一种利用微生物共生发酵技术高产短链脂肪酸的方法与流程

[0001]
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种利用微生物共生发酵技术高产短链脂肪酸的方法。


背景技术：

[0002]
短链脂肪酸(short-chain fatty acids，scfas)，也称挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，vfa)，为1～6个碳原子的有机羧酸，是不能被小肠消化吸收的碳水化合物(寡糖、非淀粉多糖、抗性淀粉等)进入大肠后，被细菌发酵产生的终末产物，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸，其中，90％～95％的scfas为乙酸、丙酸和丁酸。
[0003]
短链脂肪酸是肠道微生物发酵产物，其对机体健康的影响已被广泛研究：
①
scfas能提高肠道消化吸收能力，促进肠道发育，维护肠道屏障功能；
②
肠道不仅对营养物质的消化吸收至关重要，而且还是机体巨大的免疫器官，scfas通过多种途径调节肠道的免疫功能；
③
scfas可以调节肠道微生物菌群结构，肠道菌群的稳定对机体维持正常的生理水平有着重要的意义；
④
大量研究表明，短链脂肪酸还可调节机体代谢健康。
[0004]
中国专利文献cn108384816a(申请号cn201810125553.8)公开了短链脂肪酸及利用污泥厌氧发酵生成短链脂肪酸的方法，主要是利用污泥进行厌氧发酵后期投加甲烷抑制剂并搅拌混合，且在反应器周围施加磁场以生成短链脂肪酸。中国专利文献cn104498541a(申请号cn201410841735.7)公开了利用餐厨垃圾生产短链挥发性脂肪酸的方法及短链挥发性脂肪酸，主要是以餐厨垃圾为发酵底物，以污泥为接种物进行搅拌混匀得到发酵基质；向发酵基质中添加烷基多苷，搅拌条件下进行厌氧发酵，生产短链挥发性脂肪酸。以上方法制备的短链脂肪酸，为化工物料，主要用于生物脱氮除磷的外加碳源，提高脱氮除磷的效率，难以在食品及医药领域应用。短链脂肪酸作为肠道微生物的代谢产物，对维持机体健康有重要意义，在食品、医药领域应用前景广阔，综合考虑短链脂肪酸的产量及安全性的基础上，高产短链脂肪酸的制备方案、生产工艺等都需要进一步研究。


技术实现要素：

[0005]
为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用微生物共生发酵技术高产短链脂肪酸的方法，本发明的方法科学合理、可操作性强、易实现规模化生产，短链脂肪酸的产量高，制备的短链脂肪酸可应用于食品、医疗等健康领域。
[0006]
本发明的技术方案如下：
[0007]
一种利用微生物共生发酵技术高产短链脂肪酸的方法，包括步骤如下：
[0008]
(1)发酵浆培养基的制备：以菊芋浆、海藻粉和谷氨酸钠为原料制备发酵浆培养基，将菊芋浆、海藻粉和谷氨酸钠分散于水中，均质混合，调节ph为6-8，高温灭菌后得到发酵浆培养基；
[0009]
(2)接种：以酵母菌、双歧杆菌和瘤胃球菌为共生发酵菌株，将酵母菌、双歧杆菌和瘤胃球菌活化后接入步骤(1)制备的发酵浆培养基，于发酵罐中进行厌氧发酵；
[0010]
(3)发酵：将发酵温度保持在26-29℃进行第一次发酵，发酵时间0.5-2h；第一次发酵结束后将发酵温度升高至35-39℃进行第二次发酵，发酵时间4-6h，发酵结束后，冷却至8-11℃，得含有短链脂肪酸的发酵液。
[0011]
根据本发明优选的，步骤(1)中所述菊芋浆是将新鲜菊芋洗净晾干后打浆得到。
[0012]
根据本发明优选的，步骤(1)中所述海藻粉是将海藻洗净晾干后切块干燥至含水量为10％以下，磨粉至50～100目，过筛后得到。
[0013]
根据本发明优选的，步骤(1)中所述海藻为海带、裙带菜、紫菜、马尾藻、珊瑚藻中的一种或两种以上任意混合。
[0014]
根据本发明优选的，步骤(1)中所述发酵浆培养基中各组分的质量百分比为：菊芋浆10～40％，海藻粉2～10％，谷氨酸钠0.1～1％，余量水。
[0015]
根据本发明优选的，步骤(1)中所述均质是在15-30mpa的压力下均质3-10min。
[0016]
根据本发明优选的，步骤(1)中所述高温灭菌是在113-117℃保持5-20min。
[0017]
根据本发明优选的，步骤(2)中所述酵母菌为啤酒酵母或面包酵母。
[0018]
根据本发明优选的，步骤(2)中所述双歧杆菌为长双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌中的一种或两种以上任意混合。
[0019]
根据本发明优选的，步骤(2)中所述瘤胃球菌为布氏瘤胃球菌。
[0020]
根据本发明优选的，步骤(2)中所述共生发酵菌株的接种量为发酵浆培养基体积的5-15％，其中，接种的菌液中酵母菌、双歧杆菌和瘤胃球菌活化菌液的体积比为1:(1-2):(2-10)。
[0021]
在本发明中，酵母菌、双歧杆菌和瘤胃球菌均为现有菌种，可从市场购得，对酵母菌、双歧杆菌和瘤胃球菌的活化培养使其数量和活性满足接种要求的方式并不做具体限定，菌种说明书或现有技术中的常用的方式均可以采用。
[0022]
有益效果：
[0023]
1.本发明以菊芋浆、海藻粉和谷氨酸钠为发酵底物，其中菊芋块茎富含菊糖、粗纤维及多种矿物质和维生素，其中菊糖和粗纤维可作为发酵过程中的碳水化合物底物，矿物质和维生素为微生物的生长繁殖提供必要的营养物质；海藻富含海藻多糖及食物纤维，可为微生物发酵提供碳源，此外，海藻中丰富的无机元素，为发酵菌株提供良好的生产环境，避免由于营养物质单一，影响scfas的产量；谷氨酸钠在发酵过程中，可以被微生物的谷氨酸脱羧酶(gad)利用，发生脱羧反应，发酵产生的scfas和谷氨酸脱羧反应共同调节了发酵液的ph值，更好的促进微生物代谢产短链脂肪酸，实验表明谷氨酸钠可以显著提高乙酸、丙酸和丁酸的产量。本发明中乙酸的产量可以达到190～215mmol/l，丙酸的产量可以达到60～75mmol/l，丁酸的产量可以达到75～85mmol/l，其中丙酸的产量极显著增加。
[0024]
2.本发明利用微生物共生发酵技术高产短链脂肪酸，以酵母菌、双歧杆菌和瘤胃球菌为共生发酵菌株，由于不同的接种方式直接影响菌种的生长繁殖及物质代谢，进而影响发酵的过程及微生物共生发酵scfas的产量，根据酵母菌、双歧杆菌和瘤胃球菌在发酵浆培养基中的共生关系，严格控制接种比例；考虑到酵母菌是兼性厌氧菌、双歧杆菌和瘤胃球菌是厌氧菌，将发酵过程分步进行，首先是酵母菌增菌发酵，利用酵母菌对原料除氧，有效地改善了双歧杆菌生长迟滞的状况；第一次发酵产生少量乙醇，对瘤胃球菌有诱导活化作用，促进第二次发酵时瘤胃球菌对原料的利用，提高发酵效率，进而大大提升scfas产量。
[0025]
3.本发明中发酵浆培养基的ph作为共生发酵过程中最重要的非生物影响因子之一，不但影响共生发酵微生物的活性，还对其产生scfas的速率有较大影响。本发明严格控制发酵浆培养基的ph为6～8，另外在发酵过程中，添加的谷氨酸钠被微生物的谷氨酸脱羧酶(gad)利用，发生脱羧反应，发酵产生的scfas和谷氨酸脱羧反应共同调节了发酵液的ph值，共同提高scfas产量。
[0026]
4.本发明利用微生物共生发酵技术高产短链脂肪酸，以产量高、易获取的菊芋和海藻为原料，即以食品级物料作为发酵底物，利用多菌共生发酵技术，生产短链脂肪酸，和现有技术中利用碳水化合物组合物、纯纤维素制备短链脂肪酸的工艺相比，克服了现有制备短链脂肪酸成本高的缺点，并且操作简单，安全无毒，产量高，易规模化生产，具有较好经济效益，适用范围广，提供了制备短链脂肪酸的新原料和新方法。
附图说明
[0027]
图1是不同发酵液中scfas的含量；图中，**表示p＜0.01，与实施例2中乙酸相比差异极显著；*表示p＜0.05，与实施例2中乙酸相比差异显著；##表示p＜0.01，与实施例2中丙酸相比差异极显著；#表示p＜0.05，与实施例2中丙酸相比差异显著；
△△
表示p＜0.01，与实施例2中丁酸相比差异极显著，
△
表示p＜0.05，与实施例2中丁酸相比差异显著。
具体实施方式
[0028]
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0029]
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0030]
实施例中酵母菌、双歧杆菌和瘤胃球菌均为现有菌种，可从市场购得，对酵母菌、双歧杆菌和瘤胃球菌的活化培养使其数量和活性满足接种要求的方式并不做具体限定，菌种说明书或现有技术中的常用的方式均可以采用。
[0031]
实施例中的啤酒酵母(bio-52035)、青春双歧杆菌(bio-67246)和布氏瘤胃球菌(bio-80903)购自北京百欧博伟生物技术有限公司。
[0032]
实施例1
[0033]
一种利用微生物共生发酵技术高产短链脂肪酸的方法，包括步骤如下：
[0034]
1)菊芋预处理：将50kg新鲜菊芋洗净，待表面的水分自然晾干后，置入打浆机打浆，20hz打浆10min，得到菊芋浆；
[0035]
2)海藻预处理：将50kg海带洗净，待表面的水分自然晾干后，切成长2-5cm、宽2-5cm的块状，于鼓风干燥箱内(70℃)干燥至水分含量为10％，置于研磨机中磨粉至60目，过筛，得到海藻粉；
[0036]
3)发酵浆培养基的制备：取步骤1)制备的菊芋浆10kg、步骤2)制备的海藻粉2kg、谷氨酸钠0.1kg分散于87.9kg水中，混合，在20mpa的压力下均质8min，调节ph为6，在115℃保持15min杀菌，冷却后得到发酵浆培养基；
[0037]
4)接种：将活化后的啤酒酵母(bio-52035)、青春双歧杆菌(bio-67246)和布氏瘤胃球菌(bio-80903)依次接入步骤3)制备的发酵浆培养基中，接种总量为发酵浆培养基的
5％(v/v)，接种的菌液中酵母菌、双歧杆菌和瘤胃球菌活化菌液的体积比为1:1:2，于发酵罐中进行厌氧发酵；
[0038]
5)发酵：将发酵温度保持在28℃进行第一次发酵，发酵时间2h；第一次发酵结束后将发酵温度升高至37℃进行第二次发酵，发酵时间4h，发酵结束后，冷却至8-11℃，得含有短链脂肪酸的发酵液。
[0039]
实施例2
[0040]
一种利用微生物共生发酵技术高产短链脂肪酸的方法，包括步骤如下：
[0041]
1)菊芋预处理：将50kg新鲜菊芋洗净，待表面的水分自然晾干后，置入打浆机打浆，20hz打浆10min，得到菊芋浆；
[0042]
2)海藻预处理：将50kg海带洗净，待表面的水分自然晾干后，切成长2-5cm、宽2-5cm的块状，于鼓风干燥箱内(70℃)干燥至水分含量为10％，置于研磨机中磨粉至60目，过筛，得到海藻粉；
[0043]
3)发酵浆培养基的制备：取步骤1)制备的菊芋浆20kg、步骤2)制备的海藻粉5kg、谷氨酸钠0.5kg分散于74.5kg水中，混合，在20mpa的压力下均质8min，调节ph为7，在115℃保持15min杀菌，冷却后得到发酵浆培养基；
[0044]
4)接种：将活化后的啤酒酵母(bio-52035)、青春双歧杆菌(bio-67246)和布氏瘤胃球菌(bio-80903)依次接入步骤3)制备的发酵浆培养基中，接种总量为发酵浆培养基的10％(v/v)，接种的菌液中酵母菌、双歧杆菌和瘤胃球菌活化菌液的体积比为1:1:5，于发酵罐中进行厌氧发酵；
[0045]
5)发酵：将发酵温度保持在28℃进行第一次发酵，发酵时间1h；第一次发酵结束后将发酵温度升高至37℃进行第二次发酵，发酵时间5h，发酵结束后，冷却至8-11℃，得含有短链脂肪酸的发酵液。
[0046]
实施例3
[0047]
一种利用微生物共生发酵技术高产短链脂肪酸的方法，包括步骤如下：
[0048]
1)菊芋预处理：将50kg新鲜菊芋洗净，待表面的水分自然晾干后，置入打浆机打浆，20hz打浆10min，得到菊芋浆；
[0049]
2)海藻预处理：将50kg海带洗净，待表面的水分自然晾干后，切成长2-5cm、宽2-5cm的块状，于鼓风干燥箱内(70℃)干燥至水分含量为10％，置于研磨机中磨粉至60目，过筛，得到海藻粉；
[0050]
3)发酵浆培养基的制备：取步骤1)制备的菊芋浆40kg、步骤2)制备的海藻粉10kg、谷氨酸钠1kg分散于49kg水中，混合，在20mpa的压力下均质8min，调节ph为8，在115℃保持15min杀菌，冷却后得到发酵浆培养基；
[0051]
4)接种：将活化后的啤酒酵母(bio-52035)、青春双歧杆菌(bio-67246)和布氏瘤胃球菌(bio-80903)依次接入步骤3)制备的发酵浆培养基中，接种总量为发酵浆培养基的5％(v/v)，接种的菌液中酵母菌、双歧杆菌和瘤胃球菌活化菌液的体积比为1:2:10，于发酵罐中进行厌氧发酵；
[0052]
5)发酵：将发酵温度保持在28℃进行第一次发酵，发酵时间2h；第一次发酵结束后将发酵温度升高至37℃进行第二次发酵，发酵时间6h，发酵结束后，冷却至8-11℃，得含有短链脂肪酸的发酵液。
[0053]
对比例1
[0054]
按照实施例2所述的方法制备短链脂肪酸，不同之处在于，步骤3)中，调节ph为5，其他处理方式均与实施例2相同。
[0055]
对比例2
[0056]
按照实施例2所述的方法制备短链脂肪酸，不同之处在于，步骤3)中，调节ph为9，其他处理方式均与实施例2相同。
[0057]
对比例3
[0058]
按照实施例2所述的方法制备短链脂肪酸，不同之处在于，步骤3)中，发酵浆培养基的制备不添加谷氨酸钠，其他处理方式均与实施例2相同。
[0059]
对比例4
[0060]
按照实施例2所述的方法制备短链脂肪酸，不同之处在于，步骤4)中，接种的微生物只有布氏瘤胃球菌(bio-80903)，其他处理方式均与实施例2相同。
[0061]
对比例5
[0062]
按照实施例2所述的方法制备短链脂肪酸，不同之处在于，步骤5)中，发酵不采用分步发酵，而是直接将发酵罐的温度保持在37℃，发酵6.5h，其他处理方式均与实施例2相同。
[0063]
实验例
[0064]
将实施例1-3和对比例1-5发酵结束后的发酵液进行scfas的检测，其步骤如下：
[0065]
发酵结束后，将发酵液于4℃，6500rpm离心20min，取上清液于0.22μm滤膜进行过滤，再用无菌水将滤液稀释10倍，采用agilent technologies 7890a气相色谱仪对上清液中的短链脂肪酸进行检测，色谱条件：色谱柱：da-ffap(30m
×
0.25mm，0.25μm)；升温程序：初始柱温100℃，保持1min，以3℃/min的速度升至130℃，保持1min，再以20℃/min的速度升至200℃，在200℃保持10min。fid和进样口温度：分别为230、230℃。载气：氮气。气体体积流量：氢气、空气和氮气分别以30、300、20ml/min流动比率混合。进样：自动进样，进样量为1μl；运行时间25min，结果如图1所示。
[0066]
由图1可以看出，实施例1-3发酵结束后的发酵液中scfas含量均无显著差异(p＞0.05)，其中，实施例1发酵液中乙酸、丙酸、丁酸的含量分别为211.32mmol/l、64.68mmol/l、76.70mmol/l，实施例2发酵液中乙酸、丙酸、丁酸的含量分别为195.04mmol/l、73.76mmol/l、76.86mmol/l，实施例3发酵液中乙酸、丙酸、丁酸的含量分别为193.84mmol/l、69.35mmol/l、80.48mmol/l；与实施例2相比，对比例1、2发酵结束后的发酵液中乙酸、丙酸和丁酸含量均有极显著差异(p＜0.01)；对比例3中乙酸和丁酸有显著差异(p＜0.05)，丙酸有极显著差异(p＜0.01)；对比例4中乙酸有显著差异(p＜0.05)，丙酸和丁酸有极显著差异(p＜0.01)；对比例5中乙酸和丙酸有极显著差异(p＜0.01)，丁酸有显著差异(p＜0.05)；戊酸和己酸在各对比例中均无显著差异(p＞0.05)。结果表明，本发明通过对发酵培养基、共生发酵菌株和发酵方法的调整与优化，得到本发明的生产方法，利用本发明的微生物共生发酵技术可以高产短链脂肪酸，在食品、医药领域有广阔应用前景。

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