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，于冰上裂解30min后，4℃，12000*g，离心30min，吸取上清液。采用bca法测定蛋白浓度，用超纯水稀释调整蛋白浓度为4ug/ml，然后分别与5
×
溴酚蓝上样缓冲液按4:1混合，煮沸5min。按照每泳道20ul加入到蛋白凝胶中，80v电压电泳30min，100v电压电泳，观察溴酚蓝进入分离胶底端时，终止电泳。90v电压转膜90min，5％脱脂奶粉在室温孵育90min后，用pbs加吐温20(pbs plus tween 20，tpbs)洗涤3次，每次5min。一抗按1：1000比例稀释。聚偏二氟乙烯膜孵育一抗于4℃过夜，用tpbs洗涤3 次，每次5min。二抗1：2000比例稀释，聚偏二氟乙烯膜孵育二抗于室温2h。western印迹发光试剂显色，暗室曝光显像于胶片上。应用图像分析软件 quantity one对显色条带进行灰度分析。以gapdh为内参计算各组蛋白的相对表达量。
[0078]
2)transwell实验
[0079]
细胞转染24小时后制成单细胞悬液。细胞在无血清培养基中再悬浮。将每组200μl细胞悬液加入基质凝胶包被的尖腔，基底外侧加入含有100ml/l 胎牛血清的培养基。培养48h后，用乙醇固定，结晶紫染色。将腔室的基底膜风干并在显微镜下进行检查，随机选取6个视野，通过拍摄照片获得平均值。
[0080]
3)流式细胞技术
[0081]
转染24小时后，用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶分离细胞，以2500rpm 离心5分钟。通过离心收集细胞，然后在4℃下用预先冷却的3ml70％乙醇固定过夜。离心细胞第二天再次用0.5mg/ml碘化丙啶染色液染色。接下来，通过细胞过滤器对细胞进行过滤，并用流式细胞仪进行处理。在波长大于575nm 处检测碘化丙二钠，用细胞周期分布百分率检测细胞凋亡。
[0082]
4)免疫组织化学
[0083]
石蜡包埋组织切片4μm，二甲苯脱蜡，乙醇脱水，抗原回收。此后，切片用亲和素孵育10分钟，在d-生物素溶液中孵育10分钟，用内源性过氧化物酶阻滞剂封闭15分钟，用10％山羊血清封闭10分钟，然后用稀释的兔抗 lasp1单克隆抗体(ab156872，1:100)在4℃下过夜，然后用生物素标记的山羊抗兔igg(ab150077，1:1000(均来自英国剑桥abcam公司)孵育10分钟。随后，用链霉素-亲和素-过氧化物酶溶液在37℃下孵育10分钟，并用新制备的二氨基联苯胺进行观察。在显影约20s后，反应在水中终止。随后，在显微镜下观察切片，如前所述半定量计分lasp1的表达。
[0084]
5)5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(edu)测定
[0085]
细胞以5
×
103个/孔的速度被镀成96孔板。6h后，用edu孵育细胞2h (100μl/孔)。然后用4％多聚甲醛(100μl/孔)固定细胞30分钟，用2mg/ml 甘氨酸孵育5分钟，用0.5％tritonx-100pbs(100μl/孔)孵育10分钟。最小值用1
×
apollo染色反应液(100μl/孔)在黑暗中孵育30min，渗透剂3 次，甲醇5min后，用1
×
hoechst 33342反应液(100μl/孔)在室温下孵育 30min，并用抗荧光猝灭安装介质(100μl/孔)密封。在荧光显微镜下拍摄图像，记录edu标记的细胞数。edu标记率(％)＝阳性细胞数/(阳性细胞数+ 阴性细胞数)
×
100％
[0086]
6)tdt介导的dutp生物素缺口末端标记(tunel)法
[0087]
细胞在37℃的盖玻片上培养24小时，用4％多聚甲醛固定60分钟，用含 0.1％
triton x-100的pbs在冰浴中渗透2分钟，然后用tunel检测液在37℃黑暗中培养60分钟。最后，用抗荧光猝灭安装介质对细胞进行封闭，并在荧光显微镜下对细胞进行观察。随机选取5个，计数凋亡细胞数。
[0088]
7)结果
[0089]
下调linc01207抑制前列腺生长、转移和肿瘤发生癌细胞(图2a-e)。 linc01207吸附mir-1972促进前列腺癌细胞生长和转移(图4a-g)。linc01207 调节lasp1的表达(图5a-i)。抑制linc01207通过下调lasp1抑制前列腺癌细胞的生长和转移(图6a-e)。
[0090]
5、体内检测裸鼠肿瘤形成能力(图2f)
[0091]
将稳定转染si-nc或si-linc01207质粒的du145细胞制成单细胞悬液，注入裸鼠体内。每天观察小鼠肿瘤形成情况。每隔5天用游标卡尺测量肿瘤的长短径。40天后，对裸鼠实施安乐死，切除皮下肿瘤，拍照称重。
[0092]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

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